CN106075626A - 一种艾滋病血液净化治疗仪 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种艾滋病血液净化治疗仪，包括能分离血浆、单个血细胞和因寄居HIV而形成的多核巨细胞的血液和血浆分离器，包含能结合HIV的HIV抗体、CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株的净化器，当血液流经分离器时，含有HIV的多核巨细胞被滤除，所分离的血浆流经净化器时，其中的HIV被净化剂吸附清除，净化后的血浆与分离器所分离的单个血细胞汇合后回输体内，从而达到清除血细胞内、外HIV的艾滋病血液净化治疗的目的。

Description

一种艾滋病血液净化治疗仪

技术领域

本发明涉及一种艾滋病血液净化治疗仪，主要用于艾滋病患者血细胞内、外艾滋病毒的清除，从而达到预防、控制和治疗艾滋病的目的。

背景技术

HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以仅依靠自身免疫功能无法将其清除。另外一个很重要的原因应该是，根据抗体杀灭、清除抗原的机理推测，免疫性抗体与抗原结合后，要产生免疫效应，要么通过激活补体，介导ADCC效应溶解细胞性抗原，但HIV不是细胞性抗原；要么通过趋化作用吸引吞噬细胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬细胞内被保护、增殖；要么抗体与抗原结合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原结构多变，往往使抗体难以识别。

从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染HIV的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)HIV整合酶抑制剂：通过抑制HIV病毒DNA与宿主细胞DNA整合而发挥作用，与HIV逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制HIV病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与CD4结合、阻断HIV与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于T淋巴细胞表面CC趋化因子受体5(CCR5)来阻断HIV进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节T细胞动态平衡。(6)HIV疫苗治疗：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：HIV基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、RNA诱饵、RNA干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入Ⅱ期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调CD4+T细胞表面CCR5来降低HIV的易感性、延缓艾滋病的进展和减少HIV的扩散，中和单克隆抗体2G12、2F5和4E10应用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养HIV自体的CD4+T细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的CD4+T细胞数量，而回输CD4+T细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。

凝胶中抗原-抗体沉淀反应于1905年首先应用于研究利泽甘氏现象，1932年应用于鉴定细菌菌株，1946年Oudin在试管中进行免疫扩散试验，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分别建立了琼脂双向双扩散法，用于同时鉴定、比较两种以上抗原或抗体。凝胶中抗原-抗体沉淀反应的介质凝胶琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小，基本上呈自由扩散形式。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，这种沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡在免疫学上与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的那些分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。此种反应称为琼脂凝胶或免疫扩散，是目前用已知抗体检测未知量相应抗原的常规实验诊断项目，也是《中国药典》2010版中规定用于流感病毒疫苗血凝素含量检测的标准方法。通常将一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人Ig抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待检血清在琼脂板中向四周扩散，在抗原和抗体浓度比例合适处发生结合，形成肉眼可见的白色沉淀环而不再扩散。由此可见，当一种溶液通过半固体凝胶时，其中的大分子溶质就被分子筛作用的凝胶孔阻留在凝胶中，特别是其中的抗原能被预先固定在凝胶中的抗体结合而被吸附在凝胶中。

CD4分子是HIV的受体，HIV易感于CD4+T细胞，CD4+T细胞是T淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，但某些T细胞特别是经永生化成细胞系(株)后可长期存活、无限扩增。国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Ad12-SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。国外研究还表明，导入外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对正常的生长特征。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型等。所以，可制备CD4+T细胞株，经大量培养后，用于制备治疗艾滋病的净化器，以CD4+T细胞吸附、清除血浆中的HIV，同时通过输给CD4+T细胞产生的细胞因子来治疗艾滋病。

人类的吞噬细胞有大、小两种，小吞噬细胞是外周血中的中性粒细胞，大吞噬细胞是血中的单核细胞和多种器官、组织中的巨噬细胞，两者构成单核吞噬细胞系统。单核细胞由骨髓中的单核细胞前体发育分化而成，约占血液中白细胞总数的3％一8％，其体积较淋巴细胞略大，单核细胞在血液中仅停留12—24小时，然后进入结缔组织或器官，发育成熟为巨噬细胞，巨噬细胞是单核吞噬细胞系统中高度分化、成熟的细胞类型，具有较强的吞噬功能，游走巨噬细胞大于单核细胞数倍，寿命较长，可在组织中存活几个月，定居的巨噬细胞有不同的名称，在肝中为枯否细胞、在脑中为小胶质细胞、在骨中为破骨细胞等，其表达Fc受体、C3b受体和CD14，在固有免疫中发挥防御功能，也是参与适应性免疫的专职抗原提呈细胞。巨噬细胞表达的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受体，HIV进入人体后，首先遭到巨噬细胞的吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内大量繁殖聚集，转而将HIV传递给CD4+T细胞。所以，可以常规杂交瘤细胞制备技术，制备巨噬细胞杂交瘤细胞，经大量扩增后用于制备治疗艾滋病的净化器，以巨噬细胞的吞噬功能来清除血浆中的HIV。

总之，各种药物及生物制品无法有效杀灭体内的艾滋病毒，且价格贵，副作用大，至今尚无治疗艾滋病的有效方法，已成为久攻不克的世界性难题。

发明内容

为了解决久攻不克的艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明提出了一种艾滋病血液净化治疗仪。

本发明的目的是这样实现的：一种艾滋病血液净化治疗仪，包括依次连接的血液分离器、血浆分离器和净化器；待净化的血液经血液分离器分离后，滤去多核巨细胞，而中小体积血细胞及血浆进入血浆分离器；血浆分离器将中小体积血细胞及血浆进行分离，分离出的血浆经两个或两个以上并联净化器净化后，与血浆分离器分离出的中小体积混合后，完成净化；所述净化器进出口均设有细胞筛网，净化器内设置有多层由琼脂凝胶和净化细胞组成的净化层，多层净化层构成净化柱；所述净化细胞由能结合HIV的CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株按照数量比1：0.5～3组成；每一层中，细胞占总体积的4/5；所述琼脂凝胶包含游离的HIV抗体、结合于羊抗Ig的HIV抗体、琼脂糖；从净化器的进口处至出口处，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均从高到低依次递减，琼脂糖浓度从低到高依次递增；每一层中，净化细胞占总体积的4/5，或净化细胞占净化柱总体积的4/5。

进一步地，所述血液分离器通过微孔滤膜实现细胞分离，微孔直径为1～250μm；所述中小体积血细胞为直径小于微孔直径的细胞，或能滤过微孔的细胞。

进一步地，所述血浆分离器的空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。

进一步地，所述净化器进口处筛网的目数为800目，出口处筛网的目数为2.0～5.0目。

进一步地，所述净化器中净化层的层数为5层，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均从高到低，依次为1：100、1：200、1：300、1：500、1：700。

进一步地，所述净化器中净化层的层数为5层，琼脂糖浓度从低到高，含量依次为0.7g/100ml、0.8g/100ml、0.9g/100ml、1.0g/100ml、1.1g/100ml。

进一步地，所述能结合HIV的CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株的数量比为1：0.5～3。

进一步地，所述HIV抗体由HIV-1gp120抗体、HIV-1gp41抗体中的一种或两种按照任意配比组成。

进一步地，杂交瘤巨噬细胞株通过将瘤细胞和巨噬细胞以细胞融合的杂交瘤技术制备获得。

进一步地，所述净化柱通过以下方法制备得到：

(1)以无菌生理盐水清洗杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株，1000r/min离心，洗净后再次离心沉淀,按杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株之比为1：0.5～3的比例取沉淀细胞，装配高生物相容性材料制成的圆柱形容器内，制成血液净化细胞柱；

(2)将羊抗Ig与过量的HIV抗体混合，使混合液中的羊抗被完全结合，但剩有游离的HIV抗体，且游离的HIV抗体滴度与结合于羊抗Ig的HIV抗体滴度相等；

(3)将琼脂糖经100℃溶化后与一定量的生理盐水混合，保温在39～41℃，加入步骤2获得的抗体混合物，其中，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均为1：700，琼脂糖的含量为1.1g/100ml。

(4)将步骤3配制的产物以体积比1:4加入到步骤1制备的细胞净化柱中，待冷却至半固体凝胶后，完成底层净化层的制备。

(5)重复步骤1～4，从下到上依次完成各层净化层的制备，得到净化柱。且游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均为1：500、1：300、1：200、1：100；琼脂糖的含量依次为1.0g/100ml、0.9g/100ml、0.8g/100ml、0.7g/100ml。

本发明的有益效果在于：本发明将能滤除多细胞结合而成的含有HIV的大体积细胞的血液分离器、能分离单个血细胞和血浆的血浆分离器、以及能对血浆中HIV病毒进行高效净化的净化器结合，实现对血液的高度净化。

净化器中的净化剂由固定于净化层的HIV抗体、与羊抗Ig结合的HIV抗体、CD4+T细胞株和巨噬细胞株制成，其中与羊抗Ig结合的HIV抗体其结合物的分子量比未结合的HIV抗体分子量大，不易通过凝胶分子筛，以及所含羊抗Ig易与琼脂凝胶固定结合的特点，HIV抗体也随之更易被固定于琼脂凝胶，血浆中的HIV与被固定于琼脂凝胶的HIV抗体相遇时会发生结合反应而形成抗原抗体复合物，从而通过HIV抗体被固定于琼脂凝胶，因CD4+T细胞表面的CD4分子是HIV的受体而成为HIV的易感细胞，与HIV相遇时能吸附HIV，被吸附的HIV随CD4+T细胞被固定于琼脂凝胶，因杂交瘤巨噬细胞的天然吞噬特性，HIV与之相遇时能被吞噬而随之被固定于琼脂凝胶，这些成份均具有吞噬和/或结合吸附HIV的功能，而且琼脂凝胶所形成的滤孔随着琼脂糖浓度的增高而减少，净化器进口处琼脂糖浓度低，滤孔就大，有利于血浆灌流及高滴度抗体或细胞与HIV的结合反应；而出口处浓度高，滤孔就小，易于阻留HIV或大分子结合物，净化器组合了多种特异和非特异的HIV清除成份，以免特种毒株因免疫差异所致的无效治疗，所以在艾滋病血液净化治疗的体外循环中，含有大量HIV的大体积细胞首先被血液分离器滤除，而血浆中游离的HIV被血液净化器吸附清除，净化后的血浆与血液分离器分离得到的单个血细胞汇合后回流体内，从而达到清除结合在细胞表面和/或细胞内的HIV以及游离于血浆的HIV的目的。

附图说明

图1是根据本发明提出的艾滋病血液净化治疗仪的应用示意图。

图2是根据本发明提出的血液分离器的内部结构图。

图3是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构图。

图4是根据本发明提出的净化器的内部结构图。

图1中，动脉血路管1、肝素和血液泵2、血液分离器3、血液出口4废液出口5、血液泵6、循环管路7、血浆分离器8、血浆泵9、血路管10、净化器11和12相连，出口管路13、血细胞出口管路14、静脉管路15。

图2表示图1中的血液分离器的内部结构。图2中，分离器的内腔302、微孔303、多核巨细胞304、血细胞305、外腔306、出口307。

图3表示图1中的血浆分离器的内部结构。图3中，802是血浆分离器内腔，803是血浆分离器内腔管壁上的微孔，804是不能通过微孔803的单个血细胞，805是能通过微孔803的血浆化学成份，806是血浆分离器外腔，807是血浆流出口，808是具有可开关阀门的血细胞出口。

图4中，102、104、106分别为HIV抗体、巨噬细胞、CD4+T细胞；101是游离的HIV；103、105、107分别为HIV与HIV抗体、巨噬细胞、CD4+T细胞结合后而被阻留在琼脂凝胶108中的结合物，109为被琼脂凝胶108分子筛阻留的较大体积的HIV。

具体实施方式

下面结合图1、图2、图3和图4，对本发明提出的艾滋病血液净化治疗仪作详细的描述。

一、艾滋病血液净化剂的制备

(一)杂交瘤巨噬细胞株的制备

1、原代细胞来源

(1)单个核血液细胞：指以密度梯度离心法从血液中分离的淋巴细胞和单核巨噬细胞。具体方法是：购买血液中心的浓缩白细胞或为科研而保存的脐带血，取2mL标本，PBS液将血液稀释2～3倍，充分混匀后将6mL抗凝血用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min,20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为PBMC，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另一50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min,20℃)10min，弃上清50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min,20℃)15min，弃上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重悬细胞，取15uL细胞悬液加入血球计数板上显微镜下计数4个大方格内的细胞(PBMC)总数。

(2)单个核组织细胞：由浙江大学组织工程研究平台提供。实质上属于来自脾脏的巨噬细胞，其制备方法是：①脾脏组织的获取和转运：在论理委员会批准和患者知情同意下，取手术切除的脾脏标本组织，立即剪碎成体积约1mm³的小组织块，移入装有预冷4℃的无菌密封瓶内，迅速转运至细胞培养室。②脾脏组织细胞混悬液的制备：将脾脏组织块移至无菌操作台，PBS洗涤3次，RPMI-1640洗涤2次，以清除组织内的血液并保证组织的无菌。机械研磨脾脏组织，这时便有大量的组织细胞悬混于RPMI-1640液中。用200目不锈钢滤网过滤悬混有组织细胞的RPMI-1640液，滤液为脾脏组织细胞混悬液(主要含红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等)。③脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗涤离心(1000r/min,3min)，以去除细胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解红细胞，迅速离心(1000r/min,3min)，去除上清液内的裂解红细胞碎片，PBS洗涤离心3次，RPMI-1640洗涤离心1次，以清除混悬液中残存的Tris-NH4Cl，避免其影响细胞的存活，此时，混悬液中主要含脾脏组织巨噬细胞和淋巴细胞。④脾脏组织巨噬细胞的贴壁培养：将前述混悬液作为培养细胞原液，台盼蓝染色判定活力并计数，用RPMI-1640液调整细胞浓度为(3～5)×10⁶/L，将调整好浓度的细胞悬液接种于玻璃培养瓶内，培养条件为37℃，50mL/LCO₂，100％湿度，分别培养2～3h，相差显微镜下观察形态。贴壁脾脏组织巨噬细胞的消化：贴壁脾脏组织巨噬细胞的消化：吸去培养上清液，巨噬细胞贴壁，PBS反复吹打、消化，所得细胞悬液洗涤离心(1000r/min,3min)，得到分离纯化的巨噬细胞。此外，还可以取治疗或手术后废弃的标本提取制备，如腹膜腔液、肺泡、肝脏、脾脏、腹膜组织、小肠黏膜等。

(3)羊水、绒毛细胞：浙江大学附属妇产科医院生殖遗传实验室备用。在论理委员会批准和患者知情同意下，取实验诊断报告后的剩余羊水、绒毛细胞，选择对数生长期细胞留用。

2、细胞培养及巨噬细胞贴壁初步分选

按常规细胞培养，但根据细胞性质的不同，适当调整培养时间，培养条件等，一般贴壁法将单个核血液细胞(PBMC)或单个核组织细胞(巨噬细胞)置于含有RPMI—1640培养基的培养皿中，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱(Themo electro corporation CLASS 100，美国)中孵育2h，待单个核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞(巨噬细胞以外的细胞不易贴壁而随上层液除去)，PBs缓冲液轻轻洗涤3遍，加入少量RPMI一1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞(主要为巨噬细胞，但还有少量其他贴壁细胞)。1 000r/min离心5min，弃上清。羊水细胞、绒毛细胞培养1～7天，出现细胞生长克隆、细胞生长汇合率达到60～80％的对数生长期细胞，以胰酶消化，PBS清洗，获取细胞悬液，配成合适细胞浓度。

3、CD4细胞分选

采用免疫磁珠法分选CD4细胞：①主要试剂和仪器：CD4免疫磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；0.2％台盼蓝染色液(上海生工生物工程技术服务公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分离系统(德国美天旎生物技术有限公司)。②CD4细胞免疫磁珠分选方法：细胞悬液均分至两个1.5mLEppendorf管，离心(300r/min,20℃)10min，弃去上清，重悬细胞每80uLBuffer含细胞数10⁷个,每10⁷个细胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混匀，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗涤细胞，离心(300r/min,20℃)10min，弃去上清500uLBuffer重悬细胞，将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500uLBuffer漂洗，将500uL细胞悬液通过分离柱，用500uLBuffer冲洗分离柱重复操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4细胞，自分离器中取出分离柱，用1000uLBuffer加压冲洗分离柱，收集流出液，此为CD4细胞(细胞活力检测：细胞纯化前后分别取15uL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合,显微镜下观察不着色发亮者为活细胞,着色胀大者为死细胞,计算200个细胞中活细胞的百分比)。此时分选的细胞主要为巨噬细胞。

4、CD14细胞(巨噬细胞)分选

CD14为单核细胞和巨噬细胞特有的表面标志，理论上如果从单个核组织细胞、羊水细胞及绒毛细胞中分选，则所得细胞为巨噬细胞；如果从单个核血液细胞中分选，则所得细胞包括单核细胞和巨噬细胞；但因单核细胞寿命短、仅在外周血中存活1天且远不如巨噬细胞易于贴壁生长，所以在本发明的细胞贴壁培养中已基本除去，分选出来的细胞基本为巨噬细胞。

基本方法类同于CD4细胞，采用免疫磁珠法。①试剂：人CDl4免疫磁珠试剂盒(Miltenyi Biotec，德国)，RPMI－1640培养基(Hyclone，美国)；②免疫磁珠法：(A)磁珠与特异性靶细胞一单核细胞结合：每1×10⁸个PBMC加入200uL偶联CDl4抗体的磁珠和800uL缓冲液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱预冷)，在15mL离心管中充分混匀，4℃孵育15min，中间可轻微振摇1次。15min后取出离心管，每1×10⁷个细胞加入1～2mL预冷缓冲液，1000r/min，离心8min，弃上清，加入O.5mL缓冲液并吹打成单细胞悬液。(B)收集磁珠标记的单核细胞：将细胞分离柱置于MACS磁力架上，加入lmL缓冲液平衡细胞分离柱，待无液体滴下，立即将上述细胞悬液加人细胞分离柱中，用0.5mL缓冲液冲洗细胞分离柱3次。待冲洗完毕后，加入1mL缓冲液，从磁力架中移出细胞分离柱，用针柱快速推动，冲出在分离柱中与CDl4抗体一磁珠相结合的细胞，即为CDl4+的巨噬细胞。

此外，还可采用以下2种方法分选，包括①贴壁法：将PBMC置于含有RPMI—1640培养基的培养皿中，于37℃，含5％C0：的细胞培养箱(Themo electro corporation CLASS100，美国)中孵育2h。待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBs缓冲液轻轻洗涤3遍，加入少量RPMI一1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。1 000r/min离心5min，弃上清。②流式细胞术法：CDl4标记：取PBMC，用缓冲液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA0.5mL)调整细胞密度为1×10⁸/mL,在每毫升细胞悬液中加入CDl4+－FITC抗体100uL，4℃避光标记18min，再向离心管中加入1mL流式缓冲液以终止染色，PBs洗涤3次，用含2％青链霉素的PBS调整细胞密度为2×107/mL。流式细胞仪分选：将制备的细胞在流式细胞仪(BDFAcsAria II，美国)上分选，根据CDl4抗体的荧光强度、细胞的相对大小以及细胞的相对颗粒性和内部结构的复杂性，收集CDl4+的细胞。

5、CD14杂交瘤细胞株(杂交瘤巨噬细胞株)制备

(1)培养基及主要试剂:DMEM培养基、HAT、HT选择培养基购自Sigma公司,优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂。

(2)骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI－H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/m离心5-10min,重复洗涤细胞2次。

(3)待杂交CD14细胞(巨噬细胞)准备：本发明分选的单核巨噬细胞以基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合。以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

(4)细胞融合：将CD14细胞(单核巨噬细胞)与骨髓瘤细胞以10:1-5:1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HA T培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

(5)具有吞噬功能的单核巨噬细胞株筛选:观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择有生长状态良好的杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃,5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测杂交瘤巨噬细胞(Mφ)株功能。

①杂交瘤巨噬细胞株吞噬细菌功能检测：将巨噬细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合温育，涂片，固定，碱性亚甲兰液染色，在油镜下观察吞噬情况，计数吞噬细菌和未吞噬细菌的巨噬细胞数比例，以吞噬细菌功能强的巨噬细胞作为备选阳性克隆株。

②杂交瘤巨噬细胞株吞噬HIV功能检测：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血浆与杂交瘤巨噬细胞株混合培养后，分离细胞株，PBS清洗3次，测定经裂解的吞噬细胞株吞噬HIV的功能，具体根据HIV－1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性。具体按试剂盒说明书操作。

③杂交瘤巨噬细胞株产生巨噬细胞因子检测：以人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)按说明书操作，检测范围为0～800pg/ml,敏感度为1.0pg/ml,可在白色背景下，直接用肉眼观察：反应孔内颜色越深，阳性越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，具体按试剂盒说明书操作。MIF是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作为固有免疫和炎症反应的调节因子发挥中枢性的作用，在各种感染和急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。

根据检测结果，挑选具有较强巨噬细胞功能的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测功能稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

(6)杂交瘤巨噬细胞株的保存与复苏:保存前12小时调整细胞生长状态，取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/min离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/min离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/min离心5min，弃去上清，以备作扩大培养。

6、杂交瘤巨噬细胞株治疗细胞制备

即杂交瘤巨噬细胞株的扩增培养。将上述细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。反复传代扩增培养，直至所需的杂交瘤细胞株数量，每传代培养阳性杂交瘤细胞株10代，检测巨噬细胞杂交瘤细胞株的功能，观察是否稳定。继续在数瓶内进行大规模产业化制备，保存备用。

(二)CD4+T细胞株的制备

1、原代淋巴细胞的来源

有以下种途经：①用于科研保存的传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴细胞)；②购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；③从商家直接购买的T淋巴细胞系(株)；④用于科研保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；⑤直接取自HIV-1感染者的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)。

2、CD4+T细胞的制备

①主要试剂与仪器：CD4、CD8免疫磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；异硫氰酸荧光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴细胞分离液(上海恒信生化试剂有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％台盼蓝染色液(上海生工生物工程技术服务公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分离系统(德国美天旎生物技术有限公司)；EpicsXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)。②单个核细胞(PBMC)的分离：按密度梯度离心法分离。③CD4+T细胞和CD8+T细胞的分离纯化：PBMC细胞悬液均分至两个1.5mLEppendorf管，离心(300r/min,20℃)10min，弃去上清，重悬细胞每80uLBuffer含细胞数10⁷个,每10⁷个细胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混匀，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗涤细胞，离心(300r/min,20℃)10min，弃去上清500uLBuffer重悬细胞，将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500uLBuffer漂洗，将500uL细胞悬液通过分离柱，用500uLBuffer冲洗分离柱重复操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴细胞或非CD8+T淋巴细胞，自分离器中取出分离柱，用1000uLBuffer加压冲洗分离柱，收集流出液，此为CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞(细胞活力检测：细胞纯化前后分别取15uL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合,显微镜下观察不着色发亮者为活细胞,着色胀大者为死细胞,计算200个细胞中活细胞的百分比)。

3、体外扩增CD4+T细胞

有文献报道利用T细胞表面CD3分子的单克隆抗体作为细胞生长的刺激剂，大量培养艾滋病患者分离的T细胞后，作为自身治疗性细胞回输。但HIV也随着HIV感染细胞的培养繁殖而在胞内增殖，增量T细胞的回输也导致了增量HIV的回输。本发明以SV40和/或hTERT永生化CD4+T细胞，并以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂，大量扩增CD4+T细胞。

以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂的方法是：将抗CD3单抗(CD4+T细胞同时含有CD3分子)包被到培养板上刺激单个核细胞(淋巴细胞)生长，称为抗CD3抗体包被法，可获得很好的扩增效果，应用这种方法扩增的淋巴细胞已用于肿瘤的二期临床治疗并取得了一定的疗效。国外文献报道[Shimizu等]亦用此方法培养了5例晚期艾滋病患者的淋巴细胞，培养4周就可获得1000倍的扩增，且扩增的细胞群中CD4+/CD8+T均可大量扩增(CD4+T细胞更明显)。另一种是抗CD3/CD28双抗交联法，即将抗CD3/CD28双抗交联于滋珠上作为刺激剂培养HIV感染者外周血单个核细胞(淋巴细胞)，可以扩增大量的CD4+T细胞，并且扩增的CD4+T细胞具有对抗HIV感染的能力，其培养过程中病毒也低于检测水平，之后发现这可能与CD28提供了第二信号，选择性诱导分泌大量的Th1细胞因子和趋化因子有关，用此方法扩增的CD4+T细胞已用于HIV感染者的临床治疗回输，无风险但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T细胞的方法是：以内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选的阳性重组子的克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT永生化的CD4+T细胞。

以SV40永生化CD4+T细胞的方法是：以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40永生化的CD4+T细胞。

①以hTERT永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)hTERT的提取：(i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于质粒pClneo-hTERT的EcoRI与SalI位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoRI与XhoI酶切位点。(ii)hTERT电泳：以10％琼脂糖凝胶电泳，分离hTERT片段。(iii)hTERT纯化与回收：将目的hTERT片段从凝胶中分离、纯化出来。(II)hTERT与pLXSNneo载体的连接：构建pLXSNneo-hTERT重组子。(III)纯化、扩增、鉴定pLXSNneo-hTERT重组子。(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI 1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。(VI)pLXSNneo-hTERT重组子导入T淋巴细胞及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将pLXSNneo-hTERT重组子溶于100μl无血清培养液中；管B，将20μl Lipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下静置45min，用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，滴加至上述T淋巴细胞中，加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg^。L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg^。L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养至9-10周(约第75代)，仍处于对数生长期，即细胞增加数量与培养时间呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞。因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡。方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5～10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清后，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：(i)观察细胞形态：可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，具有淋巴母细胞化特征。(ii)观察细胞生长曲线：以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)检查染色体：通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，则说明该细胞系没有发生恶性转化。(iv)流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是hTERT整合、表达的结果。(vii)DNA序列测定：按常规测序仪检测，显示hTERT基因序列。(v)转染细胞DNA中hTERT检测：如以免疫组织化学检测，hTERT转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明hTERT已整合入细胞内；(vi)mRNA表达产物测定：取100μl体系的PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。(VIII)hTERT介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1 200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；—20℃，2h；—70℃，过夜，入—196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的永生化CD4+T细胞库备用。

②以SV40永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)SV40大T抗原DNA的提取：(i)SV40DNA酶切：从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉，溶解于适量TE缓冲液，加2uL10×酶切缓冲液和18uL H₂O，加限制性内切酶BamHⅠ(1－5U/ugDNA),37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液终止反应以备电泳。(ii)SV40DNA电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，在1－10V/cm凝胶的电压下电泳，分离DNA片段。(iii)从琼脂糖中分离约2600bp SV40大T抗原DNA。(II)SV40LT与pcDNA3.1载体的连接：构建SV40T/pcDNA3.1重组子。(III)扩增、分离与鉴定SV40T/pcDNA3.1重组子：(i)制备感受态大肠杆菌。(ii)筛选、扩增与提取重组子。(iii)重组子的鉴定：上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含重组子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI 1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。(VI)SV40T/pcDNA3.1的导入及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将SV40T/pcDNA3.1溶于100μl无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)中；管B，将20μl Lipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45min。用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，再滴加至上述T淋巴细胞中，然后加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg°L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg°L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养约6-8周(约第55代)，仍处于对数生长，即培养时间与细胞增加数量呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：按常规鉴定方法进行。(VIII)SV40LT基因介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；—20℃，2h；—70℃，过夜，入—196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的CD4+T细胞库备用。

(4)与CD4+T细胞相似功能颗粒的制备：可将CD4分子、基因重组的CD4分子及类似功能的分子通过常规化学偶联、交联、亲和吸附等固定于载体上制成包被有CD4分子的颗粒，或直接取用功能相似的颗粒替代CD4+细胞应用。本发明的CD4+T细胞代表其他CD4+细胞，包括用其他方法制备永生化CD4+T细胞。

(三)HIV-1gp120抗体的制备

本发明所涉及的抗体可以委托专业商家制备，或直接从专业商家购买，如上海瑞齐生物科技有限公司及上海领潮生物科技有限公司等单位都专业从事HIV-1gp120抗体、gp41抗体及羊抗人IgG等各种抗体的制备和销售。方法包括杂交瘤技术制备单克隆抗体、EB病毒转化技术制备单克隆抗体、杂交瘤技术与EB病毒转化技术相结合制备单克隆抗体和基因工程抗体，具体列举如下。

1、采用淋巴细胞EB病毒转化与杂交瘤技术相结合制备HIV-1gp120单克隆抗体

标本来源有以下几种途经：取传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV免疫和EBV转染的淋巴细胞)；购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；取自作为科研而保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，调节浓度为2x 10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％C02培养过夜，制备待杂交B细胞，用ELISA方法筛选抗HIV-l外膜蛋白(gpl20)阳性孔，转移细胞至24孔板继续培养2周，重复用ELISA法测定抗gpl20确认阳性者，连续克隆二次并大量扩增培养。将阳性细胞株与人鼠异质骨髓瘤细胞(由浙江大学免疫系购得)混合(3：1)后，加入1ml50％PEG使二者融合，然后重悬细胞在IMDM培养液中培养过液，第二天加入小鼠腹腔细胞(由浙江大学免疫系购得)作为滋养细胞，继续培养3周后用ELISA筛选抗gpl20抗体，挑选强阳性孔杂交瘤细胞扩增培养，并进行多次克隆直至获得稳定的细胞系，以此细胞系培养、制备HIV-1抗体，采用ELISA检测试剂盒,按说明书操作,测定抗体的Ig亚类，并以常规ELISA法测定抗体的效价和特异性，选出特异性强、效价高的抗体。

2、采用基因重组HIV-1gp120结合杂交瘤技术制备抗体

(1)试剂与重组抗原：涉及试剂：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纤维膜条由北京万泰药业公司提供BamHⅠ内切酶Xho Ⅰ内切酶、核酸共沉淀剂、T4DNALigase购自宝生物有限公司；Liagen胶回收试剂盒购自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培养基购自Gibco公司；优级新生牛血清购自明海生物工程有限公司；SupersignalWest PicoTrial Kit、TMB Substrate Kit购自Pierce公司；小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem购自Sigma公司。HIV-抗体诊断试剂盒购自上海科华生物有限公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自博士德有限公司。重组质粒构建及鉴定：载体质粒PEGX-4T-2用BamHⅠ、Xho Ⅰ酶切,T4DNA Ligase连接gp120基因片段,重组质粒转化入大肠杆菌XL1-blue,进行测序。重组蛋白的诱导表达及鉴定：重组质粒转化入XL1-Blue大肠杆菌中,在IPTG诱导剂作用下25℃,190r/min震荡,过夜，4000r/min离心10min,收集细菌，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。融合蛋白纯化和鉴定：表达产物离心收集沉淀经PBS悬起,用30W超声粉碎仪裂解细菌后,将其离心收集上清过滤，滤液用AKTA PURIFYER100蛋白纯化仪、GST柱纯化,得到融合蛋白GST-HIV,浓缩离心管进行浓缩,S21型生物分光光度计测量浓度，SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

(2)动物免疫：BALB/c小鼠6周龄,雌性,4只，免疫前取小鼠静脉血，分离血清留做阴性血清。将50-100μg的GST-HIV融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐剂与融合蛋白乳化后加强免疫小鼠，免疫剂量和途径同前，重复免疫2-3次，最后一次加强免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

(3)单抗检测方法的建立：第三次免疫后一周尾静脉采血，用方阵法确定阳性血清的最佳工作浓度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被浓度。

(4)细胞融合:骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/min离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合前使用适量胰酶消化后使用离心管收集，加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/min离心5-10min,重复洗涤细胞2次。脾细胞准备：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉颈处死，在75％乙醇中浸湿。取出后仰放固定于解剖板上，无菌环境下取脾脏，将脾脏移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基础培养基，用平口镊子反复挤压破碎后，使用无菌注射器反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。计活细胞数后1000r/min离心10min，加入基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合。细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1-5:1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HA T培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

(5)阳性克隆株的筛选:观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，通过之前建立的单抗筛选方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆。采用改进的有限稀释法——梯度有限稀释法连续对间接ELISA初步筛选出的阳性细胞孔进行3-4轮的亚克隆。选择有生长状态良好的阳性杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃,5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞培养上清进行抗体检侧。对检测结果为阳性的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测上清效价稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

(6)杂交瘤细胞株的保存与传代培养:保存与复苏:保存前12小时调整细胞生长状态。取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/m离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/m离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/m离心5min，弃去上清，细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。传代培养阳性杂交瘤细胞连续传10代，采用间接ELISA的方法测定培养上清抗体效价，观察此阳性杂交瘤细胞株是否能稳定分泌抗体。

(7)单抗小鼠腹水的制备:低速离心收集培养后的杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水。采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2-3天，同法取腹水。收集到的腹水，10000r/m离心5min，取上清液分装，-20℃保存。

(8)单抗的特性鉴定:特异性:Weston-Blotting实验参照《分子克隆》方法进行，以半干法转印。

(9)HIV-1gp120单抗经进一步精制后应用(可委托专业商家完成)。

(四)HIV-1gp41抗体的制备(同HIV-1gp120抗体的制备)

(五)羊抗人-Ig的制备

将所制HIV-1gp120抗体和gp41抗体为抗原，免疫羊制备抗体。

1、实验动物：免疫用实验动物选用的是浙江大学动物学院杂交白山羊，体重30斤左右的健康青壮年母羊二只，免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。采用随群圈养的饲养方式，每天保证羊只得到适量的运动，运动时间在傍晚，每次运动大概半小时左右，这样利于身体健壮，避免羊只过肥，增加机体的免疫力，饮水充足，并给予适量的精料、青草、玉米、麸皮、小麦、维生素等等，使其营养均衡。经常查看实验羊只健康状况。

2、HIV-1gp120抗体和gp41抗体为抗原：本发明制备的HIV-1gp120抗体和gp41抗体(IgG)浓度分别为2.5mg/mL(可由商家提供)，接种前混合0.1mL抗原、1.9mL无菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐剂制成免疫原乳剂备用。

3、山羊的免疫：选取两只山羊，标记为山羊A、山羊B，接种抗原(HIV-1gp120抗体和HIV-1gp41抗体)。免疫部位为前后腹股沟，每处腹股沟分2个点注射，总共有8个注射点。注射方式为皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每个注射点注射免疫原0.5mL，约含32μg抗原。免疫前两只山羊分别抽血10mL，标记为0dP1，-20℃保存；第一次免疫即一4、免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+弗氏完全佐剂2mL(CFA)；免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP1，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。3～4周开始第二次免疫，二免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP2，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。第三次免疫时间为6-8周后，三免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP3，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。如果此时血清效价没达到1：10⁶以上，则需要再免一次；如果血清效价已达10⁶以上则不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分离血清，-20℃保存。

4、血清制备：一般每次免疫后7～10天即可于羊颈静脉采血检测。由助手协助保定动物，使其保持站立姿势，颈部剪毛、无菌棉球擦拭消毒后，寻找到颈静脉手持注射器采血，将注射器位置固定取血5-10mL。分离出血清后进行效价检测。在第三次免疫后7～10天，经效价检测合格后一次可取血30-50mL。在无菌条件下分离血清，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境(例如超净工作台)中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出(不能冰冻，否则产生溶血)，经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前须经过签定合格后再分装保存备用。

5、抗血清效价的测定：抗血清效价采用ELISA方法测定，具体按试剂盒说明书进行。

二、艾滋病血液净化器的制备

(1)将gp120和gp41抗体分别与羊抗gp120和gp41抗体混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗体均被完全结合，但剩有足够高滴度的游离的gp120和gp41抗体，然后将含有结合型和游离型gp120抗体的混合抗体以及含有结合型和游离型gp41抗体的混合抗体再次以等效价混合，配成最终混合抗体。

(2)以无菌生理盐水清洗杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株，1000r/min离心，洗净后再次离心沉淀,按杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株之比为1：0.5～3的比例取沉淀细胞，装配在高生物相容性材料制成的圆柱形容器内，制成血液净化细胞柱；

(3)将琼脂糖经100℃溶化后与一定量的生理盐水混合，保温在39～41℃，加入步骤1获得的抗体混合物，其中，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均为1：700，琼脂糖的质量分数为1.1％。

(4)将步骤3配制的产物以体积比1:4加入到步骤1制备的细胞净化柱中，待冷却至半固体凝胶后，完成底层净化层的制备。

(5)在底层凝胶上加入沉淀细胞，然后加入39～41℃下的琼脂抗体混合物，其中，琼脂抗体混合物中，抗体的滴度为1：500，琼脂糖的质量分数为1.0％，琼脂抗体混合物与沉淀细胞的体积比为1:4；待冷却至半固体凝胶后，完成第二层净化层的制备。

(6)在第二层凝胶上加入沉淀细胞，然后加入39～41℃下的琼脂抗体混合物，其中，琼脂抗体混合物中，抗体的滴度为1：300，琼脂糖的质量分数为0.9％，琼脂抗体混合物与沉淀细胞的体积比为1:4；待冷却至半固体凝胶后，完成第三层净化层的制备。

(7)在第三层凝胶上加入沉淀细胞，然后加入39～41℃下的琼脂抗体混合物，其中，琼脂抗体混合物中，抗体的滴度为1：200，琼脂糖的质量分数为0.8％，琼脂抗体混合物与沉淀细胞的体积比为1:4；待冷却至半固体凝胶后，完成第四层净化层的制备。

(8)在第四层凝胶上加入沉淀细胞，然后加入39～41℃下的琼脂抗体混合物，其中，琼脂抗体混合物中，抗体的滴度为1：100，琼脂糖的质量分数为0.7％，琼脂抗体混合物与沉淀细胞的体积比为1:4；待冷却至半固体凝胶后，完成第五层净化层，即顶层净化层的制备，得到净化柱。

血液净化器的规格与材料

血液净化细胞柱或血液净化器为底径小、顶径大的圆柱形，或方形、漏斗形，容积为200～300ml，进出口均设有细胞筛网，进口处顶径筛网目数为800目；出口处底径筛网目数为2.0～5.0目(2.5～5.0目相当于0.1～0.2微米或100～200纳米)，具体可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格，用以阻挡120纳米的HIV病毒或更大的细菌；液体出口处设置目数为100目(相当于4微米)的细胞滤网，用以阻挡可能滤出的细胞；液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

血液净化器选用丙烯酸酯之类的高分子材料，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高生物相容性、减少并发症的发生。在吸附器内表面加亲水凝胶，将2甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-丁基异丁烯酸固化在醋酸纤维素膜上，通过控制湿纺过程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有较高的血液和细胞相容性。将某些具有抗凝作用的物质固化在载体或吸附器内表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，还可降低肝素用量，并有可能实现无肝素化。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。

三、血液分离器的制备

(一)血液分离器的制备

1、制备原理：①血细胞、细菌、病毒的分子大小：人体血液中有形成份(细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。细菌的大小为：球菌的直径约在0.75-1.25μm之间，杆菌长度约在2-5μm，螺旋菌长约100-200μm。病毒的大小以纳米(nm)为单位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒间大小差异很大，最小的如植物的联体病毒(Geminiviruses)直径仅18-20nm，最大的动物痘病毒(Poxviruses)大小达300-450nm×170-260nm，最长的如丝状病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小为80nm×790-14000nm，多数单个病毒粒子的直径在100nm左右，艾滋病毒为100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相关成份：多核巨细胞(HIV感染细胞表面的gp120与CD4+细胞结合而成的大体积的HIV感染细胞)、gp120细胞(表面有gp120但以单个细胞存在的HIV感染细胞)、基因整合细胞(艾滋病感染初期或潜伏期，整合有HIV双链DNA，但细胞表面没有gp120的HIV感染细胞)、正常白细胞(未感染HIV的单个细胞存在的粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)、红细胞、血小板、化学成份(蛋白质、糖类、脂类、电解质等)、游离的HIV、细菌及其他微生物。③多核巨细胞为天然的大体积细胞；gp120细胞和基因整合细胞可通过抗原和抗体的免疫反应使细胞凝集为大体积多细胞聚合体；游离的HIV可通过载体颗粒/免疫反应转变为大体积成份。④根据上述3点，可以制备能通过单个细胞但不能通过大体积细胞或颗粒的血液分离器。⑤选用具有选择性吸附功能的材料，经本发明的体外血液循环支路筛除血液中的HIV感染细胞。

2、血液分离器的材料与要求：同本发明的血液净化器，选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应和白细胞、血小板、血氧分压、C3a、C5a的改变。

3、血液分离器的型号与规格：血液分离器的外形制备成柱形结构(以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯)、扁平结构(以聚醋无纺布等材料作滤芯)等形状；孔径制备成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等型号。

4、血液分离器的应用原则：根据艾滋病患者的病情选用不同型号的分离器，原则上先选用大孔径型号做预筛滤，然后选用较小孔径的型号。重度艾滋病患者常发生严重的机会性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大体积的真菌、螺旋菌、肿瘤细胞及其他异物，则选用孔径为150～250μm或50～150μm的分离器；如为筛滤HIV感染的单核巨噬细胞、多核巨细胞、多细胞聚合体及吸附有HIV的颗粒性物质，以及为了置换易受HIV感染的CD4+细胞，则选用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之类的型号。这几种型号近似或小于血液中单个红细胞、中性粒细胞、小淋巴细胞的体积，但红细胞、中性粒细胞及巨噬细胞具有变形运动的特性，能通过比自身体积更小的微孔。

(二)血浆分离器的制备

(1)制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。

(3)型号与规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状；按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

四、艾滋病血液净化治疗仪的构件

1、关键构件：(1)血液分离器：用于按体积大小筛除以多核巨细胞或多细胞聚合体状态存在的HIV感染细胞，即用于清除血细胞内的HIV；(2)血浆分离器：用于分离单个血细胞和血浆；(3)血液净化器：用于吸附血浆中的HIV。图1中，血液净化器为两个，交替使用。

2、附加构件：包括血泵、肝素泵、动静脉压和空气监测、温度控制系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分组成。(1)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持血液净化治疗的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测血液分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，在本发明关键构件和附加构件的基础上，可以引入计算机调控而制成操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性，以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理的血液净化治疗仪。

五、艾滋病血液净化治疗仪的连接通路与使用方法

1、安装：如图1，以无菌操作连接各部件，包括血液分离器、血浆分离器、血液净化器及各循环管路。

2、排气：以无菌生理盐水充液分离器、净化器及各循环管路，排除分离器、净化器及其循环管路内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

3、通液：将动脉血路管1接通艾滋病患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

4、抗凝：从肝素泵2向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/㎏。

5、启动：将动脉血路管1的一端与动脉血管相连通，将静脉管路15接通静脉血管，然后打开肝素泵2，血流量为100～150ml/min，如图1，当动脉血液经动脉血路管1、肝素和肝素泵2进入血液分离器3时，因HIV感染而形成的大体积多核巨细胞被阻留在血液分离器3内，单个血细胞和血浆依次经血液出口4、血液泵6和循环管路7流入血浆分离器8，分离的血浆依次经血浆泵9和血路管10流入此时开放的净化器11，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经出口管路13流出，同步向净化器12灌注血浆，在净化器11内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时净化器12开始放出血浆，两个并联的净化器11和12交替进行。

如表示图1中的血液分离器3的内部结构的图2，血液分离器3的内腔302的管壁上有很多微孔303，多核巨细胞304不能滤过微孔303而被阻留在内腔302，从而可被清除，能通过微孔303的中、小体积的单个血细胞305及血浆进入外腔306，然后经出口307流出，进而经图1所示的血浆分离器8分离出血细胞和血浆。

如表示图1中的血浆分离器8的内部结构的图3，血浆分离器8的内腔802的管壁上有很多微孔803，不能通过微孔803的单个血细胞804经具有可开关阀门的血细胞出口808流出，进入图1所示的血细胞出口管路14；能通过微孔803的血浆及其化学成分805进入血浆分离器外腔806，然后经血浆流出口807、图1所示的血浆泵9和血路管10进入净化器。

如表示图1中净化器11和12内部结构的图4，当含有HIV101的血浆进入净化器时，其中的HIV101分别被固定在净化层中的HIV抗体102、巨噬细胞104、CD4+T细胞106结合成抗原抗体复合物103、巨噬细胞吞噬体105、CD4+T细胞结合物107，被结合后的HIV不再往下移动，另外未被结合的较大体积的HIV又被因浓度更高而微孔更小的下层琼脂凝胶分子筛微孔阻挡在109处。被吸附HIV后的净化血浆经图1所示的出口管路13与血浆分离器8分离的单个细胞在出口管路14汇合后经静脉管路15汇流体循环。如此净化血液、清除HIV，直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束。整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用方便、自动化和安全。

六、艾滋病血液净化治疗仪功效的验证

1、血液分离器滤除HIV感染细胞功效的验证

本发明人按照本发明的基本方法，做了如下的简易验证实验：取疾控中心和传染病实验室生物样本库保存的已确诊的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分别取数份相同ABO血型的抗凝全血混合成为5例，使血液量足够大，然后委托浙江省医院中心血站按成份输血的血液成份分离方法，经血液成份分离系统分离出白细胞、红细胞、血浆，取白细胞成份按常规离心沉淀，吸弃上清液，以适量的生理盐水悬浮白细胞沉淀，然后加入合适比例的gp120抗体(上海广锐生物科技有限公司)，混匀后置37℃反应5分钟，然后以孔径为20～30um的血液成份分离系统分离出大体积的白细胞(称为大白细胞)，对滤过的白细胞滤液再进一步以孔径为15～25um的血液成份分离系统分离出中等体积的白细胞(称为中白细胞)，滤液中的白细胞为小体积的白细胞(称为小白细胞)，分别收集大、中、小白细胞分离悬液，常规离心沉淀，吸弃上清液，以定量移液器分别吸取等量的大、中、小白细胞沉淀，常规方法(机械或细胞裂解液)裂解细胞(如用同种裂解液，需加量相等)，离心沉淀后取上清液，然后根据HIV－1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表1)说明，AIDS患者不同体积大小的白细胞中的HIV－p24含量不同，在大、中、小白细胞中HIV－p24的平均含量分别为275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白细胞中HIV－p24平均含量相差148.6pg/ml，减少了54.4％；在大、中、小白细胞中HIV－P24的总含量分别为1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白细胞中HIV－p24总含量相差742.9pg/ml，减少了54.3％，经统计学检验，t＝2.43，p＜0.05。说明AIDS患者体内的大体积白细胞或经gp120抗体作用后而形成的大体积白细胞中含有较高含量的HIV，能通过实施本发明的技术方案被分离清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白细胞中HIV-p24检测结果(p24：pg/ml)

2、血液净化器(剂)清除HIV功效的验证

(1)CD4+T细胞株吸附清除HIV功效的验证

为了验证CD4+T细胞株吸附清除HIV的功效，本发明设计了简易的测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取经离心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T细胞至200mm刻度，接着吸取经100℃溶化后保温在39～41℃备用的0.9％琼脂糖C1－4B，达到约10mm长刻度，置血沉架冷却后，琼脂糖成为半固体，能阻止血沉管内细胞流出但不会阻止小分子的水和化学成份之类的物质通过。另取疾控中心及传染病实验室样本库保存的艾滋病患者的5例血浆，各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管上端空管，待流经血沉管下层的CD4+T细胞层并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，根据HIV－1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表2)说明，AIDS血浆滤过含CD4+T细胞的简易净化装置后，部分HIV已被CD4+T细胞吸附，经第1次滤过后，HIV总清除率为22.84％，经第2次滤过后，总清除率为35.31％，经第3次滤过后，总清除率为41.9％。说明随着滤过次数的增加，HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表2 AIDS血浆滤过含CD4+T细胞的简易净化装置前后p24检测结果(pg/ml)

(2)杂交瘤巨噬细胞株吸附清除HIV功效的验证

为了验证杂交瘤巨噬细胞株吸附清除HIV的功效，本发明设计了简易的测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取经离心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬细胞杂交瘤细胞株至200mm刻度，接着吸取经100℃溶化后保温在39～41℃备用的0.9％琼脂糖C1－4B，达到约10mm长刻度，置血沉管冷却后，琼脂糖成为半固体，能阻止血沉管内细胞流出但不会阻止小分子的水和化学成份之类的物质通过。另取疾控中心及传染病实验室样本库保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血浆，各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管(简易净化装置)上端空管，待流经血沉管下层的杂交瘤巨噬细胞株层并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，以人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)配对检测，按说明书操作，检测范围为0～800pg/ml,敏感度为1.0pg/ml,可在白色背景下，直接用肉眼观察：反应孔内颜色越深，阳性越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。结果如表3，滤前血浆中MIF检测结果均为阴性(或因含量低于检测灵敏度、血浆长期保存致降解等)，而滤后血浆中检测结果均为阳性。说明巨噬细胞杂交瘤细胞株在此过程产生了MIF细胞因子。MIF是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作为固有免疫和炎症反应的调节因子发挥中枢性的作用，在各种感染和急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。在作AIDS血浆滤过简易净化器前后MIF配对检测的同时，本发明还做了HIV－1p24的配对检测，根据HIV－1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，结果(表4)说明AIDS血浆滤过简易净化装置后，部分HIV已被巨噬细胞杂交瘤细胞株吞噬吸附，滤过后的血浆HIV明显减少，经第1次滤过后，HIV清除率为20.55％，经第2次滤过后，HIV清除率为42.83％，p＜0.01，具有明显的效果，说明随着滤过次数的增加HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表3 AIDS血浆滤过含杂交瘤巨噬细胞的简易净化装置前后MIF检测结果(定量：pg/ml)

表4 AIDS血浆滤过含杂交瘤巨噬细胞的简易净化装置前后p24检测结果(p24：pg/ml)

(3)HIV-1gp120抗体、gp41抗体吸附清除HIV功效的验证

本发明人按照本发明的基本方法，做了如下的简易验证实验：取HIV-1gp120抗体、gp41抗体(上海瑞齐生物科技有限公司)，加入到经100℃溶化后保温在50℃备用的1.0％琼脂糖C1－4B中，混合后滴度为1：300～500，取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取1.0％琼脂糖C1－4B溶液至200mm刻度，冷却后琼脂糖成为半固体。另取疾控中心和传染病实验室样本库保存的5例艾滋病患者的标本，去细胞后的血浆各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管上端空管，待流经血沉管下层的含有抗体的1.0％琼脂糖C1－4B并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，根据HIV－1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表5)说明，AIDS血浆滤过简易净化装置后，部分HIV已被相应抗体吸附，经第1次滤过后，HIV总清除率为20.01％，经第2次滤过后，总清除率为27.99％，经第3次滤过后，总清除率为37.36％。说明随着滤过次数的增加HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表5 AIDS血浆滤过简易净化装置前后p24检测结果(pg/ml)

总之，上述简易验证实验表明，已被HIV感染的外周血白细胞易融合成大体积的多核巨细胞或多细胞聚合体，能被本发明的血液分离器分离清除；而血浆中游离的HIV，能被本发明的净化剂(HIVgp120抗体、HIVgp41抗体、CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株、琼脂凝胶微孔)吸附清除。表明由上述以血液分离器和血液净化器(剂)为关键部件构成的艾滋病血液净化治疗仪具有显著的清除血液细胞内、外HIV病毒的治疗功效。

Claims (10)

1.一种艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，包括依次连接的血液分离器、血浆分离器和净化器；待净化的血液经血液分离器分离后，滤去多核巨细胞，而中小体积血细胞及血浆进入血浆分离器；血浆分离器将中小体积血细胞及血浆进行分离，分离出的血浆经两个或两个以上并联净化器净化后，与血浆分离器分离出的中小体积混合后，完成净化；所述净化器进出口均设有细胞筛网，净化器内设置有多层由琼脂凝胶和净化细胞组成的净化层，多层净化层构成净化柱；所述净化细胞由能结合HIV的CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株按照数量比1：0.5～3组成；每一层中，细胞占总体积的4/5；所述琼脂凝胶包含游离的HIV抗体、结合于羊抗Ig的HIV抗体、琼脂糖等；从净化器的进口处至出口处，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均从高到低依次递减，琼脂糖浓度从低到高依次递增；每一层中，净化细胞占总体积的4/5，或净化细胞占净化柱总体积的4/5。

2.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述血液分离器通过微孔滤膜实现细胞分离，微孔直径为1～250μm；所述中小体积血细胞为直径小于微孔直径的细胞，或能滤过微孔的细胞。

3.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述血浆分离器的空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。

4.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述净化器进口处筛网的目数为800目，出口处筛网的目数可以为2.0～5.0目。

5.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述净化器中净化层的层数为5层，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均从高到低，依次为1：100、1：200、1：300、1：500、1：700。

6.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述净化器中净化层的层数为5层，琼脂糖浓度从低到高，含量依次为0.7g/100ml、0.8g/100ml、0.9g/100ml、1.0g/100ml、1.1g/100ml。

7.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述能结合HIV的CD4+T细胞株、杂交瘤巨噬细胞株的数量比为1：0.5～3。

8.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述HIV抗体由HIV-1gp120抗体、HIV-1gp41抗体中的一种或两种按照任意配比组成。

9.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，杂交瘤巨噬细胞株通过将瘤细胞和巨噬细胞以细胞融合的杂交瘤技术制备获得。

10.根据权利要求1所述的艾滋病血液净化治疗仪，其特征在于，所述净化柱通过以下方法制备得到：

(1)以无菌生理盐水清洗杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株，1000r/min离心，洗净后再次离心沉淀,按杂交瘤巨噬细胞株和CD4+T细胞株之比为1：0.5～3的比例取沉淀细胞，装配高生物相容性材料制成的圆柱形容器内，制成血液净化细胞柱；

(2)将羊抗Ig与过量的HIV抗体混合，使混合液中的羊抗被完全结合，但剩有游离的HIV抗体，且游离的HIV抗体滴度与结合于羊抗Ig的HIV抗体滴度相等；

(3)将琼脂糖经100℃溶化后与一定量的生理盐水混合，保温在39～41℃，加入步骤2获得的抗体混合物，其中，游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均为1：700，琼脂糖的含量为1.1g/100ml。

(4)将步骤3配制的产物以体积比1:4加入到步骤1制备的细胞净化柱中，待冷却至半固体凝胶后，完成底层净化层的制备。

(5)重复步骤1～4，从下到上依次完成各层净化层的制备，得到净化柱。且游离的HIV抗体的抗体滴度、结合于羊抗Ig的HIV抗体的抗体滴度均为1：500、1：300、1：200、1：100；琼脂糖的含量依次为1.0g/100ml、0.9g/100ml、0.8g/100ml、0.7g/100ml。