CN115010804A - 一种在线分离高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在线分离高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备，生产方法包括将血浆引入蛋白A免疫吸附柱，吸附完成后进行洗脱；收集洗脱液，在线稀释后经过阴离子交换膜纯化，使用截留分子量为6KD的中空纤维膜超滤浓缩置换缓冲液，然后用截留分子量为200KD的中空纤维膜除去多聚体，最后用纳滤膜除病毒，除菌过滤即得到可静脉注射的免疫球蛋白。本发明一些实例的方法，只需要两步层析技术即得到符合药典静注人免疫球蛋白（pH 4）标准的蛋白溶液，得到的免疫球蛋白溶液的蛋白质含量大于50g/L，纯度大于95%，多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%，最大限度保证收集到的免疫球蛋白以单体形式存在，蛋白活性和安全性更高，该方法操作简单，快速。
Description
技术领域
本发明涉及血液制品的生产方法及设备，具体涉及高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备。
背景技术
人体免疫系统受到抗原（如病毒）刺激后，机体能产生一类特异性结合病毒蛋白（病毒抗原）的免疫球蛋白，即抗体。抗体是机体对付病原入侵（如病毒感染）的重要武器。机体初次受到抗原刺激时，最先产生IgM抗体，随后将快速产生大量IgG，分布于血液和组织液中，IgG持续时间长，是血液中含量最多的一类抗体；接下来还产生IgA抗体，分泌到人体对外接触的腔道粘膜表面，发挥免疫防御作用。当然，也还可产生少量的IgD和IgE抗体。研究发现，绝大多数急性病毒感染性疾病发病1周后出现特异性抗体IgM，但IgM 4周后基本转阴，而IgG持续时间长，下降缓慢。科学家们发现了针对SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体的变化规律，IgM抗体在发病10至14天时出现并很快达到高峰，90天时基本消失。IgG型抗体可在10至14天时检测到，但滴度较低，60天时达到高峰，90天后仍维持在高水平。并且所有参加调查的康复期患者都发现有IgG型抗体存在，这些抗体赋予了康复患者抵御同种病毒再次攻击的能力（news.sina.com.cn/o/2003-05-14/1248122432s.shtml）。康复患者体内产生的抗病毒特异性抗体，能有效地治疗病毒感染患者。
有3名医务工作者在感染SARS病毒后，采用康复者的血浆治疗，在血液中病毒载量很高的情况下，输注康复者的血浆24小时后，血液中的病毒就被清除了，最后3名医务工作者都健康出院（Yeh KM, et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 56(5): 919-922.）。除此之外，不少科研文献也报道了血清抗体疗法的有效性。2015年英国研究人员为了给中东呼吸综合征（MERS）的紧急治疗提供可行的治疗方案和依据，对过去32个用康复者血浆/血清治疗SARS或流感的研究进行了汇总分析，结论认为该疗法可明显降低病毒载量和患者死亡率（Mair-Jenkins J, Saavedra-Campos M, Baillie J K, et al.6.The Journal of infectious diseases, 2015, 211(1): 80-90.）。另外，研究人员设计了一个多中心、随机、双盲、对照试验，利用从康复者捐献的血浆中提取的抗体，治疗严重甲型H1N1流感患者，结果发现在发病后5天内使用抗体治疗，可有效降低死亡率和病毒载量（Hung IFN, et al. Chest 2013, 144(2):464-473.）。2021年8日30日，国药集团中国生物研制的静注COVID-19人免疫球蛋白（pH4）获得国家药品监督管理局颁发的《药物临床试验批件》，批准开展临床试验。综上所述，康复患者的血浆中提取特异性抗体并经过高度提纯后的静注人免疫球蛋白是治疗重症患者的首选特效药。
目前关于人血浆中免疫球蛋白的制备方法都是以Cohn组分为原料进行进行分离，主要通过低温乙醇沉淀或辛酸沉淀，然后经阴离子交换层析、硅藻土压滤、纳米膜除病毒，除菌过滤等方式制备，只是在具体工艺参数的设置上有所不同。
博雅生物公开了一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺（CN104231075A）及一种狂犬病人免疫球蛋白制备工艺（CN104193822A），包括低温乙醇压滤法、阴离子层析法、超滤法、纳米过滤法、二次超滤和洗烘灌联动分装工艺技术提取分离免疫球蛋白。
国药集团武汉血液制品有限公司公开了一种静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法，采集含有COVID-19抗体的血浆经低温乙醇沉淀，超滤，除菌除病毒后获得静注COVID-19人免疫球蛋白。
深圳卫光生物公开了静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的制备方法（CN102286099A），采用辛酸沉淀和阴离子交换层析的方法。该公司也公开了新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法（CN112375142A），收集病人的血浆进行病毒灭活后用Protein A和Protein G两种亲和凝胶分别捕获血浆中IgG1、IgG2、IgG4和IgG3亚型，亲和层析后再用阴离子凝胶进一步纯化，去除白蛋白、IgA、IgM杂质，获得静注人免疫球蛋白。
CN104001172A公开了乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，用辛酸沉淀和阴离子交换层析的方法制备。CN112225799A和CN112010968A公开了自动化分离系统快速提取COVID-19患者康复期血浆的方法，将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将所该血浆冻存，得到可用于制备静注免疫球蛋白G的血浆。再经低温乙醇沉淀方法制备静注免疫球蛋白G。
CN105126100A 公开了一种富含IgM的人免疫球蛋白制剂及其制备方法，通过不同的缓冲液洗脱将IgA和IgM分开，然后取IgM组分与IgG混合，得到免疫球蛋白制剂。CN101591392B公开了肠道病毒7I型静注人免疫球蛋白的制备方法，取富含抗体的血浆经低温乙醇沉淀和层析法制备而成。CN105037487A 公开了一种人血白蛋白的制备方法，用乙醇沉淀和离子交换层析的方法制备。
上述纯化方法均需要先采集病人的血浆，进行病毒灭活处理后再进行纯化，需要大量的血浆，特别是针对某一种疾病传染初期，特异性病人血浆来源更少，不利于短期大量储存以满足应急需要。还需开发更多的更有效的特异性抗体获取方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供高纯度免疫球蛋白的生产方法及设备。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种在线制备高纯度免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
将血浆引入蛋白A免疫吸附柱，吸附完成后进行洗脱；
收集洗脱液，在线稀释后经过阴离子交换膜纯化，使用截留分子量为6KD的中空纤维膜超滤浓缩置换缓冲液，然后用截留分子量为200KD的中空纤维膜除去多聚体，最后用纳滤膜除病毒，除菌过滤即得到可静脉注射的免疫球蛋白。
在一些方法的实例中，在蛋白A免疫吸附柱饱和后，使用平衡液平衡后，之后使用洗脱液洗脱；其中：
所述平衡液为pH=7.0-7.5 的磷酸缓冲液；和/或
所述洗脱液为pH 2.8-4.0，100mM~150mM的甘氨酸缓冲液或枸橼酸含量为0.19％～0.24％的枸橼酸缓冲液。
在一些方法的实例中，所述洗脱液经HAC-NaAC缓冲液稀释后进入离子交换膜；和/或
所述阴离子交换膜表面基团为季氨基；和/或
所用蛋白A免疫吸附柱的配基为经改造的重组蛋白A，对人IgG吸附性能较高，对IgA和IgM吸附性能较低；和/或
所述免疫球蛋白中，IgA含量低于0.05%、IgM含量低于0.001%、免疫球蛋白多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%。
在一些方法的实例中，所述HAC-NaAC缓冲液的pH为6.50～7.0，离子浓度为0.1～0.15M。
在一些方法的实例中，所述中空纤维膜超滤浓缩时将缓冲液置换为pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；和/或浓缩至蛋白浓度大于50mg/mL时停止浓缩。
在一些方法的实例中，所述血浆为病毒感染后康复者或接种疫苗后的健康人体的血浆，用于分离提纯特用于重症患者特异性治疗的抗体。
在一些方法的实例中，所述病毒选自SARS病毒、MERS病毒、SARS-Cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒、呼吸道合胞病毒；所述疫苗为抗SARS病毒、MERS病毒、SARS-Cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒或呼吸道合胞病毒的疫苗。
本发明的第二个方面，提供：
一种高纯度免疫球蛋白的生产装置，包括：
第一储液区，用于储存多种溶液；
蛋白A免疫吸附柱，其进液端通过管路与第一储液区连通，其出液端通过管路与废液袋、离子交换膜相连通；
离子交换膜，其进液端分别与蛋白A免疫吸附柱和第二储液区连通，其出液端与中空纤维膜的进液端相连通，所述中空纤维膜的截留分子量为6KD和200KD；
中空纤维膜，其进液端分别与离子交换膜的出液端和第三储液区连通，其出液端与废液袋、纳滤除菌膜相连通，所述纳滤除菌膜的出液端与成品收集袋相连通。
在一些生产装置的实例中，所述蛋白A免疫吸附柱的进液端还通过管路与所述血浆分离器的血浆出口相连通，蛋白A免疫吸附柱的出口端通过管路与所述血浆分离器的血细胞出口相连通，吸附后的血浆与血细胞混合后回输至人体内；所述血浆分离器的进液端还连通有第四储液区。
在一些生产装置的实例中，所述第一储液区的溶液包括：第一预冲洗液、平衡液、洗脱液；
所述第二储液区的溶液包括HAC-NaAC缓冲液；
所述第三储液区的溶液包括pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；
所述第四储液区的溶液包括第二预冲洗液。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的方法，只需要两步层析技术即得到符合药典静注人免疫球蛋白（pH 4）标准的蛋白溶液，得到的免疫球蛋白溶液的蛋白质含量大于50g/L，纯度大于95%。该方法操作简单，快速。
本发明一些实例的方法，使用6KD孔径的中空纤维膜进行超滤浓缩置换缓冲液，然后用200KD的中空纤维膜除去多聚体，因IgG单体大小150KD，而IgA部分以二聚体形式存在，IgM以五聚体的超大分子存在。用200KD的孔径进行浓缩能够去除免疫球蛋白中的多聚体，使多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%，最大限度保证收集到的免疫球蛋白以单体形式存在，蛋白活性和安全性更高。
本发明一些实例的方法，通过低pH (2.8-4.0)洗脱及纳滤除病毒，过滤除菌工艺保证了产品的安全性。
本发明一些实例的方法，使用CN102698717B和CN110026166B的蛋白A吸附材料作为蛋白A免疫吸附柱的配基，该吸附柱对IgG的吸附性能大大增加，通过竞争抑制作用，降低了对IgA、IgM的吸附，有利于获得更纯的免疫球蛋白溶液。该蛋白A免疫吸附柱已通过国家三类医疗器械认证（国械注准20143102368），用于临床上吸附以IgG为主(或属于IgG型)的抗体。该产品自2016年应用于临床治疗以来，已经在全国上百家医院完成上千例患者的治疗，安全性和有效性已得到充分证实。蛋白A吸附柱的配基重组葡萄球菌蛋白A能够特异性结合人IgG的Fc段，选择性高。蛋白A免疫吸附方法每次可从一例康复患者体内分离出15-20克免疫球蛋白，吸附后的血浆回输至康复者体内，不需要康复者捐献血浆。所以一般而言，捐献者可以多次捐献，每隔几天就可以捐献一次。而传统方法一次献血（全血）不超过400ml（内含血浆约200-240ml），并且半年内只能捐献一次，每次仅能利用或提取约2-3克。特别是在传染病爆发初期，康复者人群极少，几乎无法采集到大量的血浆，临床应用受限。本发明中的特异性免疫球蛋白分离系统，约4h 即可以从一例康复者中提取到15g以上的抗体，满足更多的患者需要。
本发明一些实例的方法，通过可用于临床的蛋白A免疫吸附柱、阴离子交换膜、除病毒、除菌等步骤制备成蛋白浓度达到50mg/mL 以上的可用于临床的注射药物。
本发明一些实例的方法，通过调节离子交换膜缓冲液的pH至6.5-7.0，使得IgA和IgM (IgA的等电点为7.4，IgM的等电点为7.0)不易吸附至填料上，从而进一步提高IgG的纯度。同时，通过大孔径的中空纤维膜过滤，有效去除了抗体中的IgA、IgM多聚体，提高了蛋白的纯度及安全性。
本发明一些实例的方法，可以在线分离人免疫球蛋白溶液，不需要康复者捐献血浆即可在短期内获得大量的应急用特异性免疫球蛋白，对突发公共卫生事件的预防具有重要意义。同时吸附后的血浆依然可以回输至体内，避免人体血浆的大量缺失。
本发明一些实例的生产设备，通过离子交换膜替代了传统的吸附柱，中空纤维膜替代传统的超滤系统节省了仪器的空间体积，便于移动，适应个性化要求，实现了设备的小型化，实现了在线分离提取纯化功能。
附图说明
图1是本发明一些实例生产设备的原理示意图。
图2是免疫球蛋白高效液相色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，实施方式的示例在附图中示出，其中相同或类似的标号自始至终表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，若干的含义是一个或者多个，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”以及“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个特征。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接或活动连接，也可以是可拆卸连接或不可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接或可以相互通信；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通、间接连通或两个元件的相互作用关系。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
实施例1：一种高纯度免疫球蛋白的生产装置
参照图1、一种高纯度免疫球蛋白的生产装置，包括：
第一储液区，用于储存多种溶液；
蛋白A免疫吸附柱，其进液端通过管路与第一储液区连通，其出液端通过管路与废液袋、离子交换膜相连通；
离子交换膜，其进液端分别与蛋白A免疫吸附柱和第二储液区连通，其出液端与中空纤维膜的进液端相连通，所述中空纤维膜的截留分子量为6KD和200KD；
中空纤维膜，其进液端分别与离子交换膜的出液端和第三储液区连通，其出液端与废液袋、纳滤除菌膜相连通，所述纳滤除菌膜的出液端与成品收集袋相连通；
血浆分离器，所述蛋白A免疫吸附柱的进液端还通过管路与所述血浆分离器的血浆出口相连通，所述血浆分离器的进液端还连通有第四储液区；
所述第一储液区的溶液包括：第一预冲洗液、平衡液、洗脱液(溶液2～4)；
所述第二储液区的溶液包括HAC-NaAC缓冲液(溶液5)；
所述第三储液区的溶液包括pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液(溶液6)；
所述第四储液区的溶液包括第二预冲洗液(溶液1)；
各储液区均配置有相应的泵及控制阀。
使用时，先使用第二预冲洗液(溶液1，生理盐水及含肝素的生理盐水)对血浆分离器进行预冲，使用第一预冲洗液(溶液2，生理盐水及含肝素的生理盐水) 对蛋白A吸附柱进行预冲。预冲完毕后，通过穿刺康复者动静脉内瘘建立血液体外循环通路，将血浆分离器分离出的血浆通过进样泵引入蛋白A免疫吸附柱，蛋白A免疫吸附柱吸附血浆至饱和后，停止血浆分离及免疫吸附。打开K3阀门，吸附柱用溶液3-平衡液平衡，然后打开K4阀门，用溶液4-洗脱液洗脱收集洗脱液。收集的洗脱液通过溶液5-HAC-NaAC缓冲液在线稀释后经过离子交换膜纯化，中空纤维膜超滤浓缩将缓冲液置换为溶液6-pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液，最后用纳滤膜除病毒，除菌过滤即得到可静脉注射的免疫球蛋白。
实施例2：不同蛋白A及不同合成方法得到的免疫吸附剂对免疫球蛋白的结合性能对比
优化前：蛋白A免疫吸附柱的配基为天然蛋白A的B结构域，E、D、A、B、C结构域的氨基酸序列同源性极高（Arora ,et al.Biochemistry 2006）。蛋白A免疫吸附填料的合成方法详见专利CN102000550A实施例1，其中蛋白A溶液的加入量提高至30mg/mL琼脂糖，其它不变。
优化后：蛋白A免疫吸附柱的配基为高稳定性蛋白A，详见专利CN202110289189.0中SEQ-12。蛋白A免疫吸附填料的合成方法详见专利CN201910353718.1实施例1和实施例2，其中重组蛋白A的加入量提高至30mg/mL琼脂糖，其它不变。
吸附性能检测方法：
S1) 取不同方法合成的免疫吸附填料，模拟临床试验，取2.2 mL 蛋白A免疫吸附填料于3 mL层析柱中，用30mL的PBS以1.0 mL/min的流速冲洗柱子；
S2) 将88 mL的健康人血浆置于烧杯中用恒温磁力搅拌器加热搅拌至37℃，将柱子进样端和回流端置于健康人血浆中，以1.0 mL/min的流速过柱；
S3) 循环1h后从血浆池中取样1 mL，用生化分析仪测定各免疫球蛋白含量，计算吸附性能。
结果如表1所示。
表1、优化前后蛋白A免疫吸附剂对血浆中各免疫球蛋白的吸附性能对比
| 优化前免疫吸附剂 | 优化后免疫吸附剂 | |
| 对IgG吸附性能（mg/ml） | 70 | 85 |
| 对IgA吸附性能（mg/ml） | 28 | 19 |
| 对IgM吸附性能（mg/ml） | 9.5 | 4.5 |
| IgA占免疫球蛋白比例（%） | 26.05 | 17.51 |
| IgM占免疫球蛋白比例（%） | 8.84 | 4.15 |
实施例3：在线分离装置分离新冠特异性免疫球蛋白
S1) 检测机器配套的溶液状态正常；
S2) 按照该装置安装说明书连接管路；
S3) 生理盐水及含肝素(肝素含量0.04mg/mL)的生理盐水对血浆分离器进行预冲30min，流速为100-120 mL/min；预冲的废液收集在废液袋内；
S4) 生理盐水及含肝素(肝素含量0.04mg/mL)的生理盐水对蛋白A吸附柱进行预冲30 min，流速为30-40 mL/min；预冲的废液收集在废液袋内；
S5) 新冠康复患者通过穿刺动静脉内瘘建立血液体外循环通路，血泵流速100～120mL/min，血浆流速30～40mL/min，血浆分离器分离出的血浆引入预冲后的蛋白A吸附柱内进行吸附，吸附时间60min，血浆分离器分离出的其余组分输入患者体内；
S6) 使用pH=7.2的磷酸缓冲液对吸附后的蛋白A吸附柱进行平衡，平衡时间7min；
S7) 使用pH 2.8，100mM的甘氨酸缓冲液对平衡后的蛋白A吸附柱进行洗脱，收集洗脱液；
S8) 洗脱液通过HAC-NaAC缓冲液(pH为6.50，离子浓度为0.12M)稀释后进入阴离子交换膜，阴离子交换膜表面基团为季氨基；
S9) 阴离子交换膜处理后的液体通过无菌无热原、截留分子量为6KD和200KD的中空纤维膜进行超滤浓缩，将HAC-NaAC缓冲液置换为pH=4.0，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液，通过在线检测系统检测蛋白浓度大于50mg/mL时停止浓缩；
S10)浓缩的蛋白溶液经20nm的纳米膜过滤，再经0.22μm的无菌过滤膜过滤除菌，即得终产品溶液，即静注新冠特异性免疫球蛋白。
收集除菌过滤后的储液袋内的样品，取出部分进行检测。图2是免疫球蛋白高效液相色谱图，可以看出纯化后的免疫球蛋白的多聚体含量为1.21%，单体及二聚体总和为98.80%，蛋白纯度较高。
对比例1：
按照实施例3的方法进行纯化蛋白，区别在于，S8）HAC-NaAC缓冲液改为pH=4.5，离子浓度为0.02M。其它不变。
对比例2：
按照实施例3的方法进行纯化蛋白，区别在于，S8）HAC-NaAC缓冲液改为pH9.20.01M Tris-HCl 缓冲液，然后用pH9.2，0.15M Tris-HCl 缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。其它不变。
表2、不同纯化条件的蛋白纯度及得率
| 多聚体含量（%） | 免疫球蛋白纯度（%） | 蛋白回收率（%） | |
| 实施例3 | 1.21 | 98.80 | 90.38 |
| 对比例1 | 5.13 | 93.41 | 78.91 |
| 对比例2 | 0.125 | 98.14 | 52.29 |
由表2可知，离子交换层析的pH和离子浓度对免疫球蛋白的纯度影响较大，当缓冲液pH=4.5，离子浓度为0.02M时，纯度为93.41%，不合格。当离子交换层析用吸附-洗脱模式进行纯化时，免疫球蛋白纯度可以达到要求，纯度为98.14%，但是蛋白得率偏低，损失了近一半的蛋白，此工艺也是不可行的。
对比例3：
按照实施例3的方法进行纯化蛋白，区别在于S9）中空纤维截留分子量为6KD，不使用200KD的中空纤维膜进一步过滤。测定收集的免疫球蛋白中多聚体的含量。
表3、不同纯化条件下免疫球蛋白的成分分析
| 分子大小分布（单体+二聚体）（%） | 多聚体含量（%） | IgA含量（%） | IgM含量（%） | |
| 实施例3 | 98.80 | 1.21 | 0.02 | 0.00037 |
| 对比例3 | 95.109 | 4.881 | 0.08 | 0.0025 |
由表3可以看出，用200KD的大孔径可以进一步去除大分子多聚体的含量，如果不使用200KD的孔径进行过滤，得到的免疫球蛋白的纯度和多聚体的含量在合格边界线上，杂蛋白IgA和IgM的含量均较高，蛋白质量有所降低。
对比例4
按照CN112375142B实施例1公开的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，经过血浆病毒灭活、两步亲和层析、超滤透析、阴离子交换层析、纳米膜除病毒过滤、超滤等步骤，获得人免疫球蛋白最终产品。其检测结果如表4所示。
表4、特异性免疫球蛋白检测结果
由表4可以看出，采用本发明所述的蛋白纯化方法，与CN112375142B复杂的纯化方法相比，纯化后蛋白浓度和纯度均可以达到药典注射用免疫球蛋白的浓度要求（浓度大于50mg/mL，单体及二聚体含量大于95%），杂蛋白IgA、IgM含量较低。其它安全性指标如激肽释放酶原激活剂、抗补体活性、抗A、抗B血凝素、无菌、内毒素、微粒均达到了药典要求。特异性免疫球蛋白活性即COVID-19抗体滴度测定结果表明纯化后的免疫球蛋白中含有抗新冠病毒的特异性抗体。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种在线制备高纯度免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：
将血浆引入蛋白A免疫吸附柱，吸附完成后进行洗脱；
收集洗脱液，在线稀释后经过阴离子交换膜纯化，使用截留分子量为6KD的中空纤维膜超滤浓缩置换缓冲液，然后用截留分子量为200KD的中空纤维膜除去多聚体，最后用纳滤膜除病毒，除菌过滤即得到可静脉注射的免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在蛋白A免疫吸附柱饱和后，使用平衡液平衡后，之后使用洗脱液洗脱；其中：
所述平衡液为pH=7.0-7.5 的磷酸缓冲液；和/或
所述洗脱液为pH 2.8-4.0，100mM~150mM的甘氨酸缓冲液或枸橼酸含量为0.19％～0.24％的枸橼酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液经HAC-NaAC缓冲液稀释后进入离子交换膜；和/或
所述阴离子交换膜表面基团为季氨基；和/或
所用蛋白A免疫吸附柱的配基为经改造的重组蛋白A，对人IgG吸附性能较高，对IgA和IgM吸附性能较低；和/或
所述免疫球蛋白中，IgA含量低于0.05%、IgM含量低于0.001%、免疫球蛋白多聚体含量低于1.5%，二聚体含量低于2.5%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HAC-NaAC缓冲液的pH为6.50～7.0，离子浓度为0.1～0.15M。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维膜超滤浓缩时将缓冲液置换为pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；和/或浓缩至蛋白浓度大于50mg/mL时停止浓缩。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为病毒感染后康复者或接种疫苗后的健康人体的血浆，用于分离提纯特用于重症患者特异性治疗的抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒选自SARS病毒、MERS病毒、SARS-Cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒、呼吸道合胞病毒；所述疫苗为抗SARS病毒、MERS病毒、SARS-Cov-2病毒、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、流感病毒、手足口病毒或呼吸道合胞病毒的疫苗。
8.一种高纯度免疫球蛋白的生产装置，其特征在于，包括：
第一储液区，用于储存多种溶液；
蛋白A免疫吸附柱，其进液端通过管路与第一储液区连通，其出液端通过管路与废液袋、离子交换膜相连通；
离子交换膜，其进液端分别与蛋白A免疫吸附柱和第二储液区连通，其出液端与中空纤维膜的进液端相连通，所述中空纤维膜的截留分子量为6KD和200KD；
中空纤维膜，其进液端分别与离子交换膜的出液端和第三储液区连通，其出液端与废液袋、纳滤除菌膜相连通，所述纳滤除菌膜的出液端与成品收集袋相连通。
9.根据权利要求8所述的生产装置，还包括血浆分离器，所述蛋白A免疫吸附柱的进液端还通过管路与所述血浆分离器的血浆出口相连通，蛋白A免疫吸附柱的出口端通过管路与所述血浆分离器的血细胞出口相连通，吸附后的血浆与血细胞混合后回输至人体内；所述血浆分离器的进液端还连通有第四储液区。
10.根据权利要求9所述的生产装置，其特征在于，所述第一储液区的溶液包括：第一预冲洗液、平衡液、洗脱液；
所述第二储液区的溶液包括HAC-NaAC缓冲液；
所述第三储液区的溶液包括pH=3.8～4.4，含5%葡萄糖-氯化钠的缓冲液；
所述第四储液区的溶液包括第二预冲洗液。
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