CN102631891A - 艾滋病毒亲和吸附柱及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，该活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。亲和蛋白包括主要受体CD4分子、gp120抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4(CXCR-4)和CC趋化因子受体5(CCR-5)。亲和微球可以为大小1mm的玻璃微球、直径大于500μm的壳聚糖交联微球，也可以为葡聚糖微球。本发明适用于清除艾滋病患者血液中的艾滋病毒，减缓、治疗艾滋患者的免疫缺陷综合症，与传统的治疗方法相比较，该免疫吸附柱安全性高，专一性好，毒副作用小，操作简单。

Description

艾滋病毒亲和吸附柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种引起人类免疫缺陷综合征的艾滋病毒从血液中快速高效去除治疗技术，具体涉及一种蛋白亲和吸附柱，可特异性清除血液中艾滋病病毒颗粒，并对患者治疗后进行定性和定量的检测。

背景技术

艾滋病毒

艾滋病毒(AIDS病毒)正式命名为人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus)属于反转录科(Retroviridae)的慢病毒亚科(Lentiviridae)，衣壳为20面体立体对称，外膜包裹呈球形，直径约为110nm，病毒内芯含有两段相同的核酸链和病毒反转录酶(DNA聚合酶，核酸酶，整合酶)。核酸类型为单股正链RNA，既可作为反转录成cDNA的模板，又可作为mRNA直接翻译蛋白质，基因组大小约为9.3kb左右。基因组的两侧有长末端重复序列(LTR)，3个结构基因(gag、pol、env)和至少6个调控基因(tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx)。

HIV的靶细胞主要为Th细胞，CD4+T细胞是最主要的宿主细胞，简称为T4淋巴细胞，它是人体免疫系统中最重要的细胞之一。HIV病毒利用外层壳体糖蛋白gp120附着于T4淋巴细胞上的CD4蛋白上，两者融合后再将自身的一整套遗传物质RNA注入到T4淋巴细胞内，复制时经反转录作用形成RNA-DNA的重组体，然后以双链DNA形式整合到宿主细胞DNA链上，细胞酶系在病毒的长末端重复序列(LTR)指导下将整合的HIV DNA转录成RNA。其中一部分的RNA分子作为mRNA翻译出子代病毒的结构和功能蛋白，另一部分成为子代病毒的遗传物质装入病毒体中。成熟的子代病毒通过芽生方式从细胞内释放。新复制的病毒体将感染其他的T4淋巴细胞，并导致人体的T4淋巴细胞数缓慢持续减少，因而其数量会逐渐减少直到机体显示出艾滋病的征兆。T4淋巴细胞数的缺乏将危及人体免疫系统的安全。当人体每毫升血液中的T4淋巴细胞数减少到20万以下，一般可被认定为患上了艾滋病，HIV一旦感染将是永久型的。

艾滋病

艾滋病(Acquired Immunedeficiency Syndrome，AIDS)又称获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency syndrome)，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种严重传染病。其主要传播方式为经血、性接触和母婴垂直传播等3种。

HIV病毒感染人体后，主要经历4个阶段：急性感染期、无症状感染期、持续性全身淋巴结肿大综合征期及艾滋病期。在疾病发展病程中，因为辅助性T淋巴细胞细胞膜上的CD4分子是艾滋病病毒的主要受体，HIV可侵犯和破坏辅助性T淋巴细胞(CD4^十T淋巴细胞)，使机体细胞免疫功能受损，可并发各种严重的机会性感染和肿瘤，不及时治疗最后可导致死亡。

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体后，一般不会立即发病，大多有一段较长的潜伏期，平均为12年至13年。在长达几年或十几年的潜伏期内，可以没有任何症状，而潜伏期的长短，一方面固然与病毒的种类、毒力等因素有关，另一方面还与受感染者的健康状况、营养情况、精神因素等有关。从感染到发病的漫长过程，在不同阶段，与HIV相关的临床表现也是多种多样的。艾滋病传染性较强且目前尚无有效药物可以根治，对全人类的健康造成了严重的威胁。

艾滋病的治疗

据世界卫生组织(WHO)截止到2010年底，全世界现存3,500万人以上HIV感染者，我国卫生部通报：截止2010年10月31日，我国艾滋病病毒感染者和病人370393例，其中病人132440例；死亡68315例。而专家估计艾滋病感染者至少75万。

艾滋病(AIDS)在世界上的蔓延对人类健康和社会经济发展构成了巨大的威胁，治疗和预防艾滋病重要性日益紧迫。AIDS的治疗主要包括抗病毒治疗、免疫调节治疗和机会感染治疗等。

1.抗病毒治疗

近年来，使用较多的化学治疗药物主要有：核苷类逆转录酶抑制剂如齐多夫定(AZT)、地丹诺辛(ddl)、扎西他宾(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)等；非核苷类逆转录酶抑制剂如奈韦那平(Nevirapine)等；蛋白酶抑制剂如沙奎那韦(SquinavJr)、利杜那韦(Ritonavir)等。已有7种核苷类和3种非核苷类逆转录酶抑制剂及5种蛋白酶抑制剂共15种抗HIV药物通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。

高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active antiretroviral Therapy，HAART)又称“鸡尾酒疗法”的出现，对于AIDs的治疗具有重大意义，可以使艾滋病患者的机会性感染减低，生存期明显延长。1995年，美籍华人科学家何大一教授首先提出应用两类药物中的三种药联合治疗艾滋病患者，这种治疗方法被称作高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active antiretroviral Therapy，HAART)。联合疗法具有较强地抗病毒作用，并可避免耐药株的出现。AZT和3TC联合治疗是抗HIV感染最有效的二联疗法之一，在改善CD4细胞和降低病毒载量方面优于单一的任何药物；由二种核苷类逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成的三联疗法对降低病毒载量效果十分明显。但是，由于病毒变异和病毒在细胞内潜伏感染，HAART目前尚不能完全清除HIV-1感染者体内的病毒。在长期治疗并且不能清除患者体内的HIV-1的情况下，耐药毒株的不断增多和药物副作用的频繁出现给当前HIV-1治疗带来了严重的挑战。

目前又出现了计划性间断疗法(SIT)，SIT是希望能在维持患者血液低病毒血症的同时，减少一段时间的用药，使病毒载量反弹，再次刺激机体免疫系统，使之恢复对HIV的特异性免疫反应，最后让免疫系统本身通过特异性和非特异性免疫反应的协同作用来控制体内的HIV。

2.免疫调节治疗

主要药物有：干扰素300万U，皮下或肌肉注射，每周3次，3-6个月为1个疗程；白细胞介素-II250万U，连续静脉点滴24小时，每周5次，共4-8周；丙种球蛋白定期使用，减少细菌感染。另外，一些中药或其某些成分对免疫功能调节也有积极作用，如中药甘草中的甘草甜素、灵芝的成分三萜烯、天花粉的提取物天花粉蛋白、丹参、柴胡、黄芩苷及黄芩苷元等等均对艾滋病的治疗起积极作用。

3.机会感染的治疗

在不同地区或国家的艾滋病病人中流行的机会感染种类有所不同，WHO推荐把这两种比较廉价的预防性治疗措施作为对发展中国家HIV感染者的最基本医疗内容。此外，国内外研究较多的两种预防性治疗方法为：一是针对母婴传播的问题；另一个是针对职业暴露后的预防性治疗问题。

国外有关艾滋病预防与治疗的研究仍在不断进行：用于预防艾滋病毒的疫苗包括HIV基因工程疫苗、HIV核酸疫苗、HIV活载体疫苗等正在研究之中。

总体来说，抗病毒治疗疗效频繁，毒副作用大，易产生耐药毒株，成本高；免疫治疗法作用不直接，专一性较差，治疗效果不明显，机会治疗治疗难度大，周期性长，易控难度大。目前仍然缺少一种低副作用、低成本且能够有效治疗艾滋病的手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有艾滋病治疗方法存在的缺点和不足，提供一种艾滋病毒免疫亲和吸附柱，其能快速简便地去除艾滋病毒颗粒，达到减缓及治疗艾滋病的目的。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，所述活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。

其中，所述亲和蛋白优选选自(1)主要受体CD4分子、gp120抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种。

上述亲和吸附柱，其可以包括以下亲和微球中的一种或多种：1)连接有主要受体CD4分子的亲和微球；2)连接有gp120抗体的亲和微球；3)连接有辅助受体CXC趋化因子受体4的亲和微球；或，5)连接有CC趋化因子受体5的亲和微球。

本发明的吸附柱可以是包含上述任一种或多种固定一种亲和蛋白微球的吸附柱，也可以是包含上述任一种或多种固定多种亲和蛋白微球的吸附柱。在实际使用时，可以根据需要搭配不同亲和微球。优选在同一微球上固定上述4种亲和蛋白。

上述亲和吸附柱，其在柱体两端分别具有分离膜，其将亲和微球封闭于柱体中。所述分离膜可具有孔径为10μm-100μm的过滤孔。

上述微球可以是玻璃微球、葡聚糖微球或壳聚糖交联微球。例如所述亲和微球为直径大于1mm的玻璃微球、直径大于500μm的壳聚糖交联微球或直径100-300μm的葡聚糖微球。

本发明亲和吸附柱可以用于分离艾滋病毒，尤其是分离血液中的艾滋病毒。

本发明还提供一种制备所述亲和吸附柱的方法，其包括如下步骤：

1)活化，将微球表面活化使其表面分布能连接亲和蛋白的基团；

2)连接，将亲和蛋白连接到微球表面的基团上，使其固定到微球的表面；

3)封闭，封闭微球表面未结合的基团，得到活化亲和微球；

4)装住，将活化亲和微球填装入吸附柱中；

5)封膜，在吸附柱两端分别用分离膜封闭固定。

所述亲和蛋白可以通过基因工程手段获得，其制备方法如下：

①设计合成引物；

②以Trizol法提取总RNA，RT-PCR得到编码亲和蛋白的cDNA；

③构建cDNA毕赤酵母表达载体；

④制备毕赤酵母感受态细胞，并将表达载体转化该细胞；

⑤在毕赤酵母中高密度诱导表达外源基因；

⑥SDS-PAGE检测表达蛋白并测定表达蛋白浓度；

⑦分离纯化。

本发明具有如下优点：

本发明免疫亲和吸附柱，主要由柱体和吸附剂组成，吸附剂选用亲和微球，作为原料，来源丰富，质量稳定，价格便宜，与血液的相容性好。

免疫吸附治疗法与传统的艾滋治疗方法相比，抗病毒治疗疗效频繁，毒副作用大，易产生耐药毒株，成本高；免疫治疗法作用不直接，专一性较差，治疗效果不明显，机会治疗治疗难度大，周期性长，易控难度大，而该免疫吸附柱创新性地运用各种亲和微球作为吸附载体，安全性高，专一性好，吸附量高，毒副作用小，治疗时间短，操作简单。

本发明免疫吸附柱利用抗原抗体之间的特异性结合的特点，将人类T细胞表面的CD4分子这种小分子蛋白、gp120抗体及辅助受体蛋白CXCR-4和CCR-5固定在载体上，制备成免疫亲和吸附微球，装入带有分离膜的层析柱内。将HIV感染者的血液通过管道输入到装有制备好的免疫亲和微球的层析柱内，血液中的HIV病毒颗粒通过其表面抗原与固定在载体上的受体蛋白特异性结合，而将HIV颗粒从血液中吸附掉，最后再将灌流后的不含艾滋病毒的干净血液重新输回人体内者体内。经过几个小时的体外血液循环，HBV患者血液中的HBV颗粒含量降低，最终达到缓减病症，达到治疗艾滋病的目的。

附图说明

图1是毕赤酵母整合型分泌表达载体pPic9k的质粒图谱；

图2是SDS-PAGE检测CD4的表达结果；

图3是Western blot检测CD4的表达结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1亲和蛋白的克隆、表达及纯化

亲和蛋白有CD4分子、CCR-5、CXCR-4、gp120抗体，均可由真核酵母表达系统表达。以下以主要受体CD4分子为例。

人CD4分子是一类相对分子质量约为55kDa的单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面。其在T细胞发育、成熟T细胞的活化以及信号转导中发挥重要作用，是适应性免疫应答发生的重要效应分子，在维护机体正常生理功能中作用巨大。

人CD4分子cDNA序列长约3100bp，编码序列长1377bp(GenBank登录号：NM_000616)，编码区前75bp为信号肽基因序列，终止密码子后有PolyA加尾信号。

CD4分子前体由458个氨基酸残基(AA)组成：包括信号肽25个AA，胞膜外区371个AA，跨膜区24个AA以及胞质区38个AA。成熟CD4分子属于免疫球蛋白超家族，其胞外区由4个免疫球蛋白样的结构域组成，从N-端到C-端分别命名为：D1(1～98)，D2(99～178)，D3(179～291)和D4(292～371)。

①引物设计

参照GenBank数据库中的人CD4mRNA序列(GenBank登录号：NM_000616)，应用软件Premier5.0分析人CD4基因序列，根据真核毕赤酵母表达载体Ppic9k的多克隆位点序列，人CD4起始密码子ATG前加上2个碱基CG及EcoRI酶切位点GAATTC；在终止密码子AUG后加上5个碱基TTCCT及SnaBI酶切位点；设计一对引物如下：上游引物为A1：5-CGGAATTCATGAACCGGGGAGTCC-3(EcoR I)，下游引物为A2：5-TTCCTTACGTATCAAATGGGGCTACATGTCTT-3(SnaBI)

上下游引物理论上的扩增片段大小为约1356bp，以Jurkat细胞株cDNA为模版扩增基因，基因片段经SnaB I和EcoR I双酶切后定向插入经相同酶切的Ppic9k表达载体中。连接产物转化Top10F’大肠杆菌后，对PCR双酶切筛选阳性的菌株进行测序。

②以Trizol法提取总RNA

本实验采用Trizol法提取Jurkat细胞株(ATCC，美国典型培养物保藏中心，保藏号：CRL-1990)总的RNA，用反转录试剂盒合成第一条链，再以其为模板进行PCR扩增，最后用1％琼脂糖电泳分析PCR产物，以不加模板作为空白对照。

Trizol法提取总RNA的具体步骤如下：

1.提取Jurkat细胞株的细胞RNA时，离心沉淀细胞，每5-10×10⁶个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.将Jurkat细胞株的细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15-30℃下放置5min；

3.在上述EP管中，按照每1ml Trizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15s，在室温下(15℃～30℃)放置2～3min后，12000rpm(2℃～8℃)离心15min；

4.取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15℃-30℃)放置10min，12000rpm(2℃～8℃)离心10min；

5.弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500rpm(2℃～8℃)离心5min，弃上清；

6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.加DEPC水溶RNA沉淀。

RT-PCR：

以提取的RNA为模板，逆转录生成CD4的cDNA链。

RT-PCR体系为：

RT-PCR反应条件：

用1％琼脂糖电泳分析PCR产物。

③CD4cDNA毕赤酵母表达载体的构建克隆及鉴定

CD4的PCR扩增产物经PCR产物回收试剂盒回收纯化后，与表达载体Ppic9k都以SnaB I和EcoR I分别进行双酶切，然后在T4连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌Top10F’，接种于含氨节青霉素25μg/μl的LB平板。挑取生长出的菌落经液体培养后，取少量菌液进行PCR，鉴定阳性菌，同时用质粒提取试剂盒提取质粒，经SnaB I和EcoR I双酶切，电泳鉴定阳性质粒。具体步骤如下：

A.PCR产物回收试剂盒目的DNA片段

根据凝胶体积，加入3倍凝胶体积的Buffer DE-A。置于70℃水浴中保温10min，每隔2-3min混合一次，直至凝胶块完全融化。按Buffer DE-A体积的50％加入Buffer DE-B，混合均匀。将DNA-prepTube置于2ml Microfuge Tube中，将混合液移入DNA-prep Tube中，3600rpm离心1min。弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2mlMicrofuge Tube中，加入500μl Buffer W1，3600rpm离心1min，弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，3600rpm离心1min，弃滤液，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。将DNA-prep Tube置于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min后，将DNA-prep Tube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在DNA-prep Tube中央silica膜区域加入适量的Eluent或水，室温静置3min，12000rpm离心1min，洗脱DNA(参照V-GENE公司说明书)。

B.酶切及连接

分别用限制性内切酶SnaB I和EcoR I同时双酶切回收的线性目的DNA片段和表达载体毕赤酵母表达载体Ppic9k，电泳检测并分别试剂盒胶回收酶切产物，在T4连接酶的作用下，得到连接产物，连接产物用于转化大肠杆菌Top10F’。

C.酶连连接产物转化大肠杆菌Top10F’

大肠杆菌感受态细胞的制备

将置于液氮保存的大肠杆菌Top10F’划线在LB平板上，37℃培养活化。挑取经活化的大肠杆菌Top10F’单菌落于NZY液体培养基，18℃，200-250rpm摇床培养。当OD₆₀₀＝0.5-0.8时，用40ml预冷的无菌离心管在8000rpm，4℃，离心5min，收集菌体。用预冷的TB缓冲液悬浮菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。重复第4步操作。用8ml预冷的TB缓冲液悬浮菌体，加入DMSO至终浓度为7％。冰浴10min，分装至冻干管内置于液氮保存备用。

大肠杆菌的转化

在无菌的1.5ml离心管内加入待转化的DNA 3-5μl，加入40μl大肠杆菌感受态细胞，轻柔混匀，冰浴30min。42℃，热激45s，迅速冰浴2-3min。加入200μl NZY液体培养基混匀，37℃摇床培养1h。取150μl涂布补加了氨苄青霉素的LB培养基平板，37℃倒置培养，16h后可出现转化子。出现的转化子可以用菌落PCR鉴定重组子。

菌落PCR筛选重组子的方法

将Taq酶反应缓冲液、dNTP混合物、水、引物、Taq酶混合好后，分装于PCR管中，挑取少量菌落于其中，用枪头抽吸几次混匀。PCR反应时，将预变性处理时间改为7min，其它同常规PCR反应。

D.重组质粒的验证和线性化

1.将通过含有卡那霉素抗性的LB平板筛选到的大肠杆菌，挑取单菌落，37℃，200rpm摇瓶培养过夜。

2.大量抽取大肠杆菌重组质粒。

3.重组质粒经过PCR验证目的基因(如下表)。

PCR反应体系(20μl)：

PCR反应条件(30cycle)：

4.分别用限制性内切酶Sac I，Sal I，Bgl II线性化重组质粒pPIC9K-CD4，电泳检测并用相应的试剂盒回收酶切产物。反应体系为：

50μl＝L buffer 5μl+Sac I 0.5μl+24.5μlDNA+20μl无菌水

50μl＝H buffer 5μl+Sal I 0.5μl+24.5μlDNA+20μl无菌水

50μl＝H buffer 5μl+Bgl II 0.5μl+24.5μlDNA+20μl无菌水

空白对照中限制性内切酶用无菌水代替。

④毕赤酵母感受态细胞的制备及转化

A毕赤酵母感受态细胞的制备

将毕赤酵母GS115在YEPD平板上活化，挑单菌落接入10mlYEPD液体培养基，30℃，200rpm培养过夜，将30-40μl培养液转至另一装有100ml YEPD液体培养基的1L锥形瓶，使初始OD₆₀₀＝0.1，继续30℃培养使其OD₆₀₀＝0.5-0.8。室温，4000rpm离心3min，收集菌体，用50ml BufferA重悬菌体，并室温收集，重复一次。将菌体用4ml Buffer A重新悬浮，并按每管0.2ml分装至无菌的冻干管中，每管加入10μl DMSO，混匀后快速放入液氮中冻存30min后，转至-70℃冰箱备用。

B毕赤酵母的转化

电转化法：将线性化的重组质粒pPIC9K-CD4，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。电击条件如下：电压410V，电容25μF，电阻20Ω，电击时间5ms。电击后，立即将电转杯中的菌液转移至装有1ml冰预冷的1mol/l山梨醇溶液的EP管中，用移液器轻柔吸打混匀后，涂布于MD平板上，28℃培养直至转化子出现。

PEG法：在未解冻的感受态细胞上加入50μl ssDNA和尽量浓的待转化的DNA，37℃水浴5min，其间轻柔混合样品1-2次。加入Buffer B 1.5ml，充分混匀后，30℃水浴1h，其间混合样品3-4次，4000rpm离心10min，弃上清，菌体用1.5ml Buffer C悬浮。4000rpm离心10min，弃上清，菌体用0.2ml Buffer C轻轻悬浮，将悬浮的菌液涂布于MD平板上。28℃倒置培养，2-4d后可长出转化子。

⑤外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达

挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于25ml BMGY液体培养基中(按10％装瓶)，28℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀＝4-6。收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至25ml BMMY液体培养基中，200rpm，25℃摇床培养。每隔24h补加甲醇至终浓度5％进行诱导，0，12h，24h，36h，48h，72h，96h取样分析表达水平，以确定最佳诱导时间。结果表明诱导72h小时表达水平最佳。

⑥SDS-PAGE检测表达蛋白及测定表达蛋白浓度

待重组毕赤酵母经诱导表达后，取少许菌液，离心，取上清，SDS-PAGE检测表达蛋白检测是否表达外源蛋白CD4分子，结果如图2所示。并进一步采用抗CD4分子单克隆抗体Western blot进行检测定性，结果如图3所示。结果表明酵母能够大量表达CD4分子。

⑦人类CD4分子的纯化

在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养已鉴定重组毕赤酵母的菌株24h，在合适的时间加入甲醇进行诱导表达外源蛋白后，离心去掉菌体，上清液用75％饱和度的硫酸铵沉淀过夜后，4℃，10000rpm离心10min去掉上清，蛋白沉淀用0.1倍体积0.05M的磷酸缓冲液(pH6)溶解。溶解蛋白用同样的缓冲液透析去盐后，过阳离子交换树脂(CMC Biosephar Fast FloW，上海安星生产)，填充物用0.05M磷酸缓冲液(pH6)平衡，用含0-1.0mol/l NaCl的同样缓冲液梯度洗脱，收集溶解的目的蛋白，放入-20℃进行保存。

材料：

1.SupTI细胞株在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中培养传代。

2.大肠杆菌Top10F’，在5ml含50-100mg/ml四环素的LB中培养Top10F’过夜，取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀，转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中，存于-80度。

3.毕赤酵母表达载体Ppic9k：9276bp融合载体；在α-factor分泌信号阅读框中含有用于克隆的4个单限制酶位点。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI；α-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密码的读码框中。

4.毕赤酵母GS115菌株

5.RPMI1640培养基，反转录试剂盒，PCR试剂，限制性内切酶、T4连接酶、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自Takara。

YEPD培养基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白胨，2.0％葡萄糖，121℃灭菌20min(1.5％琼脂)，毕赤酵母培养用

LB培养基：1.0％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％NaCl，pH7.0，121℃灭菌20min，(1.5％琼脂)再加100mg/ml的氨苄青霉素

MD培养基：1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH₄)₂SO₄，4×10^-5％Biotin(过滤除菌)，(1.5％Agar)毕赤母转化用

BMGY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％YNB，1％(NH₄)₂SO₄ 100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油，毕赤酵母培养菌体用

BMMY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％YNB，1％(NH₄)₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，适量甲醇，(1.5％Agar)毕赤酵母诱导表达用

NZY培养基：1％NZ amine(casein hydrolysate)，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，12.5mmol/LMgCl₂，12.5mmol/LMgSO₄，20mmol/L葡萄糖，121℃灭菌20min，大肠杆菌转化用

6.主要溶液

质粒抽提溶液I：50mmol/L葡萄糖，5mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

质粒抽提溶液II：1体积0.4mmol/LNaOH，1体积2％SDS，8体积水，使用前混合

质粒抽提溶液III：5mol/LKAc(60ml)，HAc(11.5ml)，水(28.5ml)

TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)

50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ml用双蒸水定容至1000ml，室温存放，用时再稀释50倍

裂解缓冲液：200mmol/LTris-HCl，pH8.5；0.5％(w/v)SDS，250mmol/LNaCl，25mmol/L，EDTA

DNA抽提缓冲液：100mmol/LEDTANa₂，100mmol/LTris-HCl，1.5mol/LNaCl，pH8.0

DEPC处理的水(简称DEPC水)：双蒸水按0.1％(v/v)的量加入DEPC于4℃储存过夜，高压灭菌后备用。

TB缓冲液：10mmol/LPip s，55mmol/LMnCl₂，15mmol/LCaCl₂，250mmol/LKCl，用KOH调pH至6.7。

毕赤酵母转化用BufferA：1.0mol/L山梨糖醇，10mmol/LBicine(pH8.35)，30％(v/v)乙二醇

毕赤酵母转化用Buffer B：40％(w/v)PEG1000，0.2mol/LBicine(pH8.35)

毕赤酵母转化用Buffer C：0.15mol/LNaCl，10mmol/LBicine(pH8.35)

2×SDS凝胶加样缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2ml；甘油2ml；20％SDS 2ml；0.1％溴酚蓝0.5ml；β-巯基乙醇1.0ml；双蒸水2.5ml

5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 7.5g；甘氨酸36g；SDS 2.5g；溶于500ml双蒸水，使用时用去离子水稀释5倍

SDS-PAGE胶染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸中，滤纸过滤备用。

SDS-PAGE胶脱色液：90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸

诱导剂：甲醇

实施例2免疫吸附微球的制备

原理：

亲和微球可以为大小1mm的玻璃微球、直径大于500μm的壳聚糖交联微球，也可以为琼脂糖微球。

本实验中选择粒径也可选择1mm的玻璃珠作为载体材料。由于玻璃珠具有强大的表面积和孔结构，玻璃珠具有固定各种配基的潜能。且玻璃珠也具有比较好的血液相容性，所以可也考虑做为吸附的载体。在进行蛋白固定之前，需要对玻璃珠进行清洗等预处理。玻璃珠在制备的过程中，往往混有灰尘、油脂等杂质，因此需要进行清洗。本实验中，将玻璃珠放在95％丙酮的溶液中，进行超声5min，去除玻璃珠的杂质。由于玻璃珠上的自由的硅羟基很少，因此需要将玻璃珠用酸浸泡，使玻璃珠表面暴露更多的羟基。硅羟基活性不高，因此要将活化后的玻璃珠进行硅烷化处理，使玻璃珠表面带上氨基。氨基与戊二醛上的醛基结合，生成西弗碱，戊二醛另一端的醛基和免疫球蛋白上的氨基结合，最终将艾滋病毒的主要受体CD4分子、其辅助受体CCR-5和CXCR-4、抗gp120抗体蛋白固定在玻璃珠的表面，制备成玻璃亲和微珠。通过体外病毒吸附实验，可以对比吸附前后血液中的艾滋病毒的差异。最终通过实验研究探索出一个本实验室特有的可以有效治疗艾滋病毒的免疫吸附柱。

壳聚糖是一种碱性多糖，经虾、螃蟹的甲壳去乙酰化而得。壳聚糖能够成膜，合金属离子，同时具有光学结构性质。壳聚糖具有良好的生物相容性，广泛于制备生物材料。壳聚糖可以制备成人造纤维素膜。该人造纤维素膜可以吸附剂，能够承受很大的机械压力。因此，壳聚糖成为该实验的首先材料。将壳聚糖首先用戊二醛进行交联，制备成壳聚糖交联微球。壳聚糖交联微球表面的羟基能和环氧氯丙烷结合，将环氧基固定到壳聚糖交联微球表面。壳聚糖交联微球上的环氧基和抗体蛋白上的氨基结合，从而将人免疫球蛋白固定在壳聚糖交联微球表面。

以玻璃珠为例：

1.初步清洗

将玻璃珠用95％乙醇漂洗，然后在95％的丙酮中超声6min，共3次，每次更换新鲜丙酮，然后用超纯水漂洗，再在纯水中超声6min，最后用纯水漂洗。

2.酸处理

称取一定量的玻璃珠，加入一定体积(比例为1kg玻璃珠：3L浓HNO3)的浓硝酸过夜浸泡，再用蒸馏水水洗3次，每次晃洗90s，37℃烘干后备用。

3.硅烷化处理

加入与浓硝酸同等比例的2％的APTES室温浸泡2h；再用相同体积的5％乙醇摇晃清洗3次，分别用同样体积双蒸水摇晃清洗3次，每次晃洗90s，将玻璃珠置于烘箱100℃固化1h。

4.醛基化处理

在氨基化的玻璃球中加入2.5％的戊二醛，然后用0.2M醋酸调节pH到4，加入氰基硼氢化钠0.05g，室温低速振荡2.5h(100rpm)；用双蒸水水洗涤3次，每次晃洗90s，除去未反应完得戊二醛，40℃烘干。

5.受体蛋白的固定

固定的受体蛋白有本实验基因工程表达的CD4分子，购买的辅助受体蛋白CXCR-4和CCR-5，购买的抗gp120抗体。

蛋白固定的方式有几下几种：

①一定比例的CD4分子、CXCR-4、CCR-5和gp120抗体混合蛋白一起加入已经醛基化的玻璃微珠中进行蛋白固定，得到一种含有混合蛋白的玻璃微球。

②也可以分别对CD4分子、CXCR-4、CCR-5和gp120抗体进行蛋白依次进行固定，得到四种含有CD4分子、CXCR-4、CCR-5和gp120抗体的玻璃微珠。

用pH8.0，0.05M的碳酸盐缓冲液将醛基化的玻璃珠润洗3次；将一定浓度固定的受体或抗体蛋白(加蛋白的方式选择上述方式)和已活化的玻璃微球一起加入pH8.0，0.05M的碳酸盐缓冲液，37℃，摇床上低速振荡3h；孵化后用pH7.4，0.01M PBS润洗3次，去掉未反应完的受体蛋白。

6.未反应醛基的封闭

将玻璃微珠重置于5μg/ml牛血清白蛋白溶液中，室温孵育2h，轻轻振荡混匀。结束后，分别用用PBS洗涤3次，得到玻璃亲和微珠，4℃保存。

7.血液吸附

分别取一定量的已固定的五种玻璃亲和微球进行以下实验，取1g玻璃亲和微珠中加入适量的HIV阳性血清，于恒温水浴摇床上37℃低速振荡4h，孵育结束后取上清检测测HIV吸附情况，比较下面七个实验体系的治疗效果。

实验体系：

50ml体系1＝1g一种含以固定混合蛋白玻璃亲和微珠(一种CD4分子、CXCR-4、CCR-5和gp120抗体混合蛋白玻璃微球)+50ml的HIV阳性血清

50ml体系2＝1g含CD4分子主要受体的玻璃亲和微珠+50ml的HIV阳性血清

50ml体系3＝1g含CXCR-4辅助受体蛋白的玻璃亲和微珠+50ml的HIV阳性血清

50ml体系4＝1g含CCR-5辅助受体蛋白的玻璃亲和微珠+50ml的HIV阳性血清

50ml体系5＝1g含gp120抗体蛋白的玻璃亲和微珠+50ml的HIV阳性血清

50ml体系6＝1g四种玻璃亲和微珠混合体(分别为只有CD4分子、CXCR-4、CCR-5和gp120抗体四种玻璃亲和微珠，其比例不断变化)+50ml的HIV阳性血清

50ml体系7＝1g清洗干净无活化且不含任何蛋白的玻璃微球+50ml的HIV阳性血清

用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(购自上海科华)定性及定量的检测经过免疫吸附治疗后的血液来比较这7种不同的体系，结果如下表所示：

通过对病毒吸附效果的比较可知，第一种体系最佳。

8.免疫吸附柱的制备

通过实验比较得到几种吸附艾滋病毒较好的玻璃亲和微球，将亲和玻璃微球装入聚酯中，装入柱中可以为一种玻璃微球，也可以是几种玻璃微球的混合。最后在装好亲和玻璃微球的聚酯柱的两端封闭分离膜。

9.免疫吸附治疗后血液中艾滋病毒的检测

将制备好的玻璃微球吸附柱(含混合蛋白玻璃亲和微珠，即上述体系1)与血液净化体外循环系统连接，然后将吸附柱置于预先设置37℃的特制DHP060恒温培养箱内，在吸附柱与待吸附血浆连接的中间管路上安置蠕动泵，调整流速为180ml/h，同时将艾滋病患者的血液以180ml/h通过吸附柱。

用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(购自上海科华)定性及定量的检测经过免疫吸附治疗后的血液，结果如下表所示：

具体检测采用抗原检测技术-酶联免疫吸附实验(ELISA)

出现于HIV感染早期的HIV核心蛋白-p24抗原的检测方法，检测免疫吸附前后血浆中p24抗原的变化。

p24抗原检测是将单克隆抗体包被在固相载体上，加入样本反应，生成抗原-抗体复合物，然后加入酶标记的p24抗体，形成p24抗体-p24抗原-酶标p24抗体复合物，加入显色剂后即发生显色反应，然后在酶标仪上读结果。此法灵敏度88.7％，特异性100.0％。

主要材料和试剂：

1.玻璃珠(直径约1mm)购自北京九野机械制造有限公司

2.艾滋病阳性血清样本

3.试剂：盐酸(36％～38％)(分析纯)；甲醇(分析纯)；□-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)；

戊二醛(25％)(分析纯)；无水乙酸；血清白蛋白(100g)

PBS(phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲液)：

137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄溶解至800ml的水溶液，即在800ml的蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g的KCl，1.44g的Na₂HPO₄，0.24g的KH₂PO₄，再用HCl调pH为7.2～7.4，最后加蒸馏水至1L。分装后，高压灭菌。

碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)：

称取1.59g的Na₂CO₃和2.93g的NaHCO₃，用800ml的蒸馏水溶解，调节pH为9.6，然后用蒸馏水定容至1L。分装后，高压灭菌，4℃保存备用。2％硅烷化试剂：2ml的氨基硅烷APTES和98ml的95％乙醇混合，避光保存2.5％戊二醛：将2.5ml的戊二醛溶解于97.5ml的PBS溶液中，4℃避光保存。BSA(5mg/ml)：称取0.5gBSA固体粉末，溶解到0.01M pH 7.2～7.4的PBS缓冲液中，4℃保存。

4.EILSA试剂盒、免疫印记实验相关试剂等用于检测。

 序列表

 

<110>  武汉大学

<120>  艾滋病毒亲和吸附柱及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1377

<212>  DNA

<213>  人

 

<400>  1

atgaaccggg gagtcccttt taggcacttg cttctggtgc tgcaactggc gctcctccca       60

 

gcagccactc agggaaagaa agtggtgctg ggcaaaaaag gggatacagt ggaactgacc      120

 

tgtacagctt cccagaagaa gagcatacaa ttccactgga aaaactccaa ccagataaag      180

 

attctgggaa atcagggctc cttcttaact aaaggtccat ccaagctgaa tgatcgcgct      240

 

gactcaagaa gaagcctttg ggaccaagga aactttcccc tgatcatcaa gaatcttaag      300

 

atagaagact cagatactta catctgtgaa gtggaggacc agaaggagga ggtgcaattg      360

 

ctagtgttcg gattgactgc caactctgac acccacctgc ttcaggggca gagcctgacc      420

 

ctgaccttgg agagcccccc tggtagtagc ccctcagtgc aatgtaggag tccaaggggt      480

 

aaaaacatac agggggggaa gaccctctcc gtgtctcagc tggagctcca ggatagtggc      540

 

acctggacat gcactgtctt gcagaaccag aagaaggtgg agttcaaaat agacatcgtg      600

 

gtgctagctt tccagaaggc ctccagcata gtctataaga aagaggggga acaggtggag      660

 

ttctccttcc cactcgcctt tacagttgaa aagctgacgg gcagtggcga gctgtggtgg      720

 

caggcggaga gggcttcctc ctccaagtct tggatcacct ttgacctgaa gaacaaggaa      780

 

gtgtctgtaa aacgggttac ccaggaccct aagctccaga tgggcaagaa gctcccgctc      840

 

cacctcaccc tgccccaggc cttgcctcag tatgctggct ctggaaacct caccctggcc      900

 

cttgaagcga aaacaggaaa gttgcatcag gaagtgaacc tggtggtgat gagagccact      960

 

cagctccaga aaaatttgac ctgtgaggtg tggggaccca cctcccctaa gctgatgctg     1020

 

agtttgaaac tggagaacaa ggaggcaaag gtctcgaagc gggagaaggc ggtgtgggtg     1080

 

ctgaaccctg aggcggggat gtggcagtgt ctgctgagtg actcgggaca ggtcctgctg     1140

 

gaatccaaca tcaaggttct gcccacatgg tccaccccgg tgcagccaat ggccctgatt     1200

 

gtgctggggg gcgtcgccgg cctcctgctt ttcattgggc taggcatctt cttctgtgtc     1260

 

aggtgccggc accgaaggcg ccaagcagag cggatgtctc agatcaagag actcctcagt     1320

 

gagaagaaga cctgccagtg tcctcaccgg tttcagaaga catgtagccc catttga        1377

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cggaattcca agaacaacag attgg                                             25

 

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ttccttacgt atcaaatggg gctacatgtc tt                                     32

Claims (10)

1.一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，其特征在于，所述活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。

2.如权利要求1所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述亲和蛋白选自（1）主要受体CD4分子、gp120抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的亲和吸附柱，其特征在于，其包括以下亲和微球中的一种或多种：

1）连接有主要受体CD4分子的亲和微球；2）连接有gp120抗体的亲和微球； 3）连接有辅助受体CXC趋化因子受体4的亲和微球；或4）连接有CC趋化因子受体5的亲和微球。

4.如权利要求1~3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述柱体两端分别具有分离膜，其将亲和微球封闭于柱体中。

5.如权利要求1~3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述分离膜具有孔径为10 -100 μm的过滤孔。

6.如权利要求1~3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述微球为玻璃微球、葡聚糖微球或壳聚糖交联微球。

7.如权利要求6所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述亲和微球为直径大于1 mm的玻璃微球、直径大于500 μm的壳聚糖交联微球或直径100-300 μm的葡聚糖微球。

8.权利要求1~6任一项所述的亲和吸附柱在分离艾滋病毒中的应用。

9.一种制备权利要求1~6任一项所述亲和吸附柱的方法，其包括如下步骤：

1）活化，将微球表面活化使其表面分布能连接亲和蛋白的基团；

2）连接，将亲和蛋白连接到微球表面的基团上，使其固定到微球的表面；

3）封闭，封闭微球表面未结合的基团，得到活化亲和微球；

4）装柱，将活化亲和微球填装入吸附柱中；

5）封膜，在吸附柱两端分别用分离膜封闭固定。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述亲和蛋白选自（1）主要受体CD4分子、gp120抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种，其制备方法如下：

①设计合成引物；

②以Trizol法提取总RNA，RT-PCR得到编码亲和蛋白的cDNA；

③构建cDNA毕赤酵母表达载体；

④制备毕赤酵母感受态细胞，并将表达载体转化该细胞；

⑤在毕赤酵母中高密度诱导表达外源基因；

⑥SDS-PAGE检测表达蛋白并测定表达蛋白浓度；

⑦分离纯化。

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