CN103076213B - 糖化白蛋白质控品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种糖化白蛋白质控品的制备方法，它包括以下制备步骤：1）将白蛋白糖基化；2）透析除去白蛋白溶液中葡萄糖防止白蛋白进一步糖基化；3）稀释至所需质控品浓度，冷冻干燥，最后将冻干粉复溶、分装；按本发明制作出来的糖化白蛋白质控品具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。

Description

糖化白蛋白质控品的制备方法
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体讲是一种糖化白蛋白质控品的制备方法。
背景技术
糖尿病是危及人类健康的重大疾病之一，其发病晚期带来的并发症（如肾病、神经系统疾病和心血管疾病等）具有致死性，已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，被医学界称为"沉默的杀手"，严重威胁着人类健康；传统糖化白蛋白质控品都是用血清制成，可能带来HIV或者HPV等污染，另外，由于血清中葡萄糖与白蛋白的并存，在放置的过程中会不断的生成糖化白蛋白，从而也造成样本不稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种无污染、稳定性好的糖化白蛋白质控品的制备方法。
本发明的技术解决方案如下：
一种糖化白蛋白质控品的制备方法，它包括以下制备步骤：
1）先在反应液中加入白蛋白，使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克，在15-45℃下糖基化反应1-10天后，离心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反应液成分为：
缓冲液：20-200mM，pH 7.5-8.5
氯化钠：9g/L
葡萄糖：50-200mM
金属螯合剂：0.1-10mM
防腐剂质量百分含量：0.1-5%
其中上述溶剂为水；
2）将步骤1）中制备的上清液装入透析袋，置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖，离心取上清液，其中所述透析液成分为：
缓冲液：20-200mM，pH 7.5-8.5
氯化钠：9g/L
金属螯合剂：0.1-10mM
防腐剂质量百分含量：0.1-5%
其中上述溶剂为水；
3）将步骤2）中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度，加入赋形剂，然后进行低温预冻、冷冻干燥，制成冻干粉，最后将冻干粉复溶、分装即可使用；其中所述白蛋白稀释液中的白蛋白浓度等于步骤1）中糖基化反应前溶液中白蛋白浓度，且成分区别在于白蛋白稀释液中不含葡萄糖。
所述白蛋白为重组人白蛋白。
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’s缓冲液中的一种。
所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）中的一种。
所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300中的一种。
所述赋形剂由冻干保护剂，填充剂，酸碱调整剂组成，其中各组分以它们加入溶液后的含量计为：冻干保护剂质量百分含量0.5-10%，填充剂质量百分含量0.5-15%，酸碱调整剂摩尔浓度0.05-20mM。
所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中的一种；所述填充剂为甘露醇、山梨醇、PEG4000、明胶中的一种；所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种。
所述低温预冻为在-50℃至-90℃的条件下，预冻3小时以上将溶液冷冻成型。
所述冷冻干燥的条件为第一次干燥阶段的升温速度采用3-10℃每小时，持续20-35小时，第二次干燥阶段的升温速度采用20-25℃每小时，持续5-10h。
本发明的有益效果是：按本发明制备的糖化白蛋白质控品，具有无污染、稳定性好、成本低、安全、利于大批量生产的优点。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例一
糖化白蛋白质控品（250μmol/L）的制备：
1）称取重组人白蛋白1g，溶于20mL反应液中，37℃反应7天后，18000rpm×30min离心去除沉淀，其中反应液成分如下：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液：50mM，pH 8.0
葡萄糖：100mM
氯化钠：9g/L
EDTA：2mM
叠氮钠的质量百分含量：1%
其中上述溶剂为水；
2）将步骤1）中制备的上清液装入透析袋，置于4℃透析液中透析，其中所述透析液成分为：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液：50mM，pH 8.0
氯化钠：9g/L
EDTA：2mM
叠氮钠的质量百分含量：1%
其中上述溶剂为水；
透析时间为48h，中间更换透析液4次，采用葡萄糖试剂测定葡萄糖含量，检测不到葡萄糖含量时，透析结束，离心取上清液，用HPLC测定糖化白蛋白的含量，浓度为8000μmol/L，50g/L白蛋白溶液稀释32倍得到250μmol/L的质控品，并用HPLC准确定值。
3）往步骤2)中稀释好的质控品中加入海藻糖：1%，甘露醇：3%、聚维酮1%、甘氨酸：0.5mM，于-65℃低温预冻5h，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥，第一次冷冻干燥采用升温速度5℃/h，持续28h，第二次冷冻干燥采用25℃/h，持续10h后制得冻干粉。 
4）将步骤3）中所制冻干粉用水复溶后分装，置于2℃环境中冷藏，每月测定一次糖化白蛋白含量，每次重复3次，取平均值，数据如下：
HbA1c%理论值 250μmol/L
1月 249
2月 248
3月 249
4月 248
5月 248
6月 248
7月 249
8月 247
9月 247
10月 248
11月 248
12月 248
平均值 248
CV% 0.25%
由上表可以看出，按照本发明的制备方法制得的糖化白蛋白质控品具有良好的稳定性。
实施例二
糖化白蛋白质控品（700μmol/L）的制备：
1）称取重组人白蛋白1.2g，溶于20mL反应液中，37℃反应5天后，18000rpm×30min离心去除沉淀，其中反应液成分如下：
磷酸钠缓冲液：50mM，pH 8.0
葡萄糖：100mM
氯化钠：9g/L
EDTA：2mM
叠氮钠的质量百分含量：0.5%
其中上述溶剂为水；
2）将步骤1）中制备的上清液装入透析袋，置于4℃透析液中透析，其中所述透析液成分为：
磷酸钠缓冲液：50mM，pH 8.0
氯化钠：9g/L
EDTA：2mM
叠氮钠的质量百分含量：0.5%
其中上述溶剂为水；
透析时间为24h，中间更换透析液4次，采用葡萄糖试剂测定葡萄糖含量，检测不到葡萄糖含量时，透析结束，离心取上清液，用HPLC测定糖化白蛋白的含量，浓度为7500μmol/L，60g/L白蛋白溶液稀释10.7倍得到700μmol/L的质控品，并用HPLC准确定值。
3）往步骤2)中稀释好的质控品中加入海藻糖：2%，甘露醇：3%、聚维酮1%、甘氨酸：0.5mM，于-60℃低温预冻5h，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥，第一次冷冻干燥采用升温速度5℃/h，持续28h，第二次冷冻干燥采用25℃/h，持续5h后制得冻干粉。 
4）将步骤3）中所制冻干粉用水复溶后分装，置于2℃环境中冷藏，每月测定一次糖化白蛋白含量，每次重复3次，取平均值，数据如下：
HbA1c%理论值 700μmol/L
1月 702
2月 702
3月 701
4月 701
5月 702
6月 700
7月 700
8月 699
9月 700
10月 697
11月 700
12月 699
平均值 700
CV% 0.2%
由上表可以看出，按照本发明的制备方法制得的糖化白蛋白质控品具有良好的稳定性。

Claims (4)

1.一种糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于：它包括以下制备步骤： 
1)先在反应液中加入白蛋白，使每分升反应液中白蛋白含量为1-10克，在15-45℃下糖基化反应1-10天后，离心除去沉淀，留取上清液，其中所述反应液成分为： 
缓冲液：20-200mM，pH7.5-8.5 
氯化钠：9g/L 
葡萄糖：50-200mM 
金属螯合剂：0.1-10mM 
防腐剂质量百分含量：0.1-5％ 
其中上述溶液的溶剂为水； 
2)将步骤1)中制备的上清液装入透析袋，置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖，离心取上清液，其中所述透析液成分为： 
缓冲液：20-200mM，pH7.5-8.5 
氯化钠：9g/L 
金属螯合剂：0.1-10mM 
防腐剂质量百分含量：0.1-5％ 
其中上述溶液的溶剂为水； 
3)将步骤2)中制备的上清液用白蛋白稀释液稀释至所需质控品浓度，用HPLC测定糖化白蛋白的含量，并用HPLC准确定值；加入赋形剂，然后于-60℃低温预冻，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥，第一次冷冻干燥采用升温速度5℃/h，第二次冷冻干燥采用25℃/h制得冻干粉； 
再将冻干粉用水复溶后分装，置于2℃环境中冷藏； 
所述赋形剂由冻干保护剂，填充剂，酸碱调整剂组成，其中各组分以它们加入溶液后的含量计为：冻干保护剂质量百分含量0.5-10％，填充剂质量百分含量0.5-15％，酸碱调整剂摩尔浓度0.05-20mM； 
所述冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种；所述填充剂为甘露醇、山梨醇、PEG4000、明胶中的一种；所述酸碱调整剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸钠中的一种； 
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、Good’s缓冲液中的一种。 
2.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于：所述白蛋白为重组人白蛋白。 
3.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于：所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一种。 
4.根据权利要求1所述的糖化白蛋白质控品的制备方法，其特征在于：所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮钠、山梨酸钾、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、proclin300中的一种。 
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