CN104845945A

CN104845945A - 一种重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法

Info

Publication number: CN104845945A
Application number: CN201510183384.XA
Authority: CN
Inventors: 刘为勇; 王涛
Original assignee: Chuan Rui Bio Tech Ltd Hubei
Current assignee: Chuan Rui Bio Tech Ltd Hubei
Priority date: 2015-04-18
Filing date: 2015-04-18
Publication date: 2015-08-19

Abstract

一种重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法其步骤为：病毒上清滤除细胞碎片，使用聚醚砜膜盘式过滤器进行浓缩；浓缩液冻存于-80度冰箱；HR 5/5柱子填装肝素，再将浓缩后的样品解冻装入柱子中；洗脱。收集三个峰值洗脱液，冻存于-80度或液氮中。优点：采用肝素亲和层析就是利用它具有大量带负电荷的硫酸基团的分子特性，作为蛋白及病毒纯化中的亲和配体，选择性地结合病毒表面蛋白分子及其它分子，然后利用不同浓度的盐离子做梯度洗脱，以达到将病毒单独洗脱下来的目的。

Description

一种重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，更具体涉及到重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析，属于生物医药领域。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，它是已知的生物分子材料中具有最高负电荷密度的分子，在生物医学领域应用广泛。但现有肝素的纯化方法难以工业化大规模生产。

发明内容

本发明的目的就是针对现有现有肝素的纯化方法难以工业化大规模生产之现状, 而提供一种有关重组单纯疱疹病毒的亲和层析方法，主要分为初步纯化和浓缩和高效液相色谱纯化两部分。

本发明包括如下步骤：

(I). 病毒上清在双羟色胺Tuffryn R聚砜胶囊过滤设备中滤除细胞碎片；

(II). 使用2L的聚醚砜膜盘式搅拌细胞超滤装置进行过滤浓缩，使用肝素亲和吸附缓冲液进行富集截留，浓缩液冻存于-80度冰箱；

(III). HR 5/5 层析柱填装肝素，再将浓缩后的样品解冻装入层析柱中；

(IV). pH 7.5、浓度为33mM的 NaCl在153cm/h下线性流速洗脱；

(V). 收集三个峰值洗脱液，冻存于-80度或液氮中。

步骤(I)中用到的是双羟色胺TuffrynR聚砜膜0.45/0.2Am胶囊过滤设备。

步骤(I)中超滤装置在工作中的外压应小于0.01mPa，速度为50mL/min 。

过滤器的有效面积为162平方厘米，截留分子量为30万。

步骤(II)1L病毒上清浓缩需要20倍恒定氮气压力和33.5cm/s的速度。

步骤(II)中使用肝素亲和吸附缓冲液，其配方为150 mM NaCl in 20 mMTris-HCl buffer，pH 7.5。

步骤(III)中适合于亲和层析的层析柱填柱材料为tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，Fractogel EMD DEAE (M) ，和Fractogel EMD SO₃- (M) gels。

步骤(III)中层析柱填充完后要用20mM HEPES buffer, pH 7.5缓冲液在无盐条件下平衡。

步骤(III)中逐步洗脱所用NaCl的浓度和体积分别为150 mM，19.5 倍层析柱体积的NaCl，进行病毒获取和漂洗；350nM，13倍层析柱体积的NaCl进行病毒洗脱以及1200mM ，7.5 倍层析柱体积的NaCl进行最终高严格漂洗。

步骤(IV)中洗脱液NaCl的线性流量运行率为153cm/h。

本发明的优点 : 采用肝素亲和层析就是利用它具有大量带负电荷的硫酸基团的分子特性，作为蛋白及病毒纯化中的亲和配体，选择性地结合病毒表面蛋白分子及其它分子，然后利用不同浓度的盐离子做梯度洗脱，以达到将病毒单独洗脱下来的目的。重组单纯疱疹病毒具有能和肝素亲和结合的性质，因此选择肝素亲和层析柱能方便快捷的纯化重组单纯疱疹病毒，并且能放大，为工业化大规模纯化重组单纯疱疹病毒奠定了坚实的基础。

附图说明

附图1：组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法流程图。

附图2：三峰值收集病毒样品SDS-PAGE跑胶，然后考马斯亮蓝染色鉴定纯化效果图。

具体实施方式

以下内容，为详细的方案：

初步纯化和浓缩：

1．粗纯化的病毒上清在室温下使用双羟色胺TuffrynR聚砜膜（0.45/0.2Am）胶囊过滤设备（有效过滤面积500平方厘米）滤除任何细胞和细胞碎片，在低背压（小于0.01mPa）条件下 50mL/min 1L或2L的规模进行超滤纯化。

2. 用无菌容器收集被纯化过的渗透液或进一步超滤后收集。

3. 使用2 - L的搅拌细胞超滤装置，直径150mm的Omega聚醚砜膜盘式过滤器（有效过滤面积 162平方厘米，截留分子量30万）进行浓缩；该膜要预先使用1L的Milli-Q水和40mL含10％FBS的DMEM介质清洗。

4. 1L的病毒上清浓缩需要20倍的恒定氮气压力（30磅）和极速（33.5 cm/s）。

5. 在渗透时，使用肝素亲和吸附缓冲液(150 mM NaCl in 20 mMTris-HCl buffer，pH 7.5)对病毒进行富集截留，相同的模式反复渗透3次，每次使用缓冲液100mL。

6. 将浓缩的病毒上清液分装保存入-80度冰箱。

高效液相色谱纯化：

7. 浓缩的病毒上清在37度快速解冻然后用0.45um GHP Acrodisc 滤膜 (Pall Gelman Sciences)过滤。

8. 病毒纯化实验在室温进行，在低压液相色谱系统中(GradiFrac; GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，使用肝素亲和柱进行层析，280nm紫外吸收监测蛋白洗脱。将tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，Fractogel EMD DEAE (M)，和 Fractogel EMD SO₃- (M) gels (Merck，Darmstadt，Germany) 装入HR 5/5 柱子，使终体积达到1mL并在缓冲液中平衡：20mM HEPES buffer，pH 7.5，在无盐条件下进行。

9. 将浓缩后的样品(0.5mL)装入Fractogel packed 柱子。NaCl（pH 7.5，从0到1000mM，以33mM /min速度升高）线性梯度在153cm/h的线性流速洗脱。

10. 重复运行每个柱子。以Fractogel EMD Heparin (S) 1 mL column进行吸附和解吸条件优化。病毒吸附和洗脱的最佳盐浓度得以确定。

11. 最后逐步洗脱，具体包括150 mM NaCl （19.5 倍柱子体积）的病毒获取和漂洗、350nM NaCl（13倍柱子体积）病毒洗脱以及1200mM NaCl（7.5 倍柱子体积）最终高严格漂洗。线性流量运行率为153cm/h。收集三个峰值的洗脱液，存于-80度或液氮中。

实施例1：

1. 粗纯化的重组单纯疱疹病毒上清在室温下使用双羟色胺TuffrynR聚砜膜胶囊过滤设备滤除任何细胞和细胞碎片。

2. 使用搅拌细胞超滤装置进行超滤，Omega聚醚砜膜盘式过滤器进行浓缩。

3. 在渗透时，使用肝素亲和吸附缓冲液对病毒进行富集截留，相同的模式反复渗透3次，每次使用缓冲液100mL。

4. 将浓缩的病毒上清液用0.45um GHP Acrodisc 滤膜过滤。

5.将tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，Fractogel EMD DEAE (M)，和 Fractogel EMD SO₃- (M) gels (Merck，Darmstadt，Germany) 装入HR 5/5 柱子，使终体积达到1mL并在缓冲液中平衡：20mM HEPES buffer，pH 7.5，在无盐条件下进行。

6. 将GHP Acrodisc 滤膜过滤后的样品0.5mL装入Fractogel packed 柱子。用150 mM，19.5 倍柱子体积的NaCl，进行病毒获取和漂洗；350nM，13倍柱子体积的NaCl进行病毒洗脱以及1200mM ，7.5 倍柱子体积的NaCl进行最终高严格漂洗。线性流量运行率为153cm/h。收集三个峰值的病毒洗脱液。

7. 取病毒洗脱液部分用于SDS-PAGE检测，其余冻存于-80度或液氮罐中。用10%分离胶，5% 浓缩胶检测纯化的病毒。每管取5 μL病毒液，加5μL 2 x SDS 上样缓冲液，100 ℃沸水加热变性5 min，120 V 恒压电泳，待溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色，电泳染色结果见附图2，从图中可见在三个峰值中收集的病毒含量高，病毒溶液分离纯化效果理想。

Claims

1. 一种重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法，其特征在该方法包括如下步骤：

(II). 使用2L的聚醚砜膜盘式搅拌细胞超滤装置进行过滤浓缩，用肝素亲和吸附缓冲液进行富集截留，浓缩液冻存于-80度冰箱；

(IV). pH 7.5、浓度为33mM的 NaCl在153cm/h下线性流速洗脱；

(V). 收集三个峰值洗脱液，冻存于-80度或液氮中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中用到的是双羟色胺TuffrynR聚砜膜0.45/0.2Am胶囊过滤设备。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中超滤装置在工作中的外压应小于0.01mPa，速度为50mL/min 。

4.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于过滤器的有效面积为162平方厘米，截留分子量为30万。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(II)1L病毒上清浓缩需要20倍恒定氮气压力和33.5cm/s的速度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(II)中使用肝素亲和吸附缓冲液，其配方为150 mM NaCl in 20 mMTris-HCl buffer，pH 7.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(III)中适合于亲和层析的层析柱填柱材料为tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，Fractogel EMD DEAE (M) ，和Fractogel EMD SO₃- (M) gels。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(III)中层析柱填充完后要用20mM HEPES buffer, pH 7.5缓冲液在无盐条件下平衡。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在步骤(III)中逐步洗脱所用NaCl的浓度和体积分别为150 mM，19.5 倍层析柱体积的NaCl，进行病毒获取和漂洗；350nM，13倍层析柱体积的NaCl进行病毒洗脱以及1200mM ，7.5 倍层析柱体积的NaCl进行最终高严格漂洗。

10.根据权利要求1，12或13所述的方法，其特征在步骤(IV)中洗脱液NaCl的线性流量运行率为153cm/h。