CN101628135A - 特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法，涉及一种血液净化的亲和吸附柱。亲和吸附柱包括吸附载体、活化剂和抗病毒表面蛋白抗体；在吸附载体上加入活化剂得活化载体，在活化载体中加入抗病毒表面蛋白抗体进行抗体偶联得免疫吸附剂，免疫吸附剂装入吸附柱即得亲和吸附柱。本发明特异性强；毒副性小；治疗效果显著；可重复性好；成本较低；不仅适用于血液净化，而且亲和吸附柱本身作为一种分离技术，能广泛应用于其他领域对病毒抗原的提纯和分离。

Description

特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种血液净化的亲和吸附柱，尤其涉及一种特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法，能够辅助或替代传统的治疗方法，成为一种新型的治疗病毒性疾病的方法。

背景技术

病毒性疾病是常见的感染疾病，如乙型肝炎就是目前困扰人们的一种常见的病毒感染性疾病。病毒性肝炎是由多种肝炎病毒所致的一种以肝脏损伤为主的全身性急性或持续性传染病。我国是乙型肝炎的高发区，人群总感染率高达60％，构成乙型肝炎传染源的表面抗原携带者约为10％。全国乙型肝炎表面抗原携带者至少有1.2亿，其中约10％最终转化为各种慢性肝炎，包括慢性肝炎肝硬化和肝癌。现在我国慢性肝炎病人约为1200万，每年肝病死亡人数约为30万，其中16万人死于肝癌。全世界1亿丙型肝炎病毒感染携带者，我国就占3000万到4000万，加上其它型肝炎，可见病毒性肝炎给社会带来了巨大经济负担以及对人类健康带来的巨大影响。

目前治疗病毒性肝病的方法有抗病毒药物和干扰素，但成本高、疗程长、副作用大。

研究发现乙肝患者的血液中含有大量的乙型肝炎表面抗原的DANE氏颗粒(HBsAg)，形成病毒血症，为了治疗这种病毒血症，我们发现可以通过血液透析的方法把血液从人体动脉引出，将血浆中的乙型肝炎表面抗原与偶联在载体上的抗乙型肝炎表面蛋白抗体特异性结合，来清除血浆中的乙型肝炎表面抗原，达到辅助清除病毒或治疗的目的。

本课题组研究发现，同样的方法也可适用于其它病毒血症，如丙肝病毒血症，人免疫缺陷病毒如艾滋病毒血症等。

此外，实验发现干扰素的疗效与治疗开始前血液病毒载量有关，病毒载量与疗效负相关。因此，在抗病毒药物应用之前快速降低血清病毒载量，可提高干扰素的效果，从而缓解或治愈患有病毒血症的病人。

清除了病毒表面抗原及其包裹的病毒的血浆重新输入人体内，这种方法在人体外对血液进行处理，没有化学物质的刺激，毒副作用小，且无需输入新鲜血浆或置换液，具有广阔的临床意义和市场前景。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法。本发明毒副性小，特异性强，能够大量清除血液中的病毒，可辅助或替代传统的治疗方法。

本发明的目的是这样实现的：

一、特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱(简称亲和吸附柱)

亲和吸附柱包括吸附载体、活化剂和抗病毒表面蛋白抗体；

在吸附载体上加入活化剂得活化载体，在活化载体中加入抗病毒表面蛋白抗体进行抗体偶联得免疫吸附剂，免疫吸附剂装入吸附柱即得亲和吸附柱。

1、吸附载体

吸附载体是一种临床常用的血液净化材料，包括树脂、玻璃纤维、淀粉微球、大孔共聚物、活性炭等。

2、活化剂

活化剂为1，4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚(1，4-Butanediol DiglycidylEther，简称BDDE)。

BDDE的结构和作用机制：

BDDE是一个长链分子，双环氧基中的一个与载体上的羟基反应，另一个环氧基与载体之间存在一个“长臂”，正是这个“长臂”结构极大地影响了免疫吸附剂对抗体的吸附性能，即利用相同结构的长臂之间的斥力，使活性基团呈“放射状”处于载体表面，在一定程度上减少了抗体分子中大量氨基所可能导致的“多点结合”，保持偶联抗体的正常结构，保持其活性。

BDDE在载体表面引入活泼的环氧基，可与抗体中的氨基反应，通过共价键将抗体偶联在载体表面，得到免疫吸附剂。

3、抗病毒表面蛋白抗体

抗病毒表面蛋白抗体是一种与病毒表面蛋白特异性结合的蛋白质；其作用原理是通过抗体与抗原的特异性结合将病毒粒从血浆中清除。

其来源是：

通过单克隆抗体技术制备抗病毒表面蛋白抗体(Ab)。

亲和吸附柱的工作原理：

亲和吸附作为一种生物分离技术，可用于血液净化和治疗免疫性疾病。亲和吸附柱是利用抗原和抗体之间特异性结合的性质，将抗病毒表面蛋白抗体偶联在吸附载体上形成亲和吸附柱。将血液从动脉输出，经过孔径适宜的分离膜将血细胞、蛋白和血浆分离，病毒粒子主要留在血浆中。将血浆通过亲和吸附柱，血浆中的病毒表面蛋白和抗病毒表面蛋白抗体结合，从而将病毒粒子从血浆中清除，将清除过病毒粒的血浆回输到人体内。吸附有病毒粒的亲和吸附柱可以通过洗脱的办法，将病毒粒从亲和吸附柱上洗脱下来，亲和吸附柱就可重复使用。

二、亲和吸附柱的制备方法

亲和吸附柱的制备方法包括下列步骤：

①活化载体

将树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，再按照1g/2L加入浓度为0.2moL/L的NaOH溶液(1g吸附载体/2LNaOH溶液)，边搅拌边滴加活化剂BDDE，在40～50℃下反应4h，抽干后，用蒸馏水洗涤载体，即得活化载体；

②抗体偶联

在1g活化载体中加入3L、0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液和1g抗病毒表面蛋白抗体，在0～4℃下反应24h，用0.2mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液淋洗活化载体，即得免疫吸附剂；

③亲和吸附

将免疫吸附剂装入吸附柱即得亲和吸附柱。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、特异性强，抗病毒表面蛋白特异性抗体只与病毒粒子结合；

2、毒副性小，所选用的吸附载体和活化剂都是血溶性好、低毒甚至无毒的材料，因而对机体的伤害小；

3、治疗效果显著，通过1～2个小时的血液净化可将血浆内的病毒表面蛋白抗原基本清除，疗效显著；

4、可重复性好，使用过的亲和吸附剂可以通过洗脱的方法将吸附的病毒粒子洗脱掉，洗脱后的亲和吸附柱可以重复使用；

5、成本较低，除去了病毒粒子的血浆回输到体内，不需要补充新鲜的血浆置换液，还可到达正常的血液比容。

总之，本发明可以辅助传统的抗病毒药物和干扰素治疗，效果显著。本发明不仅适用于血液净化，而且亲和吸附柱本身作为一种分离技术，能广泛应用于其他领域对病毒抗原的提纯和分离。

附图说明

图1是亲和吸附系统的结构示意图。

其中：

1-动脉针头；         2-第一压力表；        3-第一消泡装置；

4-肝素加入接口；     5-第一阀门；          6-检测控制器；

7-透析装置；         8-第一血浆采样口；    9-亲和吸附柱；

10-第二阀门；        11-补液装置；         12-补液输入接头；

13-第二消泡装置；    14-第二压力表；       15-第二血浆采样口；

16-静脉针头。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

一、实例一：单克隆抗体免疫亲和吸附柱清除血浆中乙型肝炎病毒表面抗原

1、试剂组成

①(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖交联树脂(简称：壳聚糖)

取1L含1％乳化剂(Span80)的液体石蜡作为油相分配剂置于三口瓶中，加入事先配置的含3％制孔剂(聚乙烯醇、聚乙二醇4000、乙酸乙酯、己酸乙酯或乙酸丁酯)及3.5％高分子表面改性剂(十二烷苯基磺酸钠)的0.5L壳聚糖乙酸溶液、室温下搅拌1h，使壳聚糖溶液分散成大小适宜的液滴，升温至40℃，加入0.2L戊二醇，反应0.5h后，用5％NaOH调节体系的pH至9。升温至60℃，反应3h后，过滤，水洗，石油醚提取，乙醇洗涤，产品与0.06mol/L的NaBH₄溶液反应，将残存的醛基反应为羟基，水洗后备用。

②活化剂：BDDE

1g交联壳聚糖树脂的羟基在2mL、0.2mol/L的NaoH条件下与BDDE反应，在树脂上引入环氧基。活化树脂作为吸附剂载体，利用引入的环氧基与抗体的氨基反应，通过化学键固定在抗体上。

③单克隆抗体

抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体(Ab)，通过单克隆抗体的大量制备可以获得。Ab能与乙型肝炎表面抗原特异性结合。

④免疫吸附剂

在1g活化载体中加入3mL、0.1mol/L、pH＝9.6的缓冲液和1g单克隆抗体，0～4℃下反应24h，用大量的0.2mpl/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液淋洗树脂至224nm处的吸光度为0，即得免疫吸附剂。

⑤亲和吸附流程

如图1，血液通过动脉针头1流经硅胶管，通过第一压力表2，显示血压的大小，随时监控整个系统的异常；第一消泡装置3能够消除血液中的气泡；在肝素加入接口4加入肝素可以防止血液的凝固；血液经过第一阀门5，到达透析装置7，在此装置内有一层分离膜，将血细胞、蛋白和血浆分离，血细胞、血浆被滞留在左侧内，而血浆流到右侧，带有乙肝病毒表面抗原的血浆流经亲和吸附柱9，乙肝病毒表面抗原与偶联在载体上的抗乙肝病毒表面蛋白抗体特异性结合，病毒粒被吸附，处理后的血浆回流到透析装置7内，与细胞和蛋白一起融合，通过硅胶管回输体内；在静脉回输管道上，设置有补液装置11；在血液处理之前通过补液输入接头12向补液装置11加入营养液；再通过静脉针头16向人体输入一定量的营养液；在静脉回输管道上，还设置有第二消泡装置13、第二压力表14和血浆采集口15；第二消泡装置13能够消除血液中的气泡，第二压力表14能够检测血液回输时的压力，第二血浆采样口15用于采集血样进行定量分析。

2、说明：

①处理了的血浆回输体内，不需要新鲜的置换液降低了一般血浆置换的成本。

②在透析装置7和亲和吸附柱9之间连接有检测控制器6，通过检测控制器6检测血浆回输入口处是否存在回输血浆，来控制第一阀门5和第二阀门10的开关。如果回输入口处没有血浆，则第一阀门5开，第二阀门10关，进行血液透析和亲和吸附；如果回输入口处血浆存在，则第一阀门5关，第二阀门10开，处理血浆、血细胞和蛋白混匀，回输人体，这样就能达到正常的血液比容。

③病毒粒子清除程度的测定

在第一血浆采样口8处采集10ul血浆，用荧光定量PCR，测定病毒粒子的含量，可得知病人体内的病毒粒子浓度。在第二血浆采样口15处采集10ul血浆，用荧光定量PCR测定病毒粒子的浓度，可以知道处理后的血浆中病毒粒子，以此来判断血浆净化的终止。

3、实验材料及实验过程

①实验材料：转基因小鼠

转基因小鼠：将HBV DNA显微注射至小鼠受精卵原核中，子代小鼠细胞内HBV DNA表达，产生大量的乙肝表面蛋白抗原。饲养至成熟期，通过检测发现，乙肝表面蛋白抗原在小鼠肝细胞内质网内大量积累，呈现出“毛玻璃”样的组织改变，转基因小鼠肝脾肿大，食欲减退，萎靡。

②实验过程

将此小鼠麻醉，用酒精棉球在小鼠颈部搽几下，在颈动脉处接入动脉硅胶管；平行揪着小鼠尾巴，在尾巴处用酒精棉球搽几下，在尾巴静脉穿刺，接入静脉硅胶管；开始进行小鼠血浆的亲和吸附处理。在第一血浆采集口8处，采集血浆10ul进行PCR，测得病毒DNA浓度为5×10⁷拷贝/mL。30min后，在第二血浆采样口15处，采集10uL血浆进行PCR测定，测得病毒DNA浓度为3×10²拷贝/mL，血液净化完毕。

处理之后的的小鼠，饲养一周后，发现症状明显改善。食欲增加，活动活跃。肝脾恢复正常。

二、实例二：单克隆抗体免疫亲和吸附剂清除血浆中的人类免疫缺陷病毒(HIV)

1、试剂组成

①载体(同上)

②活化剂(同上)

③单克隆抗体

抗人类免疫缺陷病毒表面蛋白抗体，可通过单克隆的方法获得。

④免疫吸附剂

在1g活化载体中加入3mL、0.1mol/L、pH＝9.6缓冲液和1g抗人类免疫缺陷病毒表面蛋白GP120抗体体，0～4℃下反应24h，用大量的0.2mpl/L，pH＝7.4的磷酸盐缓淋洗树脂至224nm处的吸光度为0，即得免疫吸附剂。

⑤亲和吸附流程

亲和吸附装置与实例一中的亲和吸附装置一样，只需把亲和吸附柱内的吸附剂换为偶联有抗人类免疫缺陷病毒表面蛋白特异性抗体的吸附剂。

本亲和吸附清除病毒的方法既可用于动物体内，也可适用于人体内。

2、实验对象和实验过程

①实验对象：艾滋病患者

一名45岁患者，男，确诊为获得性免疫缺陷综合征期。患者有明显的发热、疲乏、盗汗，出现不易控制的体重减轻(＞10％)，持续性腹泻，持续性发热(＞38℃)；患者感染卡氏肺孢菌肺炎，咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难；患者头昏头疼；患慢性肝炎；头皮、面、耳及胸部可见红斑样、角化过度的鳞屑斑；血液中粒细胞、血小板减少，贫血。

②实验过程

用酒精在这名患者手臂处消毒、擦拭。在静脉处接入静脉针头，在动脉处接入动脉针头，开始血液净化。进行血液净化时，先从补液输入接头12处加入营养液，维持患者良好的身体状况。在第一血浆采集口8处，采集血浆10ul进行PCR，测得病毒DNA浓度为7×10⁹拷贝/mL。40min后，在第二血浆采样口15处，采集10uL血浆进行PCR测定，测得病毒DNA浓度为4×10¹拷贝/mL，血液净化完毕。

经过血液净化的患者，恢复一段时间后，患者主要症状得到缓减：面部红斑减少；血液中血小板数增加；咳嗽减少，呼吸容易；头疼缓减。

Claims (5)

1、一种特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱，其特征在于：

包括吸附载体、活化剂和抗病毒表面蛋白抗体；

在吸附载体上加入活化剂得活化载体，在活化载体中加入抗病毒表面蛋白抗体进行抗体偶联得免疫吸附剂，免疫吸附剂装入吸附柱即得亲和吸附柱。

2、按权利要求1所述的亲和吸附柱，其特征在于：

所述的吸附载体是一种临床常用的血液净化材料，包括树脂、玻璃纤维、淀粉微球、大孔共聚物和活性炭。

3、按权利要求1所述的亲和吸附柱，其特征在于：

所述的活化剂为1，4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚，即BDDE。

4、按权利要求1所述的亲和吸附柱，其特征在于：

所述的抗病毒表面蛋白抗体是一种与病毒表面蛋白特异性结合的蛋白质；

其来源是：

通过单克隆抗体技术制备抗病毒表面蛋白抗体，即Ab。

5、按权利要求1所述的亲和吸附柱的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

①活化载体

将树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，再按照1g/2L加入浓度为0.2moL/L的NaOH溶液，边搅拌边滴加活化剂BDDE，在40～50℃下反应4h，抽干后，用蒸馏水洗涤载体，即得活化载体；

②抗体偶联

在1g活化载体中加入3L、0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液和1g抗病毒表面蛋白抗体，在0～4℃下反应24h，用0.2mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液淋洗活化载体，即得免疫吸附剂；

③亲和吸附

将免疫吸附剂装入吸附柱即得亲和吸附柱。

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