CN104845944A - 一种重组单纯疱疹病毒的中空纤维纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有关重组单纯疱疹病毒的中空纤维纯化方法，其步骤为：收集经过Vero细胞扩增的病毒上清；病毒上清液中加入到Flotrex AP型中空纤维滤柱中过滤，收集过滤病毒液；将过滤病毒液再加入到Memtrex AP型中空纤维滤柱中过滤，收集过滤病毒液，分装冻存于-80度；取适量病毒冻存液，做蛋白电泳跑胶染色或Western blotting检测，鉴定纯化效果。本发明的优点：中空纤维膜过滤技术在病毒的浓缩和澄清方面也被广泛应用，它可以有效保护病毒分子的完整性和生物活性。本发明就是基于中空纤维膜的以上特性，采用两种孔径的中空纤维过滤膜结合使用的过滤方法，能快速高效的纯化浓缩重组单纯疱。

Description

一种重组单纯疱疹病毒的中空纤维纯化方法

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，更具体涉及到一种重组单纯疱疹病毒的中空纤维纯化，属于生物医药领域。

背景技术

中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的膜分离技术，是膜分离领域中的一个重要分支，其中空纤维壁具有选择透过性，可以选择性地使液体混合物中某些组分透过中空纤维膜，而同时对另一些组分具有截留作用。中空纤维膜过滤技术可用于物质的分离、浓缩与提纯。中空纤维膜分离器可与其他分离装置相比，具有体积小、分离效率高、适应性强的优点，且节省能源，无污染，其发展和市场应用潜力巨大。但目前中空纤维膜及过滤技术尚未用于重组单纯疱疹病毒纯化。

发明内容

本发明的目的针对目前中空纤维膜及过滤技术尚未用于重组单纯疱疹病毒纯化之不足而提供一种有关重组单纯疱疹病毒的中空纤维纯化方法。

本发明包括如下步骤：

(I). 采用离心方式收集经过Vero细胞扩增的病毒上清；

(II). 病毒上清液中加入到Flotrex AP型中空纤维滤柱中过滤，收集过滤病毒液；

(III). 将过滤病毒液再加入到Memtrex AP型中空纤维滤柱中过滤，收集过滤病毒液，分装冻存于-80℃；

(IV). 取冻存的过滤病毒液，解冻后加入体积2 x SDS 上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE跑胶染色或者Western blotting检测纯化效果；

(V)取适量病毒冻存液，做Western blotting，检测纯化效果。

步骤(I)中离心力为6000g，离心时间为20分钟。

步骤(II)中使用的中空纤维滤柱为GE公司的Flotrex AP，型号为CFP96。

步骤(II)中使用的中空纤维滤膜孔径为0.65μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为60 cm。

步骤(II)中膜载量为40-50 L/mm²，剪切力为3000-5000 1/second。

步骤(III) 中使用的中空纤维滤柱为GE公司的Memtrex AP，型号为CMMP94。

步骤(III) 中使用的中空纤维滤膜孔径为0.45μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为30 cm。

步骤(III)中膜载设量为40-60 L/mm²，剪切力为6000-8000 1/second 。

中空纤维滤柱首先用pH7.0，20-40mM的磷酸盐缓冲液平衡，然后再用pH7.5，20-30mM的HEPES缓冲液平衡。

本发明所涉及到的试剂溶液配方如下：

磷酸盐缓冲液（PBS）：

1.4 mM KH₂PO₄

8 mM Na₂HPO₄

140 mM NaCl

2.7 mM KCl,

pH 7.4；

2 x SDS 上样缓冲液：

20% 甘油

4% SDS

100 mM Tris pH 6.8

0.002% 溴酚蓝

100 mM 二硫苏糖醇；

HEPES缓冲液平衡：

25mM

pH7.5。

以下内容，为详细的方案：

1.      将80%-90%细胞密度的Vero细胞用10 mL 的无菌移液管吸取6mL PBS分别清洗细胞3遍；每瓶细胞瓶中加1 mL mtHSV病毒接种液，放置于37^oC吸附1个小时；加入病毒生长液维持液于细胞瓶中，放37 ℃恒温培养箱培养至75-100% 细胞出现CPE病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融2～3次，4^oC 6000g 离心20分钟，去掉沉淀，收集病毒上清。

2.      选择Flotrex AP加长型中空纤维滤柱（GE公司，CFP96），中空纤维滤膜孔径为0.65 μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为60 cm。中空纤维滤柱首先用pH7.0，20-40mM的磷酸盐缓冲液平衡，然后再用pH7.5，20-30mM的HEPES缓冲液平衡以溶解消除磷酸盐缓冲液平衡时产生的不溶性磷酸盐沉淀。

3.      将步骤1收集的病毒上清加入到经过平衡的Flotrex AP中空纤维滤柱进行过滤。膜载量为40-50 L/mm²，剪切力为3000-5000 1/second，滤掉细胞及细胞残片，收集滤液。

4.      将滤液加入到Memtrex AP型中空纤维滤柱（GE公司，CMMP94）中进行进一步过滤；中空纤维滤膜孔径为0.65 μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为30 cm；膜载设量为40-60 L/mm²，剪切力为6000-8000 1/second，收集滤液，分装冻存于-80^oC。

5.      取量冻存液，解冻，等体积加入2 x SDS 上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE跑胶染色或者Western blotting检测纯化效果。

6. 试剂溶液配方

磷酸盐缓冲液（PBS）：

1.4 mM KH₂PO₄

8 mM Na₂HPO₄

140 mM NaCl

2.7 mM KCl,

pH 7.4；

HEPES缓冲液平衡：

25mM

pH7.5；

2 x SDS 上样缓冲液：

20% 甘油

4% SDS

100 mM Tris pH 6.8

0.002% 溴酚蓝

100 mM 二硫苏糖醇。

本发明的优点：中空纤维膜过滤技术在病毒的浓缩和澄清方面也被广泛应用，它可以有效保护病毒分子的完整性和生物活性。本发明就是基于中空纤维膜的以上特性，采用两种孔径的中空纤维过滤膜结合使用的过滤方法，能快速高效的纯化浓缩重组单纯疱。

    附图说明

图1为本发明工艺流程图；

图2为纯化后Western blotting对比结果图；

图3为纯化结果图。

                    具体实施方式

实施例1：

1. 将80%细胞密度的Vero细胞用10 mL 的无菌移液管吸取6mL PBS分别清洗细胞3遍；每瓶细胞瓶中加1 mL mtHSV病毒接种液，放置于37^oC吸附1个小时；加入病毒生长液维持液于细胞瓶中，放37 ℃恒温培养箱培养至75% 细胞出现CPE病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融2～3次，4^oC 6000g 离心20分钟，去掉沉淀，收集病毒上清50 mL。

2.  选择Flotrex AP加长型中空纤维滤柱（GE公司，CFP96），中空纤维滤膜孔径为0.65 μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为60 cm。中空纤维滤柱首先用pH7.0，30mM的磷酸盐缓冲液平衡，然后再用pH7.5，25mM的HEPES缓冲液平衡以溶解消除磷酸盐缓冲液平衡时产生的不溶性磷酸盐沉淀。

3.    将步骤1收集的50 mL病毒上清加入到经过平衡的Flotrex AP中空纤维滤柱进行过滤。膜载量为48 L/mm²，剪切力为5000 1/second，滤掉细胞及细胞残片，收集滤液。

4.  将滤液加入到0.45μm的Memtrex AP型中空纤维滤柱（GE公司，CMMP94）中进行进一步过滤，膜载量为35 L/mm²，剪切力为6000 1/second，收集滤液，分装冻存于-80^oC。

5.  取量冻存液，解冻，Western blotting检测纯化效果，SDS-PAGE用10%分离胶，5% 浓缩胶；一抗鼠单抗按1:5000使用，二抗兔抗鼠按1:1000使用，化学发光显色，显色结果如图2，可见纯化后病毒浓度浓度明显提高。

实施例2：

1.将90%细胞密度的Vero细胞用10 mL 的无菌移液管吸取6mL PBS分别清洗细胞3遍；每瓶细胞瓶中加1 mL mtHSV病毒接种液，放置于37^oC吸附1个小时；加入病毒生长液维持液于细胞瓶中，放37 ℃恒温培养箱培养至80% 细胞出现CPE病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融2～3次，4^oC 6000g 离心20分钟，去掉沉淀，收集病毒上清50 mL。

2.选择Flotrex AP加长型中空纤维滤柱（GE公司，CFP96），中空纤维滤膜孔径为0.65 μm，纤维管内径为1 mm，纤维管长度为60 cm。中空纤维滤柱首先用pH7.0，40mM的磷酸盐缓冲液平衡，然后再用pH7.5，30mM的HEPES缓冲液平衡以溶解消除磷酸盐缓冲液平衡时产生的不溶性磷酸盐沉淀。

3.将步骤1收集的50 mL病毒上清加入到经过平衡的Flotrex AP中空纤维滤柱进行过滤。膜载量为52 L/mm²，剪切力为4500 1/second，滤掉细胞及细胞残片，收集滤液。

4.将滤液加入到0.45μm的Memtrex AP型中空纤维滤柱（GE公司，CMMP94）中进行进一步过滤，膜载量为40 L/mm²，剪切力为6500 1/second，收集滤液，分装冻存于-80^oC。

5.取量冻存液，解冻，SDS-PAGE跑胶染色检测纯化效果，SDS-PAGE用12%分离胶，5% 浓缩胶，染色后结果如图3，可见病毒纯化后明显比纯化前干净，纯化效果理想。

Claims (5)

1.一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法，其特征在该方法包括如下步骤：

(I).将在Vero细胞中扩增得到的重组单纯疱疹病毒上清液中加入5%的PEG8000，4^oC搅拌6个小时或过夜，4^oC 13500g离心2小时；

(II).沉淀用TNMC缓冲液溶解，并在溶液中加入n-十二烷基-β-D-麦芽苷促进沉淀的溶解；

(III).制备蔗糖密度梯度，将浓缩的mtHSV溶液加于蔗糖密度梯度顶层，37 500 g 离心力在4^oC离心18小时；

(IV).将离心管底部刺穿，按一定体积量等体积收集，收集10管，取每管收集液的一部分做蛋白质电泳染色和Western blotting鉴定分析，将经鉴定分析确定了的病毒含量和纯度高的收集管冻存于-80^oC或液氮罐中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(II)中TNMC缓冲液配方为50 mM Tris.HCl，100 mM NaCl，10 mM CaCl₂，1mM MgCl₂ 。

3.根据权利要求4所述的方法，其特征在于n-十二烷基-β-D-麦芽苷的终浓度为20mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(III)中蔗糖密度梯度为5%，20%，25%，27.5%，30%，35% 。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于本发明所涉及到的试剂溶液配方如下：

磷酸盐缓冲液（PBS）：

1.4 mM KH₂PO₄

8 mM Na₂HPO₄

140 mM NaCl

2.7 mM KCl,

pH 7.4；

 病毒生长液：

500mL MEM Medium

100U/mL 青霉素

100μg/mL链霉素）

0.2%牛血清白蛋白组分V

25mM HEPES缓冲液

2μg/mLTPCK-胰酶 ；

 十二烷基麦芽苷存储液：

200 mM n-十二烷基-β-D-麦芽苷（10% W/V 十二烷基麦芽苷）（Anatrace D310S），

 蛋白酶抑制剂存储液（1000 x）：

1 M 溶于丙酮的苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma L7626）

1 mg/mL 亮抑酶肽（Sigma L2884）

1 mg/mL 胃酶抑素（Sigma P4265）；

 蔗糖溶液：

向6个15 mL的聚丙烯离心管（Corning）中分别加入1.5g，2g，2.5g，2.75，3g和3.5g的蔗糖；

再向每个管中加入10 mL 50 mM Tris.HCl pH7.5，1 mM EDTA，0.05%十二烷基麦芽苷；

将管子盖紧，放置在混悬仪上混合大约20分钟直到所有蔗糖溶解：

2 x SDS 上样缓冲液：

20% 甘油

4% SDS

100 mM Tris pH 6.8

0.002% 溴酚蓝

100 mM 二硫苏糖醇。