CN103575921B - 同型半胱氨酸质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同型半胱氨酸质控品，其高浓度品和低浓度品分别包括以下浓度的各组分：20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5%防腐剂、0.1-30%糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。该质控品的制备方法为：同型半胱氨酸高值制备；将高值分别稀释到高浓度品和低浓度品所需的浓度；稳定化处理。该同型半胱氨酸质控品成分稳定，Hcy的存在状态与人血清中同，稳定性好，准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸质控品，以及该同型半胱氨酸质控品的制备方法。
背景技术
同型半胱氨酸（Hcy）即2-氨酸-4-巯基丁酸，也称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，参与甲硫氨酸的代谢过程，可被甲基化生成蛋氨酸，或被转硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，并可释放到血液中。目前研究认为，Hcy是独立的心脑血管疾病最新监测指标，其水平升高与心、脑血管及周围血管动脉粥样硬化病变有关，并与老年痴呆、肾功能衰竭、流产及糖尿病早亡有关，所以Hcy的体外检测具有重要的临床价值，可用于预测脑血管疾病发生的危险性。
Hcy测定是指测定血清或者血浆中总的同型半胱氨酸（tHcy）的含量。在血清或者血浆中，游离的或者说处于还原态的Hcy含量很低，仅占tHcy总量的2%左右，其他的均为结合的或者处于氧化态的Hcy。其结合方式包括：自身氧化：Hcy-S-S-Hcy（5-10%）；与半胱氨酸（Cys）氧化：Hcy-S-S-Cys（5-10%）；与白蛋白（Alb）中的半胱氨酸结合氧化：Hcy-S-S-Alb(70-90%)。
目前检测血浆中Hcy主要采用酶循环法，该法可以在自动生化分析仪上进行，测定灵敏度高，广泛应用于临床检验。酶循环法测定Hcy中，加入一定浓度的还原剂TCEP将氧化态的Hcy转化为还原态的Hcy，从而保证结果的准确性。
Hcy的测定需要一个准确、稳定的质控品来监控仪器状态及试剂的好坏。由于血清的不易获得性、成分的复杂性、可能带有HIV等病毒，导致无法采用血清作为基质制备Hcy质控品。而市场上常见的Hcy质控品多为水剂，与Hcy在血清中的存在状态有很大的区别，且存在稳定性差的问题：4℃放置1个月即有明显的下降，放置一年值降为原来的一半，给临床检验带来很大的困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种同型半胱氨酸质控品，该同型半胱氨酸质控品成分稳定，Hcy的存在状态与人血清中同，稳定性好，准确度高、抗干扰能力强，使用安全。
一种同型半胱氨酸质控品，包括高浓度品和低浓度品，所述高浓度品包括以下浓度的各组分：20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5%（g/100mL）防腐剂、0.1-30%（g/100mL）糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%；所述低浓度品包括以下浓度的各组分：20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5%（g/100mL）防腐剂、0.1-30%（g/100mL）糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。
作为优选，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或GOOD’s缓冲液中的一种，进一步优选为磷酸盐缓冲液。
作为优选，所述金属螯合剂为EDTA、DTPA、EGTA、NTA中的一种。
作为优选，所述防腐剂为Proclin系列防腐剂、NaN3、G418、叠氮锂中的一种。
作为优选，所述糖类为海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡聚糖、葡萄糖、乳糖中的一种，进一步优选为海藻糖。
作为优选，所述多元醇为甘油、PEG4000、乙二醇中的一种，进一步优选为甘油。
所述高浓度品和低浓度品中的缓冲液、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的种类相同。
本发明上述同型半胱氨酸质控品的制备方法，具有以下操作步骤：
（1）高值制备：在20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液中加入5-10mML-半胱氨酸、30-50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向反应液中加入0.001-0.1g/L同型半胱氨酸，于25℃-37℃下进行氧化反应1-10天，反应结束后18000rpm×30min离心取上清液；
（2）高值稀释：采用步骤（1）中的缓冲液稀释上清液到高浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用步骤（1）中的缓冲液稀释上清液到低浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
（3）稳定化处理：在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.1-10mM、防腐剂0.1-5%（g/100mL）、糖类或多元醇0.1-30%（g/100mL），在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.1-10mM、防腐剂0.1-5%（g/100mL）、糖类或多元醇0.1-30%（g/100mL），并用HPLC定值，得到高浓度品和低浓度品。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：本发明采用重组人白蛋白及L-半胱氨酸，与同型半胱氨酸发生氧化反应，使最终反应体系中还原态Hcy占总的同型半胱氨酸（tHcy）的1-3%，Hcy-S-S-Hcy占5-10%、Hcy-S-S-Cys占5-10%、Hcy-S-S-Alb占70-90%；然后氯化钠、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的加入，使得制备成的液体质控品基质类似人血清，尽量模拟Hcy在血清中的存在状态，不仅质控品制剂的稳定性好，不易降解，保存时间长，而且由于质控品模拟人血清制备而成，同检测样品基质类似，所以检测准确度高，有效保证了临床检验需求。该质控品由于采用制备方法制成而成，加入的物质种类和含量可控，所以该质控品成分稳定，不存在在人血清中存在的有可能干扰检测结果的物质，抗干扰能力强，也不存在在人血清中存在的有可能导致不安全情况的物质（如HIV），安全非常安全，可放心使用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：
本实施例同型半胱氨酸质控品（10μM、35μM），包括高浓度品和低浓度品，其中：高浓度品包括以下浓度的各组分：50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液、9g/L氯化钠、5mMEDTA、1%Proclin300、15%海藻糖、35μM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%；
低浓度品包括以下浓度的各组分：50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液、9g/L氯化钠、5mMEDTA、1%Proclin300、15%海藻糖、10μM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。
该同型半胱氨酸质控品的制备方法，具有以下操作步骤：
（1）高值制备：在50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液中加入1.2g/LL-半胱氨酸、50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向100ml反应液中加入0.0015g同型半胱氨酸，于37℃下进行氧化反应3天，反应结束后18000rpm×30min离心取上清液；
（2）高值稀释：采用50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为35μM，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为10μM，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
（3）稳定化处理：在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、5mMEDTA、1%Proclin300、15%海藻糖，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、5mMEDTA、1%Proclin300、15%海藻糖，并用HPLC定值，得到本实施例同型半胱氨酸质控品（10μM、35μM）。
将上述同型半胱氨酸质控品（10μM、35μM）按照每个1mL分装，每月测定一次，每次重复3次，取平均值，数据如下：
| Hcy理论值 | 10（μM） | 35（μM） |
| 1月 | 9.98 | 35.12 |
| 2月 | 9.56 | 34.88 |
| 3月 | 10.03 | 35.33 |
| 4月 | 9.88 | 34.88 |
| 5月 | 10.20 | 34.96 |
| 6月 | 10.25 | 34.86 |
| 7月 | 9.93 | 35.05 |
| 8月 | 10.01 | 35.21 |
| 9月 | 10.00 | 36.10 |
| 10月 | 9.92 | 34.80 |
| 11月 | 9.89 | 35.55 |
| 12月 | 10.15 | 34.72 |
| 平均值 | 9.98 | 35.12 |
| CV% | 1.8% | 1.1% |
由上表可以看出，本实施例制备的同型半胱氨酸质控品（10μM、35μM）稳定性好。
实施例2：
本实施例同型半胱氨酸质控品（7.5μM、40μM），包括高浓度品和低浓度品，其中：高浓度品包括以下浓度的各组分：200mMpH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、9g/L氯化钠、3mMDTPA、0.5%NaN3、15%甘油、40μM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%；
低浓度品包括以下浓度的各组分：50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液、9g/L氯化钠、3mMDTPA、0.5%NaN3、15%甘油、7.5μM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。
该同型半胱氨酸质控品的制备方法，具有以下操作步骤：
（1）高值制备：在200mMpH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中加入0.8g/LL-半胱氨酸、45g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向100ml反应液中加入0.003g同型半胱氨酸，于25℃下进行氧化反应5天，反应结束后18000rpm×30min离心取上清液；
（2）高值稀释：采用200mMpH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为40μM，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用200mMpH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为7.5μM，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
（3）稳定化处理：在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、3mMDTPA、0.5%NaN3、15%甘油，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、3mMDTPA、0.5%NaN3、15%甘油，并用HPLC定值，得到本实施例同型半胱氨酸质控品（7.5μM、40μM）。
将上述同型半胱氨酸质控品（7.5μM、40μM）按照每个1mL分装，每月测定一次，每次重复3次，取平均值，数据如下：
由上表可以看出，本实施例制备的同型半胱氨酸质控品（7.5μM、40μM）稳定性好。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为普通市售分析纯试剂。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (10)
1.一种同型半胱氨酸质控品，包括高浓度品和低浓度品，其特征在于：所述高浓度品包括以下浓度的各组分：20-200mM pH 7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5％防腐剂、0.1-30％糖类或多元醇、35-40μM同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy 1-3％，Hcy-S-S-Hcy 5-10％、Hcy-S-S-Cys 5-10％、Hcy-S-S-Alb 70-90％；所述低浓度品包括以下浓度的各组分：20-200mM pH 7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5％防腐剂、0.1-30％糖类或多元醇、7.5-10μM同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为：还原态Hcy 1-3％，Hcy-S-S-Hcy 5-10％、Hcy-S-S-Cys 5-10％、Hcy-S-S-Alb 70-90％。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或GOOD’s缓冲液中的一种。
3.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述金属螯合剂为EDTA、DTPA、EGTA、NTA中的一种。
5.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述防腐剂为Proclin系列防腐剂、NaN3、G418、叠氮锂中的一种。
6.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述糖类为海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡聚糖、葡萄糖、乳糖中的一种。
7.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述多元醇为甘油、PEG4000、乙二醇中的一种。
8.根据权利要求7所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述多元醇为甘油。
9.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于：所述高浓度品和低浓度品中的缓冲液、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的种类相同。
10.权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品的制备方法，其特征在于：具有以下操作步骤：
(1)高值制备：在20-200mM pH 7.0-7.5的缓冲液中加入5-10mM L-半胱氨酸、30-50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向反应液中加入0.001-0.1g/L同型半胱氨酸，于25℃-37℃下进行氧化反应1-10天，反应结束后离心取上清液；
(2)高值稀释：采用步骤(1)中的缓冲液稀释上清液到高浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用步骤(1)中的缓冲液稀释上清液到低浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
(3)稳定化处理：在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.1-10mM、防腐剂0.1-5％、糖类或多元醇0.1-30％，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.1-10mM、防腐剂0.1-5％、糖类或多元醇0.1-30％，并用HPLC定值，得到高浓度品和低浓度品。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zou Bingde Inventor after: Jia Jianghua Inventor after: Zou Jihua Inventor before: Zou Bingde Inventor before: Jia Jianghua Inventor before: Zou Jihua Inventor before: Zhou Haibin |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZOU BINGDE JIA JIANGHUA ZOU JIHUA ZHOU HAIBIN TO: ZOU BINGDE JIA JIANGHUA ZOU JIHUA |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Patentee after: Meikang biological Polytron Technologies Inc Address before: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Patentee before: Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd. |