CN108660125A - 一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法 - Google Patents

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孙鹏
康雅明
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    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals

Abstract

本发明提供了一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，步骤包括：对输血白细胞过滤器进行冲洗获得白细胞，之后利用红细胞裂解液去除红细胞和白细胞裂解液在氮气增压设备中裂解白细胞，以及添加密度梯度分离生物颗粒溶剂离心分离细胞组织获得目标细胞组织。采用上述方法能产业化的分离提取中性粒细胞嗜天青颗粒作为多种蛋白酶例如蛋白酶3(PR3)、髓过氧化物酶(MPO)和细菌通透性因子(BPI)等蛋白抗原提纯的原料，在医学临床检验上有着非常大的意义。

Description

一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法
技术领域
本发明涉及医学临床检验技术领域，具体涉及一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法。
背景技术
中性粒细胞占白细胞50-70％，是外周血循环和免疫系统中含量最丰富的白细胞。中性粒细胞在机体非特异性免疫防御反应中起着十分重要的作用,是机体抵御微生物病原体,特别是化脓性细菌入侵的重要吞噬细胞。中性粒细胞的胞质呈浅粉红色，含有许多细小颗粒，其中浅紫色的为嗜天青颗粒(Azurophilic Granule)，浅红色的为特殊颗粒(Specific Granule)。嗜天青颗粒约占颗粒总数的20％，电镜下颗粒较大，直径0.6～0.7&micro；m，呈圆形或椭圆形，电子密度较高。嗜天青颗粒是一种溶酶体，含有多种蛋白酶，如蛋白酶3(PR3)、酸性磷酸酶(ACP)、髓过氧化物酶(MPO)、强性硬蛋白酶(Elastase)、组织蛋白酶G(Cathepsin G)、细菌通透性因子(BPI)等。中性粒细胞嗜天青颗粒中所含的这些酶在临床检验中能作为抗原，来检验自身免疫系统疾病中各类特异性抗体的存在，比如抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)，是系统性血管炎等自体免疫系统疾病的重要标记靶抗原。因此，从人血白细胞中分离中性粒细胞进而提取嗜天青颗粒在医学临床检验上有着非常大的意义。
在输血领域，我国一般采用成分输血法，即从全血产品分离出必要的血液成分并将该血液成分给受血者输血的方法。成分输血法包括输红细胞，输血小板，输血浆等，这取决于受血者所需的血液成分。用于这些输血法的血液成分制剂包括红细胞产品，血小板产品，血浆制剂等。由于因输血而伴生的不利的副作用，例如较轻微的不利的副作用(如，头痛，恶心，寒战，非溶血性发烧反应等)和严重不利的副作用(如，同种抗原过敏，病毒感染，输血后GPHD等)严重影响受血者主要是由于输血用的血液产品中所含的白细胞造成，使用白细胞过滤器过滤白细胞已成为今年来我国血站采用的输血法。白细胞过滤器采用由纤维质材料或多孔构件例如具有互联孔隙的多孔材料构成的过滤介质去除白细胞，具有优良的去除白细胞能力、易于操作以及价格低廉等优点。白细胞过滤器，具体包括外壳、滤膜和血流通道，所述外壳为圆饼形，所述外壳具有第一圆侧面、第二圆侧面和内部空心。白细胞过滤利用重力的原理，使全血血液从血液入端进入白细胞过滤器，通过过滤器中的白细胞过滤膜再由血液出口端流出。这种白细胞过滤器在过滤完白细胞后成为医疗废物，需灭菌处理后交专业部门处理。
为了防止乙肝、丙肝、艾滋病等疾病经血液途径传播，保障献血者和用血者的健康和生命安全，血液产品属于严格管制品。根据以往的常规方法获取人血白细胞并从中提取嗜天青颗粒需要大量的正常人血液，这对于来源紧张的正常人血液是一种不小的耗费。
中性粒细胞在机体非特异性免疫防御反应中起着十分重要的作用,是机体抵御微生物病原体,特别是化脓性细菌入侵的重要吞噬细胞。外周血白细胞以中性粒细胞为主,正常情况下中性粒细胞占人外周血白细胞的50％～70％。急性感染或炎症、广泛的组织损伤或坏死、急性溶血和失血、急性中毒以及恶性肿瘤等情况时,外周血中性粒细胞的数量增高。随着对全身炎症反应综合征研究的不断深入,对中性粒细胞在炎症过程中的作用又有了新的认识,对其数量、功能及在组织中的转归进行研究成为临床和科研的重要内容。因此从血液中分离中性粒细胞是在细胞水平研究其生物学特性及功能的第一步。
2005年，医学理论与实践，Vol.18(3),272-2274，中性粒细胞的分离与纯化，作者李鹏，邢杰，提到了一种普遍使用的人中性粒细胞分离方法，如Ficoll-Hypaque密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法，但由于由于中性粒细胞的密度与红细胞相近,因此此方法具有难将中性粒细胞与红细胞完全分开的缺点。
2008年，国际病理科学与临床杂志International Journal of Pathology andClinicalMedicine，Vol.28(4),277-281，四种常用的人中性粒细胞分离方法的比较，作者李金凤,刘文礼等，提到了目前国内外已经报道的四种常用分离人和动物中性粒细胞分离的方法，包括Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll2H ypaque密度梯度离心法、Dextran作用下红细胞自然沉降法和裂解红细胞法，并比较了各方法在收获细胞的纯度、回收率、存活率的优劣势。其中裂解红细胞法是利用红细胞裂解液快速裂解红细胞,然后进行密度梯度离心分离中性粒细胞,此方法的优点同Dextran作用下红细胞自然沉降法一样,克服了密度梯度离心法难将中性粒细胞与红细胞完全分开的缺点。
上述提及的已有的关于中性粒细胞分离与纯化的方法所采用的细胞来源均为人或动物静脉血液，与本发明所使用的输血废物去白细胞过滤器并不一致，且均未提到从分离的中性粒细胞中继续提取嗜天青颗粒的技术与方法。
综上所述，目前国内外文献资料显示及报道的分离人和动物中性粒细胞的方法众多,但是这些方法所采用的原材料都来自正常的人或动物全血，由于人血在我国本身就是稀缺资源，其流通及使用都受到严格的管制，所以用人血作为原材料来提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法在产业化普及上具有极大的困难。同时，由于动物蛋白酶和人蛋白酶的非生物同源性，造成以动物血作为原材料来提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法只适用于科研阶段，并不适合产业化后用于人类的医学临床研究及疾病体外诊断方面。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，本方法能产业化的分离提取中性粒细胞嗜天青颗粒作为多种蛋白酶例如蛋白酶3(PR3)、髓过氧化物酶(MPO)和细菌通透性因子(BPI)等蛋白抗原提纯的原料，在医学临床检验上有着非常大的意义。
本发明提供了一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，步骤包括：
S1、原材料初级处理：采用缓冲液洗脱原材料中的白细胞，洗脱液离心，弃上清保留白细胞层，向白细胞层中加入红细胞裂解液后低速离心，抽滤得到白细胞富集沉淀；所述原材料为废弃的人输血白细胞过滤器；
S2、提取组织沉淀：用白细胞裂解液作为缓冲液裂解并洗涤白细胞富集沉淀，将洗涤过的白细胞富集沉淀加氮气裂解，得到白细胞全细胞裂解溶液；将白细胞全细胞裂解溶液低速离心后取上清液并加入密度梯度分离生物颗粒溶剂分离细胞组织液；将细胞组织液高速离心，获取嗜天青颗粒细胞组织沉淀层。
本发明提供了一种从人输血白细胞过滤器中获取白细胞的方法以及从白细胞中获取天青颗粒组织沉淀并去除其他非目标细胞组织的方法，该方法以人体输血白细胞过滤器为原材料实现了高活性中性粒细胞嗜天青颗粒的量产化，可为之后的天然抗原纯化打下良好的基础。本方法中所提及的去白细胞过滤器(滤白盘)为中心血站血液成分科提取医用输血成分后的废弃物，且所对应的血液必须为中心血站检验科检验无以下成分的正常人血：乙肝表面抗原、C型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、C型肝炎病毒RNA、艾滋病病毒RNA以及梅毒病原体。提取白细胞后，所有滤白盘及实验产生的相关废物全部经高温高压灭菌炉灭菌处理，并交由有资质的医疗废弃物回收公司统一处理。
优选的，步骤S1中所述采用缓冲液洗脱原材料中的白细胞的步骤包括：利用高压注射冲洗设备采用缓冲液对原材料进行冲洗，冲洗方向为原材料在过滤白细胞过程中血液流动方向的反向。
优选的，步骤S1中，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的成分是1-2mMKH2PO4,10-20mM NaH2PO4,0.1-0.2M NaCl,2-3mM KCl。
优选的，步骤S1中，所述红细胞裂解液成分是0.1-0.2M NH4Cl,8-10mM KHCO3,pH7.0-7.5。
更加优选的，步骤S1中，所述红细胞裂解液添加量为细胞层总体积的三倍；步骤S1中，所述洗脱液离心为转速3800～4200rpm下离心25～35分钟，所述低速离心为转速900～1100rpm离心4～6分钟。
优选的，步骤S2中，所述白细胞裂解液成分是10-20mM Tris-HCl,PH6.5-7.0,1.0-2.0mM NaCl,0.1-0.2M KCl,3-4mM MgCl2。
优选的，步骤S2所述密度梯度分离生物颗粒溶剂为质量浓度20-50％碘海醇溶液。
优选的，步骤S2中，所述低速离心为转速1400～1600rpm下离心3～7分钟；步骤S2中，所述高速离心为转速12000～15000rpm下离心10～30分钟。
优选的，步骤S2中，所述加氮气裂解条件为：氮气增压至400-600psi，温度4-8℃下裂解30-40分钟。
本发明的有益效果是：本发明开发出了一套以输血废弃物白细胞过滤器为原料，从中回收分离中性粒细胞进而提取嗜天青颗粒的方法，该方法不仅无需占用稀缺的血液资源，还响应国家“输血废弃物回收再利用”的号召，达产后还能作为原料用于多种蛋白抗原的提纯，进而为人类的医学临床研究及疾病体外诊断事业做贡献，实属我国现今大力提倡的科研创新，服务于民的方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中电泳胶结果图；
图2为实施例3中蛋白胶转印结果图；
图3为本发明所述人输血白细胞过滤器结构示意图。
具体实施方式
本发明利用高压冲洗机器对输血白细胞过滤器进行冲洗获得白细胞，之后利用红细胞裂解液去除红细胞和白细胞裂解液在氮气增压设备中裂解白细胞，以及添加密度梯度分离生物颗粒溶剂离心分离细胞组织获得目标细胞组织。因含杂蛋白较少，所提取的嗜天青颗粒能够直接作为PR3,BPI等抗原纯化的初级原料，在医学临床检验上有着非常大的意义。
本发明采用的原材料为人体输血后废弃医疗用品，回收的人输血白细胞过滤器，该白细胞过滤器的结构如附图3所示，从图3可以看出人输血白细胞过滤器由采血器、去白细胞滤器与血液成分分离系统三大部分连接构成，其中从上至下主要包括穿采血针、血袋、导管、滴斗、止液夹、白细胞滤器等。白细胞过滤利用重力的原理，使全血血液从血液入端进入白细胞过滤器，通过过滤器中的白细胞过滤膜再由血液出口端流出。在实施本发明时，采用缓冲液对人输血白细胞过滤盘进行冲洗，冲洗方向为人输血白细胞过滤盘在过滤白细胞过程中血液流动方向的反向，即缓冲液从血液出口端到血液入端的方向进行冲洗。
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例共使用630人份从中心血站回收的白细胞过滤器。经初级洗脱得到血细胞混合物后，再通过裂解红细胞去除混合物中的红细胞，经离心洗涤得到白细胞富集沉淀后，再通过氮气增压装置裂解白细胞富集沉淀得到的白细胞裂解液，最后向其中加入密度梯度分离生物颗粒溶剂后离心分离得到中性粒细胞嗜天青颗粒组织沉淀33.2g。具体实施步骤如下：
1、获取中性粒细胞嗜天青颗粒的原材料来自人输血白细胞过滤器。此过滤器属于人体输血后废弃医疗用品。此人血白细胞过滤器要求保存在4℃-8℃的环境内直至使用。
2、用剪刀剪开过滤器两头的血液导管，保留白细胞过滤膜盘部分。根据过滤白细胞过程中血液流动的方向，反向用PBS缓冲液将输血白细胞过滤器中的白细胞通过高压注射冲洗设备从膜盘中洗脱出来。PBS缓冲液使用量为每套过滤膜20毫升。所述PBS缓冲液的成分是1.8mM KH2PO4,10mM NaH2PO4,0.137M NaCl,2.7mM KCl。
3、随后用高压充气机将过滤器中剩余的缓冲液冲出，保证尽可能多的白细胞被洗脱出来。
4、将洗脱的富含白细胞的PBS缓冲液放入低速离心机中离心。所述离心速度为4000rpm,30分钟。抛弃上层上清液，尽量保留中层白细胞层。
5、配置氯化铵红细胞裂解液并按裂解液：白细胞层＝3:1的体积比与上述保留细胞层混合于离心机底瓶中，置入低速离心机中以1000rpm的速度离心5分钟。此步骤将白细胞层中夹杂的红细胞裂解并通过离心将其与白细胞分离。所述红细胞裂解液的成分是0.1MNH4Cl,8mM KHCO3。
6、用玻璃抽滤装置抽取上清液并抛弃，得到底层白细胞富集沉淀。
7、用白细胞裂解液作为缓冲液裂解并洗涤白细胞富集沉淀。所述白细胞裂解液的成分为20mM Tris-HCl,PH7.5,1mM NaCl,0.1M KCl,3.0mM MgCl2。
8、将洗涤过的白细胞富集沉淀和白细胞裂解液以1:2.5的体积比加入白细胞裂解装置(氮气增压炸弹装置，美国PALL公司生产)加氮气裂解，所述氮气裂解条件为：氮气增压至500psi，温度6℃下裂解35分钟，获取白细胞全细胞裂解溶液。
9、将白细胞全细胞裂解溶液用低速离心机1500rpm离心5分钟后取上清液并以上清液：密度梯度分离生物颗粒溶剂＝3:1的体积比加入密度梯度分离生物颗粒溶剂(Axis-Shield公司生产)分离细胞组织液。所述密度梯度分离生物颗粒溶剂的成分为质量浓度25％Nycodenz(碘海醇)。
10、将加入25％Nycodenz的细胞组织液用高速离心机进一步离心最终获取嗜天青颗粒细胞组织沉淀层33.2g。所述离心转速为12000rpm，时间为10分钟。所得嗜天青颗粒细胞组织沉淀层能够直接作为PR3,BPI等抗原纯化的初级原料，可-80℃保存备用以保证抗原活性。
实施例2
本实施列对实施列1提取的嗜天青颗粒细胞组织沉淀层的成分进行了分析验证，验证过程如下：研磨并溶解0.1g的实施例1分离提取的嗜天青颗粒细胞组织沉淀层，在研磨均匀后，对细胞研磨溶液进行成分的分析验证。验证方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯蓝染色，之后采用BioRad的ChemiDoc MP成像仪扫描后对电泳胶结果进行分析。检测结果如图1所示，根据蛋白酶3(PR3)的分子量(29-33kD)、髓过氧化物酶(MPO)的分子量(59kD)和细菌通透性因子(BPI)的分子量(55kD),可以从图1的蛋白胶结果推断出中性粒细胞嗜天青颗粒研磨溶液中至少含有此三种蛋白抗原。虽然其中还有少量其他蛋白杂质，但中性粒细胞嗜天青颗粒研磨溶液可被作为PR3,MPO及BPI等抗原纯化的起始蛋白溶液原料。
实施例3
本实施列对实施列2中蛋白胶分析得到的结果进行进一步定性验证。验证方法为蛋白胶转印及蛋白免疫印记法(Western Blotting),所用初级抗体分别为兔源多克隆抗MPO抗体(1：1000，Jackson)，及兔源多克隆抗PR3抗体(1:300,Jackson)。检测结果如图2所示，从图2中可以清晰看到中性粒细胞嗜天青颗粒研磨溶液中至少含有此MPO,PR3两种蛋白抗原，证明其可作为MPO,PR3抗原纯化的起始蛋白溶液原料。
实施例4
本实施例共使用513人份从中心血站回收的白细胞过滤器。经初级洗脱得到血细胞混合物后，再通过裂解红细胞去除混合物中的红细胞，经离心洗涤得到白细胞富集沉淀后，再通过氮气增压装置裂解白细胞富集沉淀得到的白细胞裂解液，最后向其中加入密度梯度分离生物颗粒溶剂后离心分离得到中性粒细胞嗜天青颗粒组织沉淀30.8g。具体实施步骤如下：
1、中性粒细胞嗜天青颗粒分离自人血白细胞过滤器。此过滤器来自人体输血后废弃医疗用品。此人血白细胞过滤膜要求保存在4℃-8℃的环境内直至使用。
2、用剪刀剪开过滤器两头的血液导管，保留白细胞过滤膜盘部分。根据过滤白细胞过程中血液流动的方向，反向用PBS缓冲液将输血白细胞过滤器中的白细胞通过高压注射冲洗设备洗脱出来。PBS缓冲液使用量为每套过滤膜35毫升。所述PBS缓冲液的成分是2.0mM KH2PO4,10mM NaH2PO4,0.137M NaCl,2.7mM KCl。
3、随后用高压充气机将过滤器中剩余的缓冲液冲出，保证尽可能多的白细胞被洗脱出来。
4、将洗脱的富含白细胞的PBS缓冲液放入低速离心机中离心。所述离心速度为4000rpm,35分钟。抛弃上层上清液，尽量保留中层白细胞层。
5、配置氯化铵红细胞裂解液并按3:1的比例与上述保留细胞层混合于离心尖底瓶中，置入低速离心机中以1500rpm的速度离心5分钟。此步骤将白细胞层中夹杂的红细胞裂解并通过离心将其与白细胞分离。所述红细胞裂解液的成分是0.14M NH4Cl,8.5mM KHCO3。
6、用玻璃抽滤装置抽取上清液并抛弃，得到底层白细胞富集沉淀。
7、用白细胞裂解液作为缓冲液裂解并洗涤白细胞富集沉淀。所述白细胞裂解液的成分为15mM Tris-HCl,PH7.5,1.5mM NaCl,0.1M KCl,2.5mM MgCl2.
8、将洗涤过的白细胞富集沉淀和白细胞裂解液以1:3的比例加入白细胞裂解装置(氮气增压炸弹装置，美国PALL公司生产)加氮气裂解，所述氮气裂解条件为：氮气增压至550psi，温度7℃下裂解35分钟，获取白细胞全细胞裂解溶液。
9、将白细胞全细胞裂解溶液用低速离心机1600rpm离心10分钟后取上清液并以4:1的比例加入密度梯度分离生物颗粒溶剂(Axis-Shield公司生产)分离细胞组织液。所述密度梯度分离生物颗粒溶剂的成分为22％Nycodenz。
10、将加入22％Nycodenz的细胞组织液用高速离心机进一步离心最终获取富含嗜天青颗粒细胞组织沉淀层30.8g。所述离心转速为14000rpm，时间为15分钟。
本实施例所得嗜天青颗粒细胞组织沉淀层在产量上与实施例1基本一致，所得嗜天青颗粒细胞组织沉淀层能够直接作为PR3,BPI等抗原纯化的初级原料，可-80℃保存备用以保证抗原活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤包括：
S1、原材料初级处理：采用缓冲液洗脱原材料中的白细胞，洗脱液离心，弃上清保留白细胞层，向白细胞层中加入红细胞裂解液后低速离心，抽滤得到白细胞富集沉淀；所述原材料为废弃的人输血白细胞过滤器；
S2、提取组织沉淀：用白细胞裂解液作为缓冲液裂解并洗涤白细胞富集沉淀，将洗涤过的白细胞富集沉淀加氮气裂解，得到白细胞全细胞裂解溶液；将白细胞全细胞裂解溶液低速离心后取上清液并加入密度梯度分离生物颗粒溶剂分离细胞组织液；将细胞组织液高速离心，获取嗜天青颗粒细胞组织沉淀层。
2.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S1中所述采用缓冲液洗脱原材料中的白细胞的步骤包括：利用高压注射冲洗设备采用缓冲液对原材料进行冲洗，冲洗方向为原材料在过滤白细胞过程中血液流动方向的反向。
3.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S1中，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的成分是1-2mM KH2PO4,10-20mM NaH2PO4,0.1-0.2M NaCl,2-3mM KCl。
4.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S1中，所述红细胞裂解液成分是0.1-0.2M NH4Cl,8-10mM KHCO3,pH 7.0-7.5。
5.如权利要求4所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S1中，所述红细胞裂解液添加量为细胞层总体积的三倍；步骤S1中，所述洗脱液离心为转速3800～4200rpm下离心25～35分钟，所述低速离心为转速900～1100rpm离心4～6分钟。
6.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S2中，所述白细胞裂解液成分是10-20mM Tris-HCl,PH6.5-7.0,1.0-2.0mMNaCl,0.1-0.2M KCl,3-4mM MgCl2。
7.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S2所述密度梯度分离生物颗粒溶剂为质量浓度20-50％碘海醇溶液。
8.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S2中，所述低速离心为转速1400～1600rpm下离心3～7分钟；步骤S2中，所述高速离心为转速12000～15000rpm下离心10～30分钟。
9.如权利要求1所述的从人体输血废弃物中提取中性粒细胞嗜天青颗粒的方法，其特征在于：步骤S2中，所述加氮气裂解条件为：氮气增压至400-600psi，温度4-8℃下裂解30-40分钟。
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