CN116768985B - 一种有效纯化病毒样颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种有效纯化病毒样颗粒的方法。本发明所提供的方法重点包括两步，其中一步是采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析，另一步是采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2‑8倍的大孔阴离子层析介质进行层析。通过本发明中方法可以有效去除常规吸附洗脱层析中难以去除干净的与目的蛋白等电点接近、携带电荷量相近的小分子宿主蛋白、酶、核酸、VP1单体、VP1截短蛋白，减少最终产品中杂质的含量。且本发明还可以去除带负电量强于目的蛋白病毒样颗粒的大部分杂质，明显提高后续层析对目的蛋白病毒样颗粒的载量。本发明方法具有成本低、杂质载量高、样品处理量大的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种有效纯化病毒样颗粒的方法。
背景技术
在生物医药领域，细胞培养或酵母表达重组病毒样颗粒，通常是由单体或多聚体蛋白自发组装形成的类病毒颗粒。与目的蛋白病毒样颗粒有着接近电荷的VP1单体、VP1单体截短蛋白、宿主蛋白、酶及核酸等，这些杂质通过传统的吸附洗脱模式可以有效去除。但是当强吸附杂质的含量较多时，会明显降低目的蛋白病毒样颗粒的载量，使目的蛋白收集主峰中，往往掺杂着与病毒样颗粒目的蛋白电荷性质接近的多种杂质，最终仍有一些杂质需要更多步层析才可以完全去除。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效纯化病毒样颗粒的方法，以去除预处理样品中的大部分与目的蛋白性质接近的杂质，增加后续层析的载量。
本发明是这样实现的：一种有效纯化病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：
a、将菌体或细胞破碎，通过过滤、离心、沉淀复溶对样品进行粗纯预处理；
b、将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径；
c、将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1-2.5个pH；
d、采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析；
e、采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2-8倍的大孔阴离子层析介质进行层析；
f、通过分子筛层析去除大颗粒聚体；
g、通过透析或超滤换盐，将目的蛋白的缓冲液置换到适合长期储存的稳定体系。
优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液或柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液。
优选的，所述小孔阴离子层析介质其基体可以是Sepharose HP(平均孔径35.5nm)，Bestarose HP(平均孔径33nm)，Sephacryl S-400HR(平均孔径31nm)，Source 30(平均孔径30nm)，Sepharose 6FF(平均孔径29nm)，Sepharose FF(平均孔径26nm)，Bestarose FF(平均孔径25.8nm)，Sepharose XL(平均孔径17nm)或Sephacryl S-300HR(平均孔径13nm)等对生物蛋白作用温和的小孔基体，所用配基为二乙氨乙基、季铵乙基或季氨基配基系列中的任意一种。
更优选的，所述小孔阴离子层析介质其基体是Source 30或Sepharose XL；所用配基为季氨基(Q)。
优选的，所述大孔阴离子层析介质其基体为DEAE-AP-280(平均孔径280nm)、Nuvia(平均孔径150nm)、Nuvia HP(平均孔径200nm)、DEAE-AP-120(平均孔径120nm)或POROS(平均孔径100nm)等对生物蛋白作用温和的大孔基体，所用配基为二乙氨乙基、季铵乙基或季氨基配基系列中的任意一种。
更优选的，所述大孔阴离子层析介质其基体为DEAE-AP-120、DEAE-AP-280或POROS，所用配基为季氨基(Q)。
本发明的有益效果：
1)本发明方法具有成本低、杂质载量高、样品处理量大的特点。
2)本发明可以有效去除常规吸附洗脱层析中难以去除干净的与目的蛋白等电点接近、携带电荷量相近的小分子宿主蛋白、酶、核酸、VP1单体、VP1截短蛋白，减少最终产品中杂质的含量。
3)这种新型方法可以大载量去除带负电量强于目的蛋白病毒样颗粒的大部分杂质，明显提高后续层析对目的蛋白病毒样颗粒的载量。
本发明为需要纯化病毒样颗粒疫苗的科研、制药、生物制品企业，在设计纯化工艺时，提供一种载量高、成本低、可以有效去除与目的蛋白电荷接近的核酸、宿主蛋白、VP1单体、VP1截短蛋白等杂质的有效方法。
附图说明
图1是本发明实施例1中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
图2是本发明实施例1中小孔阴离子层析的结果示意图。
图3是本发明实施例1中大孔阴离子层析的结果示意图。
图4是本发明实施例1中分子筛层析的结果示意图。
图5是本发明对比例1中大孔阴离子层析的结果示意图。
图6是本发明对比例1中分子筛层析的结果示意图。
图7是本发明实施例2中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
图8是本发明实施例2中小孔阴离子层析的结果示意图。
图9是本发明实施例2中大孔阴离子层析的结果示意图。
图10是本发明实施例2中分子筛层析的结果示意图。
图11是本发明实施例3中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
图12是本发明实施例3中小孔阴离子层析的结果示意图。
图13是本发明实施例3中大孔阴离子层析的结果示意图。
图14是本发明实施例3中分子筛层析的结果示意图。
具体实施方式
本发明的方法具体包括如下步骤：
1)将菌体或细胞破碎，通过过滤、离心、沉淀复溶对样品进行粗纯预处理。
2)将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径。具体是：通过透射电镜软件，计算完整病毒样颗粒的平均直径。
本发明所提供的方法重点分两步，其中一步是采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析(下面实施例中将该过程简称为小孔阴离子层析)，另一步是采用内部孔径为病毒样颗粒直径2-8倍的大孔阴离子层析介质进行层析(下面实施例中将该过程简称为大孔阴离子层析)。下面进行详细介绍。
3)选择内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的强阴离子层析介质，根据粗纯预处理后样品的体积和浓度，装填相应体积的层析柱，装填柱体积为样品量的1/50—1/5，作为新型层析方法的小孔阴离子层析柱备用。同样，装填大孔阴离子层析柱备用。
4)将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1-2.5个pH。所用的缓冲液可以为磷酸盐缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液体系或柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液。
5)将预处理后的样品上样内部孔径比病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质装填的层析柱。层析系统检测流通池与紫外分光光度经尺寸换算到对应数值，当流穿峰明显增高，即A280检测值达到上样A280检测值的1/4以上时，开始收集，每2个柱体积分段收集，分别检测收集样品电泳杂质含量，当电泳杂质含量明显增高，即杂质总含量超过20％时，达到最大载量。
本发明将所选用的内部孔径比病毒样颗粒直径小的阴离子层析介质称为小孔阴离子层析介质，小孔阴离子层析介质基体可以是Sepharose HP(平均孔径35.5nm)、Bestarose HP(平均孔径33nm)、Sephacryl S-400HR(平均孔径31nm)、Source 30(平均孔径30nm)、Sepharose6FF(平均孔径29nm)、Sepharose FF(平均孔径26nm)、Bestarose FF(平均孔径25.8nm)、Sepharose XL(平均孔径17nm)或Sephacryl S-300HR(平均孔径13nm)等对生物蛋白作用温和的小孔基体，所用配基可以是二乙氨乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)或季氨基(Q)配基等系列。
在上样过程中，病毒样颗粒经层析的小孔阴离子层析介质时，只能和介质颗粒表面的最外层配基结合；小分子的核酸、宿主蛋白、VP1单体、VP1截短蛋白等既可以和介质表面配基结合，也可以与介质内部孔隙中的配基结合。当介质表面配基位点占满后，目的蛋白病毒样颗粒开始流穿，与目的蛋白病毒样颗粒等电点接近、携带电荷量相接近的一些小分子的VP1单体、VP1截短蛋白、核酸、宿主蛋白等杂质，虽然它们带电性质与目的蛋白病毒样颗粒接近，但仍然可以进入介质内部孔隙，继续被内部孔隙中未满载的配基所捕获，大颗粒的病毒样颗粒无法进入内部孔隙，从外水流穿出层析柱。这些与目的蛋白带电接近的杂质在以往吸附洗脱模式中难以去除，会随着洗脱收集，再次被混入目的收集，而在本发明方法中就可以绝大部分去除。带负电量强于目蛋白病毒样颗粒的强吸附核酸、宿主蛋白、酶等杂质，也一同被内部孔隙的配基吸附后去除，这些会与目的蛋白病毒样颗粒强竞争吸附的杂质得以去除，也极大减轻了后续吸附洗脱模式的纯化压力，相应增加了后续吸附洗脱模式层析对病毒样颗粒的载量。流穿出的目的蛋白是纯度很高的目的蛋白。
6)经历过小孔阴离子层析后，本步骤进行大孔阴离子层析。所谓大孔阴离子层析即是使所收集样品再经过一个内部孔径为病毒样颗粒直径2-8倍的大孔阴离子层析介质装填的层析柱。本发明中将内部孔径为病毒样颗粒直径2-8倍的阴离子介质称为大孔阴离子层析介质。本发明所选用的大孔阴离子层析介质，介质基体可以是DEAE-AP-280(平均孔径280nm)、Nuvia(平均孔径150nm)、Nuvia HP(平均孔径200nm)、DEAE-AP-120(平均孔径120nm)或POROS(平均孔径100nm)等对生物蛋白作用温的大孔介质系列，所用配基可以是二乙氨乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)或季氨基(Q)配基等系列。本步骤层析过程中使目的蛋白病毒样颗粒大载量吸附到层析介质内部及表面，使带电少、带正电杂质在流穿液中去除，通过阶段洗脱进一步洗涤去除吸附在介质上吸附力较弱的杂质，再通过阶段洗脱或连续梯度洗脱，收集目的蛋白，宿主蛋白、酶、核酸、VP1单体、VP1截短蛋白等杂质已经接近全部去除，且目的蛋白样品得到有效浓缩。
7)通过分子筛层析，去除大颗粒聚体。
8)通过透析或超滤换盐，将目的蛋白的缓冲液置换到适合长期储存的稳定体系。
下面通过具体例子对本发明方法进行详细介绍。
实施例1
如图1所示，诺如病毒样颗粒酵母表达菌体的粗纯样品，经透射电镜检测，平均粒径为45nm。选择孔径比病毒样颗粒小的阴离子层析介质Source 30Q进行流穿模式层析，选择孔径约病毒样颗粒大3倍的DEAE-AP-120进行吸附洗脱模式层析。
取诺如病毒样颗粒酵母表达菌体96g，菌体破碎，通过粗纯预处理后，使用本发明方法纯化样品。下面表1给出了小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图2。采用层析介质Source 30Q收集流穿。
表1实施例1中小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
结合表1和图2可知，经过小孔阴离子层析后，纯度由上样前73.2％提高到90.2％，明显减少了后续所需纯化杂质，降低了后续层析纯化压力。
接下来，将经小孔阴离子层析后收集的样品再次上样大孔阴离子(DEAE-AP-120)层析。下面表2给出了大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图3。
表2实施例1中大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
由表2及图3可知，通过大孔阴离子层析，进一步去除了吸附力较弱的核酸杂质，并使样品得到浓缩。
之后，将经大孔阴离子层析后收集的样品上样分子筛层析。下面表3给出了分子筛层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图4。
表3实施例1中分子筛层析的工艺参数及收集结果
由表3及图4可知，经过本发明中的纯化方法，样品纯度由89.1％提升至99.2％，总产率为1.77mg/g菌体，总回收率为29％。
下面表4给出了本发明实施例1中样品层析纯化结果。
表4实施例1中样品层析纯化结果
由表4可知，通过本发明这种新型层析方法纯化预处理样品后，杂质去除明显，且大部分宿主蛋白在这种方法下得以去除，经过后期精纯，原液目的蛋白电泳纯度达到99.2％，HPLC纯度达到98.9％，宿主蛋白和宿主DNA残留量很少，达到控制标准。
对比例1
本对比例的方法与实施例1相比，没有小孔阴离子层析，直接上样进行大孔阴离子(DEAE-AP-120)吸附洗脱层析。下面表5给出了本对比例中大孔阴离子吸附洗脱层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图5。
表5对比例1中大孔阴离子吸附洗脱层析的工艺参数及收集结果
由表5及图5可以看出，复溶上清液不经过小孔阴离子层析，直接上样大孔阴离子采用吸附洗脱，离子收集纯度由65.6％提高到74.1％，但仍然还有部分杂质未去除。
将经大孔阴离子层析后收集的样品上样分子筛层析(Sepharose CL-6B)。下面表6给出了分子筛层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图6。
表6对比例1中分子筛层析的工艺参数及收集结果
由表6及图6可以看出，最终分子筛收集纯度89.6％，在落峰峰尾可以看出有较明显的杂质及拖尾，最终产率为1mg/g菌。
由实施例1和对比例1相比可以发现，实施例1中由于增加了小孔阴离子层析方法，因此工艺效果更好。本发明新型方法的使用，使得最终纯度99.2％明显提高于初始89.6％，总回收率29％比19％明显提高，产率2.4mg/g菌也相对于1个mg/g菌产率提高，使用这种新型层析方法后，后续的离子层析处理量由0.2g菌/mL介质提高到1.97g菌/mL介质，且各检测质量均达到中国药典标准。
实施例2
如图7所示，取发酵菌体的粗纯样品，经过透射电镜检测，平均粒径为50nm。选择孔径比病毒样颗粒小的阴离子层析介质Source 30Q进行流穿模式层析，选择孔径比病毒样颗粒大5倍的DEAE-AP-280进行吸附洗脱模式层析。
取发酵菌体40.48g，菌体破碎，通过粗纯预处理后，使用本发明新型方法纯化样品，层析柱体积24mL，上样小孔阴离子层析(Source 30Q)收集流穿。下面表7给出了小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图8。
表7实施例2中小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
由表7和图8可知，本实施例中通过小孔阴离子流穿方法，目的蛋白纯度由复溶上清22.4％提高至91.3％。
将小孔阴离子流穿收集得到的样品上样大孔阴离子吸附洗脱(DEAE-AP-280)。下面表8给出了大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图9。
表8实施例2中大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
由表8和图9可以看出，经过大孔阴离子吸附洗脱模式进一步去除低吸附杂质，并对样品起到浓缩作用，纯度由91％提高至92.1％。
将经大孔阴离子层析后收集的样品进一步上样分子筛层析(Sepharose CL-4B)。下面表9给出了分子筛层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图10。
表9实施例2中分子筛层析的工艺参数及收集结果
由表9和图10可以看出，经分子筛纯化最终纯度达到99.5％。
下面表10给出了本发明实施例2中样品层析纯化结果。
表10实施例2中样品层析纯化结果
由表10可知，通过本发明新型方法纯化预处理样品后，前后对比，杂质去除明显，且大部分宿主蛋白在这种方法下得以去除，经过后期精纯，原液目的蛋白电泳纯度达到99.5％，HPLC纯度达到99.5％，宿主蛋白和宿主DNA残留量很少，达到药典要求。
实施例3
由图11可知，发酵菌体的粗纯样品，经过透射电镜检测，平均粒径为22nm。选择孔径比病毒样颗粒小的阴离子层析介质Q Sepharose XL进行流穿模式层析，选择孔径比病毒样颗粒大4倍的POROS XQ进行吸附洗脱模式层析。
取发酵菌体24g，菌体破碎，通过粗纯预处理后，使用本发明新型方法纯化样品，介质柱体积24mL。上样阴离子层析采用Q Sepharose XL收集流穿。下面表11给出了小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图12。
表11实施例3中小孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
由表11和图12可知，本实施例通过小孔阴离子流穿层析，复溶上清目的蛋白纯度由59.1％提升到85.8％。
将小孔阴离子流穿收集得到的样品上样大孔阴离子吸附洗脱层析。下面表12给出了大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图13。
表12实施例3中大孔阴离子层析的工艺参数及收集结果
由表12和图13可以看出，经过大孔阴离子吸附洗脱，进一步去除杂质，将纯度由85.8％提高至87.6％，并使目的蛋白得到浓缩。
将上一步收集的样品进行上样分子筛层析(Sepharose CL-6B)。下面表13给出了分子筛层析的工艺参数及收集结果，相关图示见图14。
表13实施例3中分子筛层析的工艺参数及收集结果
由表13和图14可知，经过分子筛，纯度由87.6％提高至98.7％，最终产率23mg/g菌体，总回收率61％。
下面表14给出了本发明实施例3中样品层析纯化结果。
表14实施例3中样品层析纯化结果
由表14可以看出，通过本发明这种新型层析方法纯化预处理样品后，前后对比，杂质去除明显，且大部分宿主蛋白在这种方法下得以去除，经过后期精纯，原液目的蛋白电泳纯度达到98.7％，HPLC纯度达到99.5％，宿主蛋白和宿主DNA残留量很少，达到药典要求。
Claims (3)
1.一种纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，包括如下步骤：
a、对样品进行粗纯预处理；样品为诺如病毒样颗粒；
b、将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径；
c、将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1-2.5个pH；
d、采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行流穿模式层析；
e、采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2-8倍的大孔阴离子层析介质进行吸附洗脱模式层析；
f、对步骤e中收集的层析液进行分子筛层析；
g、对分子筛层析后收集的层析液进行透析或超滤换盐，将目的蛋白的缓冲液置换到适合储存的稳定体系；
步骤c中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl 缓冲液；
步骤d中所述小孔阴离子层析介质其基体是Source 30或Sepharose XL，所用配基为季氨基；
步骤e中所述大孔阴离子层析介质其基体为DEAE-AP-280、DEAE-AP-120或POROS基体中的任意一种，所用配基为季氨基。
2.根据权利要求1所述的纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，步骤a中，对样品进行粗纯预处理，具体是：将样品破碎，之后过滤、离心、沉淀复溶。
3.根据权利要求1所述的纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，步骤b中检测所需纯化的病毒样颗粒的直径，具体是：计算完整病毒样颗粒的平均直径。
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