CN105092336A

CN105092336A - 一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法

Info

Publication number: CN105092336A
Application number: CN201510539626.4A
Authority: CN
Inventors: 张丽; 张闻; 周海滨; 王建飞
Original assignee: NINGBO RUI BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NINGBO RUI BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明涉及一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，该制备方法包括以下步骤：选取血清去除沉淀和干扰物；向处理后的血清中加入葡萄糖和防腐剂，置于35-38℃的恒温水浴中糖化，依据糖化时间分别制得糖化白蛋白校准品和质控品；然后将制得的糖化白蛋白校准品和质控品分装，置于2-6℃的透析液中，透析去除多余的葡萄糖，直至剩余葡萄糖含量小于0.1g/L为止；最后在透析处理后的糖化白蛋白校准品和质控品中加入防腐剂和10-50g/L冻干保护剂，冷冻干燥，制成冻干粉，再复溶，用糖化白蛋白检测试剂盒检测定值即可。本发明原料来源充足，易获得，制备工艺简单，用健康人血清制备得到了较稳定的糖化白蛋白校准品和质控品。

Description

一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，属于医学检测技术领域。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病时长期存在的高血糖会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，其发病晚期带来的并发症具有致死性，已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，严重威胁着人类健康。

糖化白蛋白是反映过去2-3周平均血糖水平的一项指标。比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白的反映周期要短一些。因此，糖化白蛋白在治疗效果的确认以及临床用药量的调整方面比糖化血红蛋白具有优势。另外，在许多血红蛋白代谢异常的情况下，糖化血红蛋白的结果受到影响不能真实反映患者的血糖水平，而糖化白蛋白的结果则不受影响，如糖尿病肾病透析患者、贫血患者、妊娠期妇女的血糖检测等等，因此糖化白蛋白为血糖监测首选指标。

但是，传统的糖化白蛋白校准品和质控品均采用血清制成，存在被HIV或HPV等污染的风险，血清中共存的葡萄糖还会与白蛋白不断反应生成糖化白蛋白，使糖化白蛋白的浓度产生波动。因此，中国发明专利(公开号：CN103076213A)公开了一种糖化白蛋白质控品的制备方法，该制备方法包括以下制备步骤：1)先在反应液中加入白蛋白，使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克，在15-45℃下糖基化反应1-10天后，离心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反应液成分为：缓冲液：20-200mM，pH7.5-8.5，氯化钠：9g/L，葡萄糖：50-200mM，金属螯合剂：0.1-10mM，防腐剂质量百分含量：0.1-5％，其中上述溶剂为水；2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋，置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖，离心取上清液，其中所述透析液成分为：缓冲液：20-200mM，pH7.5-8.5，氯化钠：9g/L，金属螯合剂：0.1-10mM，防腐剂质量百分含量：0.1-5％，其中上述溶剂为水；3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度，加入赋形剂，然后进行低温预冻、冷冻干燥，制成冻干粉，最后将冻干粉复溶、分装即可使用。该专利采用了重组人白蛋白为原料制成，避免了采用血清为原料制备时存在的缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种采用血清为原料制备稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的制备方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1、选取血清去除沉淀和干扰物；

S2、向步骤S1处理后的血清中加入葡萄糖和防腐剂，放置于35-38℃的恒温水浴中糖化，依据糖化时间分别制得糖化白蛋白校准品和质控品；随着糖化进行，先得到质控低值的质控品，再得到校准品，最后得到质控高值的质控品；

S3、将上述制得的糖化白蛋白校准品和质控品分装置于2-6℃的透析液中，透析去除多余的葡萄糖，直至剩余葡萄糖含量小于0.1g/L为止；

S4、在上述透析处理后的糖化白蛋白校准品和质控品中加入防腐剂和10-50g/L冻干保护剂，冷冻干燥，制成冻干粉，再复溶，用糖化白蛋白检测试剂盒检测定值即可。

本发明以血清为原料，通过上述制备方法制备得到了稳定的糖化白蛋白标准品和质控品。避免了传统的糖化白蛋白校准品和质控品采用血清制成时，存在被HIV或HPV等污染的风险。同时，由于透析至葡萄糖只有小于0.1g/L，所以可以避免进一步生成糖化白蛋白，使糖化白蛋白的浓度产生波动的缺陷。而且，本发明制备工艺简单，不需要加入表面活性剂、赋形剂、酸碱调节剂等，生产成本低，长期稳定性好。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S1中血清的HIV，HCV和HTLV均为阴性。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S1中的干扰物通过透析液透析去除，透析液和步骤S3中的透析液的成分均为：缓冲液：20-100mM，氯化钠：8-10g/L，溶剂为蒸馏水。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，缓冲液的pH为7-8。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S2中葡萄糖的用量为3-8g/L。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S2和步骤S4中防腐剂的用量为0.3-1g/L。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S2和步骤S4中防腐剂均为叠氮钠或proclin系列中的一种。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S3中透析液每10-15小时更换一次。

在上述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法中，步骤S4中冻干保护剂为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮或明胶中的一种。本发明的冻干保护剂原料来源丰富，且价格低廉。尤其是蔗糖，显著降低了冻干过程中的损失率，提高了糖化白蛋的校准品和质控品的稳定性。

与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：

1.本发明用健康人血清制备得到了较稳定的糖化白蛋白校准品和质控品。

2.本发明通过加入蔗糖这种廉价的化学试剂，显著降低了冻干过程中的损失率，提高了糖化白蛋的校准品和质控品的稳定性。

3.本发明原料来源充足，易获得，成本低，长期稳定性好。

4.本发明制备工艺简单，不需要加入表面活性剂、赋形剂、酸碱调节剂等。

附图说明

图1为剩余葡萄糖含量随透析时间的变化曲线；

图2为加入不同的蔗糖的量对糖化白蛋白值的影响；

图3为糖化白蛋白标准品和质控品放置于4℃时的长期稳定性。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

首先，采用健康人血清，测其HIV，HCV和HTLV均为阴性。然后在18000rpm*30min离心去除沉淀，再用透析液透析去除一些小分子的干扰物；其中，透析液的成分为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)：50mM，氯化钠：9g/L，溶剂：蒸馏水。

其次，向透析好的血清中加入5g/L的葡萄糖和0.5g/L的叠氮钠，放置于37℃的恒温水浴箱中1天得到质控低值的质控品，2天得到校准品，4天得到质控高值的质控品。

再次，将制得的校准品和质控品分别装入透析袋中，置于4℃的透析液中，每12小时换一次透析液，透析去除多余的葡萄糖，防止进一步的糖化，直至用葡萄糖检测试剂盒测出的剩余葡萄糖含量小于0.1g/L为止。其中，透析液的成分为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)：50mM，氯化钠：9g/L，溶剂：蒸馏水。

最后，将透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品分别加入10g/L蔗糖和0.5g/L的叠氮钠，然后分装，冷冻干燥，制成冻干粉。用蒸馏水复溶，用糖化白蛋白检测试剂盒检测定值即可。

实施例2：

首先，采用健康人血清，测其HIV，HCV和HTLV均为阴性。然后在18000rpm*30min离心去除沉淀，再用透析液透析去除一些小分子的干扰物，其中，透析液的成分为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)：50mM，氯化钠：9g/L，溶剂：蒸馏水。

再次，将制得的校准品和质控品分别装入透析袋中，置于4℃的透析液中，每12小时换一次透析液，透析去除多余的葡萄糖，防止放置进一步的糖化，直至用葡萄糖检测试剂盒测出的剩余葡萄糖含量小于0.1g/L为止。其中，透析液的成分为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)：50mM，氯化钠：9g/L，溶剂：蒸馏水。

最后，将透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品分别加入0.5g/L明胶和0.5g/L的叠氮钠，然后分装，冷冻干燥，制成冻干粉。用蒸馏水复溶，用糖化白蛋白检测试剂盒检测定值即可。

实施例3：

最后，将透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品分别加入10g/L聚乙烯吡咯烷酮和0.5g/L的叠氮钠，然后分装，冷冻干燥，制成冻干粉。用蒸馏水复溶，用糖化白蛋白检测试剂盒检测定值即可。

实施例4与实施例1的区别仅在于，实施例4中透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品中添加15g/L蔗糖冻干保护剂。

实施例5与实施例1的区别仅在于，实施例4中透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品中添加20g/L蔗糖冻干保护剂。

对比例1与实施例1的区别仅在于，对比例1中透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品中没有添加冻干保护剂。

对比例2与实施例1的区别仅在于，对比例2中透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品中添加5g/L蔗糖冻干保护剂。

对比例3与实施例1的区别仅在于，对比例3中透析处理好的糖化白蛋白校准品和质控品中添加8g/L蔗糖冻干保护剂。

表1为本发明实施例1放置于37℃的恒温水浴箱中不同的时间得到的糖化白蛋白的值、透析去除多余的葡萄糖之后的糖化白蛋白的值和冻干并且复溶之后用糖化白蛋白试剂盒测试糖化白蛋白含量的比对结果。

表1：糖化白蛋白值在水浴、透析和冻干前后的对比结果

从表1中可以看出，在37℃的恒温水浴箱中1天可得质控低值，2天可得校准品，4天便可得质控高值。而且经过几天的透析去除多余的糖分之后并没有对糖化白蛋白的值引起较大的变化，冻干过程中的损失也最高只有8.2％。

表2为对比例1未加入冻干保护剂和实施例1-3冻干加入不同冻干保护剂对糖化白蛋白值的影响。

表2：冻干保护剂对糖化白蛋白值的影响

糖化白蛋白(umol/L)	-	蔗糖	聚乙烯吡咯烷酮	明胶
					透析后	484.2	484.2	484.2	484.2
冻干后	338.9	460.0	441.1	410.1
					冻干损失率/％	30.1	5.0	8.9	15.3

从表2中可知，加入冻干保护剂和未加冻干保护剂对糖化白蛋白的值有较大的影响；加入冻干保护剂后能有效保护糖化白蛋白在冻干过程中的损失率。同时，加入不同的冻干保护剂对糖化白蛋白的值也有较大的影响；加入的冻干保护剂为蔗糖时，能最好的保护糖化白蛋白在冻干过程中有最小的损失。

图1是实施例1中透析时间对校准品中剩余葡萄糖含量的影响。从图1中可知，透析的第一个12h中去除的葡萄糖含量最多，当透析的时间超过3天后，葡萄糖含量维持0.1g/L不变。因此，透析3天就可得到葡萄糖含量满足要求的校准品或质控品。

图2为本发明实施例1、实施例4、实施例5和对比例1-3加入不同的蔗糖的量对糖化白蛋白值的影响。从图2可知，加入大于1％蔗糖后，才能起到保护糖化白蛋白的作用。

图3为糖化白蛋白校准品和质控品放置于4℃时的长期稳定性。从图3可知，糖化白蛋白的校准品和质控品值在12个月内，稳定性较好，偏差也均在范围内，因此，用健康人血清可以制备较稳定的糖化白蛋白校准品和质控品。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，冻干保护剂蔗糖的添加量还可以为11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、28g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、40g/L、42g/L、45g/L、46g/L、48g/L、50g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，冻干保护剂明胶的添加量还可以为11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、28g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、40g/L、42g/L、45g/L、46g/L、48g/L、50g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，冻干保护剂聚乙烯吡咯烷酮的添加量还可以为11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、28g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、40g/L、42g/L、45g/L、46g/L、48g/L、50g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析液中的缓冲液还可以为哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析液中的缓冲液的浓度还可以为20mM、30mM、40mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析液中的缓冲液的pH还可以为7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.6、7.7、7.8、7.9、8。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析液中的氯化钠的用量还可以为8g/L、8.2g/L、8.5g/L、8.6g/L、8.8g/L、9.1g/L、9.3g/L、9.5g/L、9.6g/L、10g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，向透析好的血清中加入的葡萄糖的用量还可以为3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、4.8g/L、5.2g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，防腐剂还可以为proclin系列。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，防腐剂的用量还可以为0.3g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，恒温水浴箱的温度还可以为35℃、36℃、38℃。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析袋放置于透析液中，透析液的温度还可以为2℃、3℃、5℃、6℃。

在上述稳定的糖化白蛋白标准品和质控品的实施方案及其替换方案中，透析液更换的间隔时间还可以为10小时更换一次、10.5小时更换一次、11小时更换一次、11.5小时更换一次、12.5小时更换一次、13小时更换一次、13.5小时更换一次、14小时更换一次、14.5小时更换一次、15小时更换一次。

鉴于本发明实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-5作为代表说明本发明申请优异之处。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处，同样都在本发明要求保护的范围内。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、选取血清去除沉淀和干扰物；

S2、向步骤S1处理后的血清中加入葡萄糖和防腐剂，放置于35-38℃的恒温水浴中糖化，依据糖化时间分别制得糖化白蛋白校准品和质控品；

S3、将上述制得的糖化白蛋白校准品和质控品分装，置于2-6℃的透析液中，透析去除多余的葡萄糖，直至剩余葡萄糖含量小于0.1g/L为止；

2.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述血清的HIV，HCV和HTLV均为阴性。

3.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S1中的干扰物通过透析液透析去除，所述透析液和步骤S3中所述的透析液的成分均为：缓冲液：20-100mM，氯化钠：8-10g/L，溶剂为蒸馏水。

4.根据权利要求3所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为7-8。

5.根据权利要求3所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述葡萄糖的用量为3-8g/L。

7.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S2和步骤S4中所述防腐剂的用量为0.3-1g/L。

8.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S2和步骤S4中所述防腐剂均为叠氮钠或proclin系列中的一种。

9.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述透析液每10-15小时更换一次。

10.根据权利要求1所述的一种稳定的糖化白蛋白校准品和质控品的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述冻干保护剂为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮或明胶中的一种。