CN105315366A - 一种静注人免疫球蛋白（ph4）的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，包括如下步骤：（1）组分II+III沉淀的悬浮；（2）低温抽提；（3）压滤；（4）超滤透析脱醇；（5）阴离子交换柱层析；（6）超滤浓缩及调节；（7）低PH孵化；（8）纳米膜除病毒过滤；（9）除菌过滤并分装。本发明采用含乙醇的抽提液，使IgG在低温下选择性溶出，再经一步阴离子交换柱层析完成对IgG的纯化；制备过程中无添加高浓度乙醇的操作，减少了乙醇对蛋白的变性损伤作用；超滤过程中，采取了蛋白保护措施减少了蛋白的剪切损伤；本发明工艺流程简洁，工序少，大大缩短了生产周期；制品的多聚体、IgA、PKA及ACA含量均比传统工艺大幅下降，得率超过2000瓶/吨血浆，远高于传统工艺。

Description

一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及一种血制品的制备方法，具体是涉及一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法。

背景技术

人免疫球蛋白（immunoglobulin）是一种具有抗体活性的蛋白质,主要存在于血浆中，也见于其它体液、组织和一些分泌液中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类,人体血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，占总免疫球蛋白的70-75%，分子量约15万，含糖2～3%。IgG分子由4条肽链组成。其中分子量为2.5万（23kD）的肽链，称轻链（L链），分子量为5万的肽链（50～60kD），称重链（H链）。轻链与重链之间通过二硫键（—S—S—）相连接。

人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中起到主导作用，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。IgG是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用。此外，IgG还具有调理吞噬和结合SPA等作用。

人免疫球蛋白分肌注人免疫球蛋白和静注人免疫球蛋白，肌注人免疫球蛋白主要用于预防麻疹和传染性肝炎，临床上广泛使用其它一些特殊的肌注人免疫球蛋白如抗乙肝人免疫球蛋白、抗狂犬病人免疫球蛋白、抗破伤风人免疫球蛋白等，若与抗生素合并使用，可提高对某些严重细菌和病毒感染的疗效。

静注人免疫球蛋白即IVIG是至少从1000个以上健康供血者所献血浆混合后提取而来的，含有各种抗病毒、细菌抗原特异性抗体，具有调节中和作用，经静脉注射后可迅速提高使受者血液中IgG水平。故IVIG起效快,疗效好，副作用少，成为临床上人免疫球蛋白使用最频繁、使用量最大的的品种.IVIG最初多用于治疗多种原发性免疫球蛋白缺陷症和各种继发性免疫缺乏症如免疫介导的血小板减少、川崎病等，目前，已经将IVIG的临床应用拓展到50多种疾病如再生障碍性贫血贫血、新生儿溶血病、输血后紫癜、特发性血小板减少性紫癜、癫痫、重症肌无力、多发性硬化症、多发性骨髓瘤、多发性肌炎、多发性神经病，脏器肿大，艾滋病等，在危重症的抢救中起着越来越重要的作用。

由于国内血浆采集量有限，国内IVIG的市场供应量远远满足不了临床需求，各血制品公司都在设法改进工艺以期用有限的血浆获得更多的IVIG产品。目前国内传统的生产工艺大都采用低温乙醇法或改良的低温乙醇工艺。如专利CN104479011A,将I+II+III溶解后，先经两步低温乙醇（15%，V/V）沉淀，压滤除去大部分杂蛋白，然后将上清液（组分II）在中性条件下加乙醇(20%,V/V)沉淀出来，将沉淀复溶，经过超滤、透析、浓缩,再加乙醇(2%,V/V)沉淀一次，压滤收集上清液，再次超滤透析、浓缩加入保护剂后无菌分装。专利CN103554253A以组分II+III为起始原料，溶解后加乙醇（18%，V/V）沉淀，压滤收集上清液，然后透析脱醇、脱盐，经过两步柱层析，收集流穿液，再次超滤、透析、浓缩，除菌过滤后孵化，后除病毒过滤再无菌分装得成品。

不难看出，目前的低温乙醇法工艺大都需要多次乙醇沉淀，频繁地在蛋白溶液中添加乙醇，不可避免地造成蛋白局部变性受损，而蛋白的频繁凝结与溶解，亦对蛋白的分子结构造成损伤。另外，现有的低温乙醇沉淀工艺均采用先将全部蛋白充分溶解，再加乙醇选择性地沉淀目标蛋白或杂蛋白，不可避免地造成蛋白共沉淀现象，从而使得产品的纯度不是很高；有的工艺虽然也用到柱层析纯化，但多采用两步柱层析，使得流程复杂，得率下降。

本发明以组分II+III为起始原料，以一步低温抽提技术外加一步柱层析完成对IgG的纯化，流程简洁，工序少，大大缩短了生产周期；制品的纯度高，而多聚体、IgA、PKA及ACA均低于传统工艺，得率则远高于传统工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺先进，操作便利，产品质量稳定，得率高、可工业化生产的静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法。

1，一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，包括如下步骤：

（1）组分II+III沉淀的悬浮

按一定的稀释比，将组分II+III沉淀投入到预先配制的溶解缓冲液中均匀搅拌1-3小时，使沉淀充分悬浮分散；

（2）低温抽提

将步骤（1）得到的悬浮液与预先配制的含乙醇的低温抽提液混合，搅拌3-5小时，使目标蛋白充分抽提，得到均匀的悬浮液；

（3）压滤

将步骤（2）得到的悬浮液在-3~-1℃下压滤，收集滤液,及时在滤液中加入山梨醇3-5%（w/w），充分搅拌使其溶解；

（4）超滤透析脱醇

用截留分子量10K-30K的超滤膜浓缩步骤（3）得到的滤液，然后用4-6倍体积的透析液1恒体积透析脱去乙醇，得到粗纯的IgG溶液；

（5）阴离子交换柱层析

步骤（4）得到的IgG溶液上阴离子交换柱，控制上样液的线流速不高于100cm/h，柱子预先用平衡缓冲液平衡；收集流穿液，上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，冲洗液并入流穿液中；

（6）超滤浓缩及调节

用截留分子量10K-30K的超滤膜浓缩步骤（5）得到的流穿液，然后用透析液2恒体积透析4-6倍，然后浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)左右，转移出超滤膜包并用透析液2后洗膜包，再用透析液2调蛋白浓度至5.30-5.50%(w/v)，用0.5M盐酸溶液调蛋白溶液PH至3.95-4.15；

（7）低PH孵化

用0.22微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化21天；

（8）纳米膜除病毒过滤

用20纳米的滤芯过滤步骤（7）孵化结束的蛋白溶液以去除病毒；

（9）除菌过滤并分装。

2，步骤（1）所述的稀释比为1：8-12，即一份重量的组分II+III沉淀加入到8-12份重量的溶解缓冲液中；所述的溶解缓冲液为20-40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；溶解缓冲液的PH值为4.00-5.00，溶解缓冲液的温度为0-1℃。

3，步骤（2）所述的抽提液，其重量是步骤（1）所得悬浮液总重的0.8-1.2倍；

所述的抽提液为20-40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；其中含乙醇11-14%(v/v)；抽提液的PH值为5.00-6.00，抽提液的温度为-5~-4℃。

4，步骤（4）所述的透析液1为10-20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，透析液1的PH5.20-6.00，透析液1的温度1-5℃，透析液1中含山梨醇3-5%(w/w)。

5，步骤（5）所述的阴离子交换柱所用填料为CaptoQ、CaptoDEAE、QSepharoseFF及DEAESepharoseFF中的任意一种；所述的平衡缓冲液为10-20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，平衡缓冲液的PH为5.20-6.00。

6，步骤（6）所述的透析液2为5%(w/w)山梨醇的水溶液，透析液2的温度为2-8℃。

本发明的优越性

（1），采用低浓度乙醇抽提液低温下使组分II+III中的目标蛋白选择性溶出，而其它杂蛋白则处于凝结状态;经过一步抽提即达到较高的IgG纯度。

（2），采用的乙醇抽提液是预先配制并冷却至低温的，省却了在蛋白溶液中加乙醇的操作，从而避免了乙醇对蛋白的变性损伤。

（3）采用一步低温抽提技术，避免了传统工艺多次加乙醇进行沉淀的操作，节省了大量的时间。

（4），超滤透析操作中，蛋白溶液与透析液中均添加蛋白保护剂，避免了超滤操作对蛋白的剪切损伤。

（5），本发明工艺采用低温抽提技术结合离子交换柱层析技术完成对IgG的纯化，工序少，能耗低，纯度与得率均明显提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施例只是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，不可理解为对本发明权力保护范围的限定，相反，对于本领域的普通科研人员而言，凡利用本发明进行的任何非实质性的改动或调整，均应落入本发明的保护范围之内。

实施例一，

1，组分II+III沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀10kg，投入80kg溶解缓冲液（20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.10-4.20,0~1℃）中，均匀搅拌3小时，使沉淀充分悬浮；

2，低温抽提：将以上悬浮液与90kg含乙醇12%（v/v）的抽提液（20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH5.90-6.00，-5~-4℃）混合，搅拌5小时，使目标蛋白从沉淀中充分抽提，得到均匀悬浮液；

3，压滤：在-3~-1℃下压滤以上悬浮液，并后洗沉淀，共收集滤液173kg,加入山梨醇8.7kg，充分搅拌使其溶解；

4，透析脱醇：用30k超滤膜浓缩以上滤液，控制进口压力不高于20PSI，浓缩至约16kg，然后用64kg的透析液1（20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.50-5.60，山梨醇5%(w/w)，1-2℃）恒体积透析脱去乙醇，然后转移并用约64kg的透析液后洗超滤膜，收集80.7kg；

5，阴离子交换柱层析：以90-100cm/h的上柱线速度上CaptoQ柱，柱子预先用平衡缓冲液(20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.60-5.70）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；

6，透析浓缩并调节：用30k超滤膜浓缩以上流穿液至约15kg，然后用5%山梨醇水溶液60kg进行透析，再次浓缩后转移并后洗超滤膜，收集18.5kg；测蛋白浓度6.94%(w/v)，用5%(w/w)山梨醇水溶液调蛋白浓度至5.35%(w/v)，用0.5M稀盐酸调蛋白溶液PH至3.95-4.05;称重24.0kg；

7，低PH孵化：用0.22微米的除菌滤芯除菌过滤后置于室温孵化21天；

8，纳米膜除病毒过滤：用20nm滤芯除病毒过滤；

9，除菌过滤后分装得到成品。

实施例二，

1，组分II+III沉淀悬浮：称取组分II+III沉淀10kg，投入120kg溶解缓冲液（40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.90-5.00,0~1℃）中，均匀搅拌1小时，使沉淀充分悬浮；

2，低温抽提：将以上悬浮液与105kg含14%(v/v)乙醇的抽提液（40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH5.40-5.50，-5~-4℃）混合，搅拌3小时，使目标蛋白从沉淀中充分抽提，得到均匀悬浮液；

3，压滤：在-3~-1℃下压滤以上悬浮液，并后洗沉淀，共收集滤液235kg,加入山梨醇7.1kg，充分搅拌使其溶解；

4,透析脱醇：用30k超滤膜浓缩以上滤液，控制进口压力不高于20PSI，浓缩至约16kg，然后用96kg的透析液（30mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.90-6.00，山梨醇5%(w/w)，1-2℃）恒体积透析脱去乙醇，然后转移并用约80kg的透析液后洗超滤膜，共收集97.1kg；

5，阴离子交换柱层析：以50-60cm/h的上柱线速度上QSepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡，平衡液为40mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.90-6.00，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；

6，透析浓缩并调节：用10k超滤膜浓缩以上流穿液至约15kg，然后用5%山梨醇水溶液80kg进行透析，再次浓缩后转移并后洗超滤膜，收集17.1kg，测蛋白浓度6.81%(w/v)，用含5%(w/w)山梨醇的水溶液稀释浓缩液，调蛋白浓度至5.35%(w/v)，用0.5M稀盐酸调蛋白溶液PH至3.95-4.05;称重21.8kg；

7~9，同实施例一。

实施例三，

1，组分II+III沉淀悬浮：称取组分II+III沉淀10kg，投入100kg溶解缓冲液（30mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.50-4.60,0~1℃）中，均匀搅拌2小时，使沉淀充分悬浮；

2，低温抽提：将以上悬浮液与120kg含11%(v/v)乙醇的抽提液（30mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH5.70-5.80，-5~-4℃）混合，搅拌4小时，使目标蛋白从沉淀中充分抽提，得到均匀悬浮液；

3，压滤：在-3~-1℃下压滤以上悬浮液，并后洗沉淀，共收集滤液235kg,加入山梨醇9.4kg，充分搅拌使其溶解；

4,透析脱醇：用10k超滤膜浓缩以上滤液，控制进口压力不高于20PSI，浓缩至约16kg，然后用80kg的透析液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.30-5.40，山梨醇5%，1-2℃）恒体积透析脱去乙醇，然后转移并用约80kg的透析液后洗超滤膜，共收集100.9kg；

5，阴离子交换柱层析：用70-80cm/h的上柱线流速上DEAESepharoseFF柱，预先用平衡缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.30-5.40）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；

6，透析浓缩并调节：浓缩以上流穿液至约16kg，然后用96kg含5%山梨醇的水溶液进行透析，再次浓缩后转移并后洗超滤膜，收集19.2kg，测蛋白浓度6.97%(w/v)，用5%(w/w)山梨醇水溶液调蛋白浓度至5.35%(w/v)，用0.5M稀盐酸调蛋白溶液PH至3.95-4.05；称重25.0kg；

7~9，同实施例一。

表IVIG试制品得率及质量指标一览表

*国内血制品公司的得率一般为1600-1900瓶/吨血浆。

附图说明

图1是静注人免疫球蛋白(PH4)的制备工艺流程图。

Claims (9)

1.一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）组分II+III沉淀的悬浮

按一定的稀释比，将组分II+III沉淀投入到预先配制的溶解缓冲液中均匀搅拌1-3小时，使沉淀充分悬浮分散；

（2）低温抽提

将步骤（1）得到的悬浮液与预先配制的含乙醇的低温抽提液混合，搅拌3-5小时，使目标蛋白充分抽提，得到均匀的悬浮液；

（3）压滤

将步骤（2）得到的悬浮液在-2~0℃下压滤，收集滤液,及时在滤液中加入山梨醇3-5%（w/w），充分搅拌使其溶解；

（4）超滤透析脱醇

用截留分子量10K-30K的超滤膜浓缩步骤（3）得到的滤液，然后用4-6倍体积的透析液1恒体积透析脱去乙醇，得到粗纯的IgG溶液；

（5）阴离子交换柱层析

步骤（4）得到的IgG溶液上阴离子交换柱，控制上样液的线流速不高于100cm/h，柱子预先用平衡缓冲液平衡；上柱过程中，收集流穿液，上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，冲洗液并入流穿液中；

（6）超滤浓缩及调节

用截留分子量10K-30K的超滤膜浓缩步骤（5）得到的流穿液，然后用透析液2恒体积透析4-6倍，然后浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)左右，转移出超滤膜包并用透析液2后洗膜包，再用透析液2调蛋白浓度至5.30-5.50%(w/v)，用0.5M盐酸溶液调蛋白溶液PH至3.95-4.15；

（7）低PH孵化

用0.22微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化21天；

（8）纳米膜除病毒过滤

用20纳米的滤芯过滤步骤（7）孵化结束的蛋白溶液以去除病毒；

（9）除菌过滤并分装。

2.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的稀释比为1：8-12，即一份重量的组分II+III沉淀加入到8-12份的溶解缓冲液中。

3.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的溶解缓冲液为20-40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；溶解缓冲液的PH值为4.00-5.00；溶解缓冲液的温度为0-2℃。

4.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的抽提液，其重量是步骤（1）所得悬浮液总重的0.8-1.2倍。

5.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的抽提液为20-40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；其中乙醇浓度为11-14%(v/v)；抽提液的PH值为5.00-6.00；抽提液的温度为-2~0℃。

6.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的透析液1为10-20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液；透析液1的PH5.20-6.00；透析液1的温度1-5℃；透析液1中含山梨醇3-5%(w/w)。

7.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的阴离子交换柱所用填料为CaptoQ、CaptoDEAE、QSepharoseFF及DEAESepharoseFF中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的平衡缓冲液为10-20mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，平衡缓冲液的PH为5.20-6.00。

9.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述的透析液2为5%(w/w)山梨醇水溶液，透析液2的温度为2-8℃。