CN103076213A - 糖化白蛋白质控品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖化白蛋白质控品的制备方法,它包括以下制备步骤:1)将白蛋白糖基化;2)透析除去白蛋白溶液中葡萄糖防止白蛋白进一步糖基化;3)稀释至所需质控品浓度,冷冻干燥,最后将冻干粉复溶、分装。按本发明制作出来的糖化白蛋白质控品具有具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,具体讲是一种糖化白蛋白质控品的制备方法。
背景技术
糖尿病是危及人类健康的重大疾病之一,其发病晚期带来的并发症(如肾病、神经系统疾病和心血管疾病等)具有致死性,已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病,被医学界称为"沉默的杀手",严重威胁着人类健康;传统糖化白蛋白质控品都是用血清制成,可能带来HIV或者HPV等污染,另外,由于血清中葡萄糖与白蛋白的并存,在放置的过程中会不断的生成糖化白蛋白,从而也造成样本不稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上现有技术的缺点:提供一种无污染、稳定性好的糖化白蛋白质控品的制备方法。
本发明的技术解决方案如下:
一种糖化白蛋白质控品的制备方法,它包括以下制备步骤:
1)先在反应液中加入白蛋白,使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克,在15-45℃下糖基化反应1-10天后,离心除去沉淀,留取上清夜,其中所述反应液成分为:
缓冲液:20-200mM,pH 7.5-8.5
氯化钠:9g/L
葡萄糖:50-200mM
金属螯合剂:0.1-10mM
防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水;
2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋,置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖,离心取上清液,其中所述透析液成分为:
缓冲液:20-200mM,pH 7.5-8.5
氯化钠:9g/L
金属螯合剂:0.1-10mM
防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水;
3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度,加入赋形剂,然后进行低温预冻、冷冻干燥,制成冻干粉,最后将冻干粉复溶、分装即可使用;其中所述白蛋白稀释液中的白蛋白浓度等于步骤1)中糖基化反应前溶液中白蛋白浓度,且成分区别在于白蛋白稀释液中不含葡萄糖。
所述白蛋白为重组人白蛋白。
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’s缓冲液中的一种。
所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一种。
所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300中的一种。
所述赋形剂由冻干保护剂,填充剂,酸碱调整剂组成,其中各组分以它们加入溶液后的含量计为:冻干保护剂质量百分含量0.5-10%,填充剂质量百分含量0.5-15%,酸碱调整剂摩尔浓度0.05-20mM。
所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种;所述填充剂为甘露醇、山梨醇、PEG4000、明胶中的一种;所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种。
所述低温预冻为在-50℃至-90℃的条件下,预冻3小时以上将溶液冷冻成型。
所述冷冻干燥的条件为第一次干燥阶段的升温速度采用3-10℃每小时,持续20-35小时,第二次干燥阶段的升温速度采用20-25℃每小时,持续5-10h。
本发明的有益效果是:按本发明制备的糖化白蛋白质控品,具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明,但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例一
糖化白蛋白质控品(250μmol/L)的制备:
1)称取重组人白蛋白1g,溶于20mL反应液中,37℃反应7天后,18000rpm×30min离心去除沉淀,其中反应液成分如下:
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液:50mM,pH 8.0
葡萄糖:100mM
氯化钠:9g/L
EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:1%
其中上述溶剂为水;
2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋,置于4℃透析液中透析,其中所述透析液成分为:
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液:50mM,pH 8.0
氯化钠:9g/L
EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:1%
其中上述溶剂为水;
透析时间为48h,中间更换透析液4次,采用葡萄糖试剂测定葡萄糖含量,检测不到葡萄糖含量时,透析结束,离心取上清液,用HPLC测定糖化白蛋白的含量,浓度为8000μmol/L,50g/L白蛋白溶液稀释32倍得到250μmol/L的质控品,并用HPLC准确定值。
3)往步骤2)中稀释好的质控品中加入海藻糖:1%,甘露醇:3%、聚维酮1%、甘氨酸:0.5mM,于-65℃低温预冻5h,再放入冷冻干燥机中冷冻干燥,第一次冷冻干燥采用升温速度5℃/h,持续28h,第二次冷冻干燥采用25℃/h,持续10h后制得冻干粉。
4)将步骤3)中所制冻干粉用水复溶后分装,置于2℃环境中冷藏,每月测定一次糖化白蛋白含量,每次重复3次,取平均值,数据如下:
HbA1c%理论值 | 250μmol/L |
1月 | 249 |
2月 | 248 |
3月 | 249 |
4月 | 248 |
5月 | 248 |
6月 | 248 |
7月 | 249 |
8月 | 247 |
9月 | 247 |
10月 | 248 |
11月 | 248 |
12月 | 248 |
平均值 | 248 |
CV% | 0.25% |
由上表可以看出,按照本发明的制备方法制得的糖化白蛋白质控品具有良好的稳定性。
实施例二
糖化白蛋白质控品(700μmol/L)的制备:
1)称取重组人白蛋白1.2g,溶于20mL反应液中,37℃反应5天后,18000rpm×30min离心去除沉淀,其中反应液成分如下:
磷酸钠缓冲液:50mM,pH 8.0
葡萄糖:100mM
氯化钠:9g/L
EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:0.5%
其中上述溶剂为水;
2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋,置于4℃透析液中透析,其中所述透析液成分为:
磷酸钠缓冲液:50mM,pH 8.0
氯化钠:9g/L
EDTA:2mM
叠氮钠的质量百分含量:0.5%
其中上述溶剂为水;
透析时间为24h,中间更换透析液4次,采用葡萄糖试剂测定葡萄糖含量,检测不到葡萄糖含量时,透析结束,离心取上清液,用HPLC测定糖化白蛋白的含量,浓度为7500μmol/L,60g/L白蛋白溶液稀释10.7倍得到700μmol/L的质控品,并用HPLC准确定值。
3)往步骤2)中稀释好的质控品中加入海藻糖:2%,甘露醇:3%、聚维酮1%、甘氨酸:0.5mM,于-60℃低温预冻5h,再放入冷冻干燥机中冷冻干燥,第一次冷冻干燥采用升温速度5℃/h,持续28h,第二次冷冻干燥采用25℃/h,持续5h后制得冻干粉。
4)将步骤3)中所制冻干粉用水复溶后分装,置于2℃环境中冷藏,每月测定一次糖化白蛋白含量,每次重复3次,取平均值,数据如下:
HbA1c%理论值 | 700μmol/L |
1月 | 702 |
2月 | 702 |
3月 | 701 |
4月 | 701 |
5月 | 702 |
6月 | 700 |
7月 | 700 |
8月 | 699 |
9月 | 700 |
10月 | 697 |
11月 | 700 |
12月 | 699 |
平均值 | 700 |
CV% | 0.2% |
由上表可以看出,按照本发明的制备方法制得的糖化白蛋白质控品具有良好的稳定性。
Claims (7)
1.一种糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:它包括以下制备步骤:
1)先在反应液中加入白蛋白,使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克,在15-45℃下糖基化反应1-10天后,离心除去沉淀,留取上清夜,其中所述反应液成分为:
缓冲液:20-200mM,pH 7.5-8.5
氯化钠:9g/L
葡萄糖:50-200mM
金属螯合剂:0.1-10mM
防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水;
2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋,置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖,离心取上清液,其中所述透析液成分为:
缓冲液:20-200mM,pH 7.5-8.5
氯化钠:9g/L
金属螯合剂:0.1-10mM
防腐剂质量百分含量:0.1-5%
其中上述溶剂为水;
3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度,加入赋形剂,然后进行低温预冻、冷冻干燥,制成冻干粉,最后将冻干粉复溶、分装即可使用。
2.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述白蛋白为重组人白蛋白。
3.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’s缓冲液中的一种。
4.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一种。
5.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300中的一种。
6.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述赋形剂由冻干保护剂,填充剂,酸碱调整剂组成,其中各组分以它们加入溶液后的含量计为:冻干保护剂质量百分含量0.5-10%,填充剂质量百分含量0.5-15%,酸碱调整剂摩尔浓度0.05-20mM。
7.根据权利要求6所述的糖化白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种;所述填充剂为甘露醇、山梨醇、PEG4000、明胶中的一种;所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种。
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