CN115948351B - 一种分离纯化cvb1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CVB1的分离纯化方法，具体地，本发明涉及使用肝素亲和介质纯化CVB1病毒的方法。

Description

一种分离纯化CVB1的方法

技术领域

本发明涉及CVB1的分离纯化方法，具体地，本发明涉及使用肝素亲和介质纯化CVB1的方法。

背景技术

肠道病毒隶属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒是直径大小约为30nm的正二十面体结构，从外到内依次为病毒衣壳和病毒核酸。肠道病毒主要包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒以及新型肠道病毒。根据对乳鼠的致病性特点，柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)可分为A、B两组，A组包含23个血清型，B组有6个血清型。

柯萨奇病毒B1型(Coxsackievirus B1,CVB1)是一类常见的人类病原体，易感人群为婴幼儿，主要临床症状表现为发热、头痛、腹泻等一般感冒症状，偶发无菌性脑膜炎、心肌炎、肝炎、胰腺炎和手足口病等重症疾病，CVB1感染后的死亡率较低。

因CVB1基因组较小，可以穿透血脑屏障，同时成年人感染后引起的症状轻微等特点，作为溶瘤病毒药物具有独特的优势和较大的潜力。将CVB1开发成疫苗或治疗性药物，对纯化制备工艺有着较高的要求。首先，纯化工艺需要有效去除相关杂质，包括宿主蛋白、宿主核酸以及工艺过程添加物，如消泡剂、核酸酶等，并且，病毒的分离纯化工艺还应稳健、重复性良好，并适合商业化放大生产等。

目前关于柯萨奇病毒的分离纯化方法的文献资料报道相对较少。在这些研究中，为了获得较高纯度的柯萨奇病毒，通常采用超速离心、密度梯度离心等纯化方法，然而此类方法处理的样品量少、通量低、操作时间长，且存在病毒纯度和回收率较低等问题。

发明内容

本申请发明人经过大量研究，开发了一种基于肝素亲和介质的CVB1纯化方法，所述方法的CVB1感染滴度回收率高，杂质去除效果优异，且对初始待纯化样品要求低，纯化工艺简单，可用于大规模制备CVB1完整颗粒，且产量和纯度满足产业化要求。

因此，本申请提供了一种纯化样品中CVB1(柯萨奇病毒B1型)的方法，其包括将所述样品与肝素亲和介质相接触的步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括对样品进行肝素亲和层析。

在某些实施方案中，所述肝素亲和层析填料使用的配基为肝素或肝素模拟物，例如Capto Heparin层析填料、-65Heparin层析填料或Cellufine^TM Sulfate层析填料。

在某些实施方案中，所述Capto Heparin层析填料包括但不限于购自Cytiva的Capto Heparin层析填料。

在某些实施方案中，所述-65Heparin层析填料包括但不限于购自苏州纳微的/>-65Heparin层析填料。

在某些实施方案中，所述Cellufine^TM Sulfate层析填料包括但不限于购自JNC株式会社的Cellufine^TM Sulfate层析填料。

在某些实施方案中，所述肝素亲和层析包括以下步骤：

(4)在第一溶液中，使所述样品中的CVB1与肝素亲和层析介质结合形成复合物；

(5)在第二溶液中，使所述复合物解离；和，

(6)收集含有CVB1的解离产物。

在某些实施方案中，所述第一溶液的电导与所述样品的电导相近，例如所述第一溶液的电导为10～15mS/cm；和/或，所述第二溶液的电导为30～50mS/cm，例如，所述第二溶液含300～500mM的NaCl。

在某些实施方案中，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值与所述样品的pH值相近，例如，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值为6.5～8.0。

在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导和/或pH值的步骤。

在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～15mS/cm，和/或，调节所述样品的pH值至6.5～8.0。

在某些实施方案中，所述第一溶液的电导及所述样品的电导均为10～15mS/cm。

在某些实施方案中，所述第一溶液的pH值及所述样品的pH值均为6.5～8.0。

在某些实施方案中，所述第一溶液的pH值、所述第二溶液的pH值及所述样品的pH值均为6.5～8.0。

在某些实施方案中，步骤(1)中，所述肝素亲和层析的上样量为10～20个柱体积。

在某些实施方案中，所述肝素亲和层析的保留时间为10～30min。

尽管本领域已有将肝素亲和层析用于部分病毒的纯化的案例，但基于不同病毒结构的多样性，不同的病毒能否与肝素结合或者与肝素结合的特性(例如，亲和力、特异性等)千差万别。例如，本领域已明确公开野生型CVB3(柯萨奇病毒B3型)不与肝素结合，而本申请发明人则首次实现了将肝素亲和层析用于CVB1(柯萨奇病毒B1型)的分离纯化，且纯化效果显著。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。

在某些实施方案中，所述方法在所述肝素亲和层析之后进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。

在某些实施方案中，所述吸附层析的层析介质能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)。

在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为分子筛与阴离子交换相结合的多模式复合层析介质，例如Capto Core400或Capto Core700层析介质。

在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)的分子排阻层析介质。

在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为Capto Core400层析介质。

在某些实施方案中，所述复合层析包括以下步骤：

(I)使平衡缓冲液通过所述复合层析介质；

(II)使含CVB1的样品通过所述复合层析介质；

(II)使顶洗缓冲液通过所述复合层析介质。

在某些实施方案中，步骤(II)中，所述样品的上样量为5～20个柱体积。

在某些实施方案中，所述复合层析的保留时间为1～10min。

在某些实施方案中，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导与步骤(II)中的样品的电导相近，例如，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导为10～20mS/cm。

在某些实施方案中，步骤(II)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～20mS/cm。

在某些实施方案中，所述平衡缓冲液的电导及所述顶洗缓冲液的电导均为10～20mS/cm。

在某些实施方案中，所述平衡缓冲液的电导、所述顶洗缓冲液的电导及所述样品的电导均为10～20mS/cm。

在某些实施方案中，所述平衡缓冲液与所述顶洗缓冲液相同或相近。

在某些实施方案中，所述复合层析的层析柱的柱高为10～30cm。

在某些实施方案中，所述样品中的CVB1以游离的形式存在(例如，存在于细胞培养物上清中)或存在于细胞内。

在某些实施方案中，所述样品中的CVB1全部或部分存在于细胞内。

在某些实施方案中，所述样品为含有宿主细胞成分的病毒培养物，并且，所述方法在进行层析之前还包括对样品进行预处理，所述预处理包括裂解细胞释放CVB1的步骤。

在某些实施方案中，所述预处理包括步骤：

(i)裂解细胞释放CVB1；以及，

(ii)去除或减少细胞裂解产物中的细胞碎片和/或颗粒物。

在某些实施方案中，步骤(i)中，所述方法通过使用细胞裂解液裂解细胞释放CVB1。

在某些实施方案中，所述细胞裂解液包含表面活性剂。

在某些实施方案中，所述表面活性剂包含Tween-20、Tween-80、或其组合。

在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.25％～1％(m/v)。

在某些实施方案中，所述细胞裂解液包含0.25％～1％(m/v)的Tween-20、Tween-80、或其组合。

在某些实施方案中，所述方法通过在25～37℃的温度下，使用所述细胞裂解液裂解细胞1～4h。

在某些实施方案中，在步骤(i)中或者在步骤(i)之后，所述预处理还包括去除或减少宿主细胞核酸的步骤。

在某些实施方案中，所述方法通过使用核酸酶去除或减少宿主细胞核酸。

在某些实施方案中，所述方法通过在细胞裂解液中添加核酸酶或者在细胞裂解产物中添加核酸酶去除或减少宿主细胞核酸。

在某些实施方案中，核酸酶酶解体系中，所述核酸酶的浓度为20～100U/ml。

在某些实施方案中，核酸酶酶解体系中还包含镁离子。

在某些实施方案中，核酸酶酶解体系中镁离子的浓度为1～2mM。

在某些实施方案中，所述方法通过(a)在25～37℃的温度下使用核酸酶酶解1～4h，或者，(b)在2～8℃的温度下使用核酸酶酶解4～24h以去除或减少宿主细胞核酸。

在某些实施方案中，步骤(ii)中，所述方法通过过滤去除细胞裂解产物中的细胞碎片和/或颗粒物。

在某些实施方案中，所述过滤为单级过滤或多级过滤。

在某些实施方案中，所述过滤步骤用的过滤器为深层过滤器(例如，0.04～9μm深层过滤器)或两级囊式过滤器(例如，5μm+0.65μm两级囊式过滤器)。

在某些实施方案中，所述预处理还包括步骤(iii)：去除或减少步骤(ii)的产物中的小分子(例如，分子量小于300KDa的分子)。

在某些实施方案中，步骤(iii)中，所述方法通过使用超滤系统对步骤(ii)的产物进行超滤置换以去除或减少其中的小分子(例如，分子量小于300KDa的分子)，并对所述产物进行浓缩。

在某些实施方案中，所述超滤系统含有中空纤维或超滤膜包。

在某些实施方案中，所述超滤系统的截留分子量为50～300KDa(例如，50KDa，70KDa，100KDa，300KDa)。

在某些实施方案中，进行超滤时使用的替洗液为醋酸钠、组氨酸、磷酸钠或Tris缓冲液。

在某些实施方案中，所述替洗液的pH值为6～9。

在某些实施方案中，所述替洗液电导为8～20mS/cm。

在某些实施方案中，所述替洗液含有80～200mmol/L NaCl。

在某些实施方案中，所述浓缩的浓缩倍数为2～10倍。

在某些实施方案中，所述预处理不包括步骤(iii)：去除或减少步骤(ii)的产物中的小分子(例如，分子量小于300KDa的分子)。

在某些实施方案中，所述方法包括直接对步骤(ii)的产物进行层析。

在某些实施方案中，所述方法在对步骤(ii)的产物进行层析之前，还包括调节所述步骤(ii)的产物的电导和/或pH值。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。

如本文所使用的，术语“肝素亲和介质”是指以肝素分子或肝素模拟物作为目标分子的配基的亲和介质，其适用于与肝素分子或肝素模拟物有特异性结合的目标分子的分离和纯化。通常情况下，为便于目标分子的分离纯化，所述肝素分子或肝素模拟物被固定于固相载体(或基质)上，常用的载体(或基质)为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃珠、葡聚糖凝胶、纤维素等。

如本文所使用的，术语“层析”指一种分离技术，其采用流动相和固定相以将样品中的一种类型的分子(例如CVB1颗粒)与其它分子(例如杂质)分开。液体流动相为包含待分离的特定类型的分子和其他分子的混合物。通过流动相将待分离的特定类型的分子和其他分子传送跨过或通过固定相(例如固体基质)，由于流动相中不同分子与固定相的相互作用不同或者流动相中不同分子在固定相中的滞留时间不同，从而可以将流动相中待分离的特定类型的分子与其他分子分离开。

如本文所使用的，术语“肝素亲和层析”是指依赖于目标分子与肝素分子(或肝素模拟物)的特异性结合的层析方法，其中，偶联到固相载体(或基质)的肝素分子(或肝素模拟物)作为配基与流动相(样品)中的分子(例如，CVB1颗粒)能够发生相互作用，即肝素分子(或肝素模拟物)对待纯化的分子具有特异性亲和力。如在本发明的上下文中所理解的，肝素亲和层析涉及将含有CVB1颗粒的样品加入到包含肝素(或肝素模拟物)作为配基的固定相中。

发明的有益效果

与传统的CVB1纯化方法相比，本申请提供的CVB1纯化方法的CVB1感染滴度回收率高，杂质去除效果优异(例如，可去除99％以上的HCP(宿主细胞蛋白)及HCD(宿主细胞DNA))，对初始待纯化样品要求低(例如，可从病毒收获物中直接高效捕获CVB1颗粒)，纯化工艺简单，可用于大规模制备CVB1完整颗粒，且产量和纯度满足产业化要求，能够用于肿瘤治疗药物、诊断试剂或疫苗的开发。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明保护范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1：实施例1中肝素亲和层析结果。

图2：实施例2中肝素亲和层析结果。

图3：对比例1中Capto Q Impres阴离子层析结果。

图4：对比例2中Capto Q Impres阴离子层析结果。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

实施例1：肝素亲和层析介质应用于CVB1的精纯制备

病毒培养：

使用HEK293 CD培养基(QuaCell)培养HEK293悬浮细胞(QuaCell)，起始细胞密度为(3～6)×10⁵cells/mL，细胞培养条件为37℃，5％CO₂，转速130rpm；培养3～5天后，细胞密度至(4～6)×10⁶cells/mL时，按照MOI＝0.01接种CVB1病毒，病毒培养条件为35℃，5％CO₂，转速130rpm，接种病毒后24h～48h收获病毒。

细胞裂解与酶消化：

向收获的病毒培养物中添加0.5％ Tween-20进行细胞裂解，促使胞内病毒的充分释放，在裂解的同时，添加核酸酶消化细胞裂解释放至病毒液相组合物中的宿主来源的核酸，优选的核酸酶可以是Merck、诺唯赞、弈盛或者是赛诺的核酸酶，核酸酶的有效作用浓度为20～100U/ml，核酸酶消化的处理条件可以是25℃～37℃处理1h～4h，也可以2～8℃消化4h～24h。同时在裂解液中额外添加1～2mM镁离子以提高酶活。以上几种条件下的核酸酶消化后的产物，检测酶消化后产物的的HCD(宿主细胞DNA)含量均降低至消化前HCD含量的1％以内。

澄清过滤：

经细胞裂解及核酸酶消化后，病毒液相组合物的通常浊度较高(＞700NTU)，本实施例采用5μm的PP材质滤器及0.65μm的PES材质滤器组合(科百特)，或者0.04μm～9μm的深层滤器(科百特)，均可以去除大量的细胞碎片及颗粒物，同时将将浊度控制在70NTU以内，且过滤前后病毒的活性几乎没有损失。

超滤浓缩：

本实施例采用超滤系统搭配100KDa超滤膜包(默克)或者是100KDa的中空纤维(科百特)，对上述获得的病毒液相组合物澄清液进行浓缩和替洗，浓缩倍数为2～10倍。替洗溶液采用添加含有一定浓度NaCl的pH缓冲液，采用的所述pH缓冲液可以是10～50mM的醋酸钠、His、PB、Tris其中的一种，优选的pH值范围是6～9之间，溶液电导在8～15mS/cm之间。超滤置换可去除病毒样品中大量的小分子杂质。

层析纯化：

本实施例使用复合填料层析及肝素亲和层析两步层析，纯化超滤后的病毒收获液。

使用的纯化层析系统设备型号为AKTA Pure(Cytiva)，使用的肝素层析填料优选Cytiva的Capto Heparin填料，也可以是纳微的-65Heparin层析填料，也可以是JNC的Cellufine^TM Sulfate填料。本实施例以纳微的/>-65Heparin层析填料为例纯化超滤后的病毒液相组合物。选择层析柱平衡液的pH值在6.5～8.0之间，电导为10～15mS/cm，病毒液相组合物的pH值及电导与平衡溶液相近，样品在层析柱中的平均保留时间在12～15min，总共上样量在10～20个柱体积，采用含500mM的NaCl的缓冲液洗脱样品，缓冲液pH值与样品pH值接近，收集洗脱峰样品。本步骤的肝素亲和层析，大量的杂质在流穿样品中，可去除95％以上的HCP及HCD，病毒主要在洗脱峰中，病毒感染滴度回收率达到80％及以上。肝素亲和层析图谱如图1所示。

肝素亲和层析纯化后的样品，使用纯化水调节电导至10～20mS/cm，采用Core400层析进一步去除较小的杂质，Core400层析的上样量在5～20CV，收集流穿样品。

本实施例中的纯化工艺，能够去除99％以上的HCP(宿主细胞蛋白)及HCD，且病毒感染滴度回收率达到60％及以上。

实施例2：使用肝素亲和层析介质直接捕获收获液中的CVB1

本实施例使用肝素亲和层析介质从未经超滤浓缩换液的病毒收获液中直接捕获CVB1。

病毒培养、细胞裂解与酶消化以及澄清过滤流程参照实施例1。

层析纯化：

使用的纯化层析系统设备型号为AKTAPure(Cytiva)，使用的肝素层析填料优选Cytiva的Capto Heparin填料，也可以是纳微的-65Heparin层析填料，也可以是JNC的Cellufine^TM Sulfate填料。本实施例以纳微的/>-65Heparin层析填料为例直接捕获经澄清过滤后的病毒液相组合物。选择层析柱平衡液的pH值在7.5～8.0之间，电导为10～15mS/cm，病毒液相组合物的pH值及电导与平衡溶液相近，样品在层析柱中的平均保留时间在10～30min之间，总共上样量在10～20个柱体积，采用含500mM的NaCl的缓冲液洗脱样品，缓冲液pH值与样品pH值接近，收集洗脱峰样品。本步骤的肝素亲和层析，大量的杂质在流穿样品中，可去除95％以上的HCP及HCD，病毒主要在洗脱峰中，病毒感染滴度回收率达到80％及以上。肝素亲和层析图谱如图2所示。

肝素亲和层析纯化后的样品，使用纯化水调节电导至10～20mS/cm，采用Core400层析进一步去除较小的杂质，Core400层析的上样量在5～10CV，收集流穿样品。

本实施例中的纯化工艺，能够去除99％以上的HCP(宿主细胞蛋白)及HCD，且病毒感染滴度回收率达到60％及以上。本实施例中以肝素亲和层析从未经超滤浓缩换液的病毒收获液中直接捕获CVB1的工艺流程，减少了超滤浓缩和缓冲液置换的过程，显著简化纯化流程，提高了纯化效率。

对比例1：采用阴离子交换层析方法纯化制备CVB1

病毒培养、细胞裂解与酶消化、澄清过滤以及超滤流程参照实施例1。

层析纯化：

本对比例采用阴离子交换层析纯化病毒样品，再通过复合填料层析精纯，收集流穿峰既得病毒精纯液。

使用的纯化层析系统设备型号为AKTA Pure(Cytiva)，使用的阴离子层析填料优选Cytiva的Capto Q Impres填料。Capto Q Impres填料的平衡溶液与超滤置换溶液相同，pH值6～9，电导8～15mS/cm。超滤后的病毒液相组合物上样Capto Q Impres层析，样品的平均保留时间在5～15min，总计上样量5～10个柱体积，上样结束后，采用含300～500mM NaCl的洗脱缓冲液洗脱，洗脱液pH与平衡样品pH保持一致，收集洗脱峰。本步骤的阴离子层析，约50％的杂质在流穿样品中，病毒主要在洗脱峰中，病毒感染滴度回收率达到70％及以上。阴离子交换层析图谱如图3所示。

阴离子层析纯化后的样品，使用纯化水调节电导至10～20mS/cm，采用Core400层析进一步去除较小的杂质，Core400层析的上样量在5～10CV，收集流穿样品。

基于本对比例的两步层析工艺去除HCP及HCD的效果不如肝素亲和层析，病毒感染滴度回收率为40％及以上，并且，由于Q层析可非特异性地结合所有带负电荷的蛋白，相比亲和层析，整体载量较低，需控制在10个CV以下，否则易出现穿透现象。

对比例2：使用阴离子交换层析直接纯化收获液中的CVB1

本对比例使用阴离子交换层析介质从未经超滤浓缩换液的病毒收获液中直接纯化CVB1。

病毒培养、细胞裂解与酶消化以及澄清过滤流程参照实施例1。

层析纯化：

使用的纯化层析系统设备型号为AKTA Pure(Cytiva)，使用的阴离子层析填料为Cytiva的Capto Q Impres填料。在阴离子交换层析纯化病毒实验中，当上样体积5～10个CV，大部分的病毒样品未与阴离子交换树脂结合，主要病毒产物与杂质都在流穿峰中。通过调节平衡溶液、上样样品及洗脱溶液的pH值、电导，以及延长病毒在阴离子交换树脂中保留时间等，依然90％以上的病毒流穿，未能被阴离子交换树脂捕获，推测原因可能是基质中大量杂质竞争性结合阴离子交换树脂的活性位点，导致阴离子交换树脂无法有效捕获病毒。层析图谱如图4所示。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (57)

1.一种纯化样品中CVB1(柯萨奇病毒B1型)的方法，其包括对样品进行肝素亲和层析；

其中，所述肝素亲和层析包括以下步骤：

(1)在第一溶液中，使所述样品中的CVB1与肝素亲和层析介质结合形成复合物；

(2)在第二溶液中，使所述复合物解离；和，

(3)收集含有CVB1的解离产物；

其中，所述肝素亲和层析填料使用的配基为肝素或肝素模拟物；

所述第二溶液的电导为30～50mS/cm，所述第二溶液的pH值为6.5～8.0。

2.权利要求1的方法，其中，所述肝素亲和层析填料为Capto Heparin层析填料、-65Heparin层析填料或Cellufine^TM Sulfate层析填料。

3.权利要求1的方法，其中，所述第一溶液的电导与所述样品的电导相近。

4.权利要求1的方法，其中，所述第一溶液的电导为10～15mS/cm。

5.权利要求1的方法，其中，所述第二溶液含300～500mM的NaCl。

6.权利要求1的方法，其中，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值与所述样品的pH值相近。

7.权利要求1的方法，其中，所述第一溶液的pH值为6.5～8.0。

8.权利要求1的方法，其中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导和/或pH值的步骤。

9.权利要求1的方法，其中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～15mS/cm，和/或，调节所述样品的pH值至6.5～8.0。

10.权利要求1的方法，其中，步骤(1)中，所述肝素亲和层析的上样量为10～20个柱体积。

11.权利要求1的方法，其中，所述肝素亲和层析的保留时间为10～30min。

12.权利要求1的方法，其中，所述方法进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。

13.权利要求12的方法，其中，所述方法在所述肝素亲和层析之后进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。

14.权利要求12的方法，其中，所述吸附层析的层析介质能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)。

15.权利要求12的方法，其中，所述复合层析的层析介质为分子筛与阴离子交换相结合的多模式复合层析介质。

16.权利要求12的方法，其中，所述复合层析的层析介质为Capto Core400或CaptoCore700层析介质。

17.权利要求12的方法，其中，所述复合层析包括以下步骤：

(I)使平衡缓冲液通过所述复合层析介质；

(II)使含CVB1的样品通过所述复合层析介质；

(II)使顶洗缓冲液通过所述复合层析介质。

18.权利要求17的方法，其中，步骤(II)中，所述样品的上样量为5～20个柱体积。

19.权利要求17的方法，其中，所述复合层析的保留时间为1～10min。

20.权利要求17的方法，其中，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导与步骤(II)中的样品的电导相近。

21.权利要求17的方法，其中，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导为10～20mS/cm。

22.权利要求17的方法，其中，步骤(II)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～20mS/cm。

23.权利要求17的方法，其中，所述平衡缓冲液与所述顶洗缓冲液相同或接近。

24.权利要求17的方法，其中，所述复合层析的层析柱的柱高为10～30cm。

25.权利要求1～24任一项的方法，其中，所述样品为含有宿主细胞成分的病毒培养物，并且，所述方法在进行层析之前还包括对样品进行预处理，所述预处理包括裂解细胞释放CVB1的步骤。

26.权利要求25的方法，其中，所述预处理包括步骤：

(i)裂解细胞释放CVB1；以及，

(ii)去除或减少细胞裂解产物中的细胞碎片和/或颗粒物。

27.权利要求26的方法，步骤(i)中，所述方法通过使用细胞裂解液裂解细胞释放CVB1。

28.权利要求27的方法，其中，所述细胞裂解液包含表面活性剂。

29.权利要求28的方法，其中，所述表面活性剂包含Tween-20、Tween-80、或其组合。

30.权利要求28的方法，其中，所述表面活性剂的浓度为0.25％～1％m/v。

31.权利要求27的方法，其中，所述细胞裂解液包含0.25％～1％m/v的Tween-20、Tween-80、或其组合。

32.权利要求27的方法，其中，所述方法通过在25～37℃的温度下，使用所述细胞裂解液裂解细胞1～4h。

33.权利要求26的方法，其中，在步骤(i)中或者在步骤(i)之后，所述预处理还包括去除或减少宿主细胞核酸的步骤。

34.权利要求33的方法，其中，所述方法通过使用核酸酶去除或减少宿主细胞核酸。

35.权利要求34的方法，其中，所述方法通过在细胞裂解液中添加核酸酶或者在细胞裂解产物中添加核酸酶去除或减少宿主细胞核酸。

36.权利要求35的方法，其中，核酸酶酶解体系中，所述核酸酶的浓度为20～100U/ml。

37.权利要求35的方法，其中，核酸酶酶解体系中还包含镁离子。

38.权利要求37的方法，其中，核酸酶酶解体系中镁离子的浓度为1～2mM。

39.权利要求34的方法，其中，所述方法通过(a)在25～37℃的温度下使用核酸酶酶解1～4h，或者，(b)在2～8℃的温度下使用核酸酶酶解4～24h以去除或减少宿主细胞核酸。

40.权利要求26的方法，步骤(ii)中，所述方法通过过滤去除细胞裂解产物中的细胞碎片和/或颗粒物。

41.权利要求40的方法，其中，所述过滤为单级过滤或多级过滤。

42.权利要求40的方法，其中，所述过滤步骤用的过滤器为深层过滤器或两级囊式过滤器。

43.权利要求42的方法，其中，所述深层过滤器为0.04～9μm深层过滤器，和/或，所述两级囊式过滤器为5μm+0.65μm两级囊式过滤器。

44.权利要求26的方法，其中，所述预处理还包括步骤(iii)：去除或减少步骤(ii)的产物中的小分子。

45.权利要求44的方法，其中，步骤(iii)中，所述方法通过使用超滤系统对步骤(ii)的产物进行超滤置换以去除或减少其中的小分子，并对所述产物进行浓缩。

46.权利要求45的方法，其中，所述超滤系统含有中空纤维或超滤膜包。

47.权利要求45的方法，其中，所述超滤系统的截留分子量为50～300KDa。

48.权利要求45的方法，其中，所述超滤系统的截留分子量为50KDa，70KDa，100KDa，或300KDa。

49.权利要求45的方法，其中，进行超滤时使用的替洗液为醋酸钠、组氨酸、磷酸钠或Tris缓冲液。

50.权利要求49的方法，其中，所述替洗液的pH值为6～9。

51.权利要求49的方法，其中，所述替洗液电导为8～20mS/cm。

52.权利要求49的方法，其中，所述替洗液含有80～200mmol/L NaCl。

53.权利要求45的方法，其中，所述浓缩的浓缩倍数为2～10倍。

54.权利要求26的方法，其中，所述预处理不包括步骤(iii)：去除或减少步骤(ii)的产物中的小分子。

55.权利要求54的方法，其中，所述方法包括直接对步骤(ii)的产物进行层析。

56.权利要求55的方法，其中，所述方法在对步骤(ii)的产物进行层析之前，还包括调节所述步骤(ii)的产物的电导和/或pH值。

57.权利要求44-56任一项的方法，其中，所述小分子为分子量小于300KDa的分子。