CN112129847A

CN112129847A - 一种d-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的检测方法

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Publication number: CN112129847A
Application number: CN202010840976.5A
Authority: CN
Inventors: 谢建中; 张芦苇; 杨喜歌; 王利英; 张丽娟; 刘超; 师红亮
Original assignee: Henan Newland Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Henan Newland Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2020-12-25

Abstract

本发明公开了一种D‑对羟基苯甘氨酸甲酯含量的检测方法，该方法采用HPLC测量D‑对羟基苯甘氨酸甲酯含量。D‑对羟基苯甘氨酸甲酯用配置好的D‑对羟基苯甘氨酸甲酯稀释液溶解、定容，在一定的柱温下经过碳十八色谱柱以不同的流速洗脱，紫外检测器检测，根据得到的图谱计算D‑对羟基苯甘氨酸甲酯的含量。为了证明该分析方法具有灵敏度高、重现性好、耗时短、结果准确度高等特点，在实验中将其和高氯酸滴定法相比较，实验结果证明采用本实验方法可以快速、准确的测出D‑对羟基苯甘氨酸甲酯的含量，此发明方法对目前市场上测定D‑对羟基苯甘氨酸甲酯含量起到了至关重要的作用。

Description

一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的检测方法

技术领域

本发明属于医药化工制药检测领域，特别涉及一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸甲酯(MethylD-(-)-4-hydroxy-phenylglycinate),分子式为C₉H₁₁NO₃，分子量为181.19,其为白色或类白色结晶性粉末，在水中溶解性差。D-对羟基苯甘氨酸甲酯是一种重要的医药中间体，在国内外都得到广泛的应用，可用于羟氨苄青霉素、羟氨唑头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物的制备,也可用于肽类激素及农药的合成，此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。随着国民经济条件的不断提高，市场上对D-对羟基苯甘氨酸甲酯的质量要求也越来越高，目前市场上有几种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的检测方法，例如高氯酸滴定法、HPLC法等，但是没有D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量分析方法详细的描述。为了保证D-对羟基苯甘氨酸甲酯的质量，D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量测定方法尤其重要，因此本发明阐述了种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量HPLC测定方法。

发明内容

1、本发明的目的是提供一种高效的D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，该检测方法具有耗时短、灵明度高、重现性好等优点。这种检测方法能更快、更准地分析测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯的含量，从而保证了用药的安全性，更好的指导药品生产。

2、HPLC方法和高氯酸滴定法分别测量D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量，直观地比较两种分析方法结果，凸显了HPLC方法的优越性。

3、HPLC方法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯的含量。

3.1 D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相的制备：（磷酸盐缓冲溶液：乙腈=942：58）0.05mol/L磷酸盐缓冲液（称13.61g磷酸二氢钾加水2000ml溶解，用氢氧化钠溶液调PH=5.00）量取123ml的乙腈混合即得。

3.2本发明所述的高效液相色谱流动相为D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相：此流动相为磷酸缓冲盐溶液和有机相改性剂的混合溶液，配置方法见上述3.1步骤。

3.3高效液相仪的检测器为紫外检测器，根据预处理检测波长220～230nm，优选检测波长225nm。

3.4洗脱液的流速为0.8～1.0ml/min,根据预处理的结果流速优选1.0ml/min。

3.5高效液相仪的柱温控制在20°～25°，选择柱温为25°。

3.6对照品溶液的制备:精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品2份，各20mg，分别于100ml容量瓶中，加D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。

3.7样品溶液的制备:精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品2份，各20mg，分别于100ml容量瓶中，加D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。

3.8试样中D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量按下式计算：

w％=

×100%

式中：

A₁--对照品溶液的峰面积,

A₂--样品溶液的峰面积,

m₁--对照品的称样量，（g)

m₂--样品的称样量，（g）

P--对照品的含量，（％）

3.9色谱仪启动后进行设定，以达到色谱条件，当色谱仪达到设定的操作条件并稳定后进行标准品和试样的检测，用色谱工作站或数据处理系统记录D-对羟基苯甘氨酸甲酯标准品和样品的峰面积，通过外标法定量；

色谱柱：C18（4.6mm×250mm,5μm);

检测波长：225nm;

流速：1.0ml/min;

柱温：25°

进样量：20μL。

4、高氯酸滴定法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量

4、1试剂和溶液冰乙酸(AR)、高氯酸标准溶液（c=0.1mol/L）。

4、2主要仪器电子天平（感量为0.1mg）、半自动滴定仪（分度值为0.1mL）、电磁搅拌器、电位滴定仪器

4、3操作方法：精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯0.2001g，置于干燥的烧杯中，加冰乙酸50ml,加2滴结晶紫指示剂，于滴定台上用磁力搅拌器搅拌至溶解后，用0.1mol/L的高氯酸标准溶液滴定至蓝色为终点，并将滴定结果用空白试验校正。

将记录的实验结果按以下计算公式计算得到D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量：

W%=

×100%

式中：

W—D-对羟基苯甘氨酸甲酯的百分含量,（%）；

C—高氯酸标准溶液浓度,（mol/L）；

V₁—滴定样品所消耗高氯酸标准溶液的体积，（ml）；

V₀—空白样品所消耗高氯酸标准溶液的体积，（ml）；

m—称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品质量，（g）；

0.18119—与1.00ml高氯酸标准溶液（C=0.1000mol/L）相当于的以克表示D-对羟基苯甘氨酸甲酯的质量。

5、平行测定结果

平行试样相对误差不应大于2％，取两次平行测定的算数平均值为测定结果。平行测定结果绝对误差不应大于2％，取2次平行测量结果的算术平均值为测定结果。

6、与目前现有的测量D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的技术相比较而言，本发明操作简单，只需把D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品进行稀释即可，在一定程度上节省了时间，而且使用精密的高效液相色谱仪，提高了测量结果的准确性。

附图说明

图1是本检测方法实施例2中第1个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯的色谱图。

图2是本检测方法实施例2中第1个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯平行对照的色谱图。

图3是本检测方法实施例2中第2个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯的色谱图。

图4是本检测方法实施例2中第2个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯平行对照的色谱图。

图5是本检测方法实施例2中第3个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯的色谱图。

图6是本检测方法实施例2中第3个样品D-对羟基苯甘氨酸甲酯平行对照的色

谱图。

图7是本检测方法实施例5中D-对羟基苯甘氨酸甲酯标准品的线性方程。

具体实施方式

下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本检测方法要求所保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。

色谱仪：安捷伦1220型液相色谱仪

实施例1：HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的条件即

色谱柱；C18(4.6mm×250mm,5μm)；检测波长：225nm；流速 1.0mL/min；柱温：25℃，进样量：20μL。D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相的制备：准确称13.61g磷酸二氢钾,加水2000ml溶解，用氢氧化钠溶液调PH=5.00，量取123ml的乙腈混合即得。对照品溶液的制备:精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品20mg，于100ml容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。样品溶液的制备：精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品20mg,于100mL容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。

实施例2：HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的具体测定

色谱条件：色谱柱；C18(4.6mm×250mm,5μm)大连依利特产；检测波长：225nm；流速1.0mL/min；柱温：25°，进样量：20μL。进样：用进样针分别吸取20μL D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品和样品溶液，通过手动进样器进样。其它峰和D-对羟基苯甘氨酸甲酯峰分离度不应小于1.5。分别称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品20.08mg、20.00mg,用流动相溶解定容至100ml容量瓶中，按照规定方法用液相色谱进行分离检测，得到两个对应的峰面积8205.36035、8117.80029。称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品两份，各19.99mg,20.04mg,得到两个对应的峰面积8179.53223、8180.67041。将测得D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品、样品溶液的峰面积和称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品、样品的质量，用外标法计算。

计算D-对羟基苯甘氨酸甲酯的百分含量W%:

W%=

×100%

式中：

A₁--对照品溶液的峰面积

A₂--样品溶液的峰面积

m₁-对照品的称样量，（g）

m₂--样品的称样量，（g）

P--对照品的含量，（％）(本实施例中P=99.9％）

得到HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯百分含量为99.3％。

实施例3：D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品含量精密度的测定

用实施例2方法进行测量，取样品三份分别进行2次测量。结果如下表：

精密度检测结果

对3个D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品，进行含量精密度测定，相对标准偏差（RSD)≤2.0％，符合检测要求。

实施例4:高氯酸滴定法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量

精密称取2份D-对羟基苯甘氨酸甲酯0.2000g，置于干燥的烧杯中，加冰乙酸50ml,加2滴结晶紫指示剂，于滴定台上用磁力搅拌器搅拌至溶解后，用0.1mol/L的高氯酸标准溶液滴定至蓝色为终点，并将滴定结果用空白试验校正。

W%=

×100%

式中：

W—D-对羟基苯甘氨酸甲酯的百分含量,（%）；

C—高氯酸标准溶液浓度,（mol/L）；

V₁—滴定样品所消耗高氯酸标准溶液的体积，（ml）；

V₀—空白样品所消耗高氯酸标准溶液的体积，（ml）；

m—称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品质量，（g）；

0.18119—与1.00ml高氯酸标准溶液（C=0.0999mol/L）相当于的以克表示D-对羟基苯甘氨酸甲酯的质量。

得到高氯酸滴定法测得D-对羟基苯甘氨酸甲酯平均含量为99.59%.两次滴定相对标准偏差为1.28%。

从数据分析得到：HPLC方法实验数据比高氯酸滴定方法的标准偏差小，HPLC检测准确、不受外界环境条件影响。高氯酸滴定法终点不易判断，室温直接影响标准溶液的浓度，造成检测结果准确性偏低。

实施例5 本实施例是对HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量线性和范围分析方法的验证。

分别准确称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯标准品0.016g、0.018g、0.020g、0.022g、0.024g，于100mL容量瓶中，加入D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相溶解并定容，配制成浓度分别为 0.00016g/mL、0.00018g/mL、0.00020g/mL、0.00022g/mL、0.00024g/mL的D-对羟基苯甘氨酸甲酯标准品溶液，摇匀，按照实施例2的步骤分别吸取五个浓度的溶液，进样，得到相应的分析实验数据，结果如下表：

经确认，线性和范围检测结果的相关系数为R²=0.9994，结果符合规定。

该分析方法不仅结果准确度高、灵敏度高，而且耗时短、高效、重现性好、操作简单，对环境污染小，在一定程度上弥补了目前D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量测定方法操作规程的空白，补充了D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量测定的方法。

凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内,本发明所保护范围是要符合与本文所提供的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于：

（1）分别把D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品和供试品用配置好的D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相进行稀释，得到D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品和供试品溶液；

（2）用高效液相色谱法对D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品和供试品溶液进行色谱分析；

（3）将步骤（2）得到的色谱数据代入公式计算D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量。

2.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于，色谱柱选择：C18（4.6mm×250mm,5μm)。

3.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于，检测波长：220～230nm，流速：0.8～1.0ml/min，进样量：20μL，柱温：20～25°。

4.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于：

（1）步骤（2）所述的缓冲盐选为磷酸盐；所述的有机相选为乙腈，根据所选的缓冲盐和有机相以及水配置成流动相，

（2）流动相A的配制:磷酸盐缓冲溶液（浓度为0.05mol/L），称13.61g磷酸二氢钾加水2000ml溶解，用氢氧化钠溶液调PH=5.00，

（3）流动相B的配制:纯乙腈，

（4）混合流动相:流动相A与流动相B混合所得，

所用磷酸二氢钾、氢氧化钠为分析纯，乙腈为色谱纯试剂。

5.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量的检测方法，其特征在于对照品溶液的制备:精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品20mg，于100ml容量瓶中，加D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相溶解并定容至刻度，摇匀。

6.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于样品溶液的制备:精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品20mg，于100ml容量瓶中，加D-对羟基苯甘氨酸甲酯流动相溶解并定容至刻度，摇匀。

7.根据权利要求1所述的一种D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量检测方法，其特征在于试样中D-对羟基苯甘氨酸甲酯含量根据液相色谱所得的数据用外标法计算所得，平行测定结果试样误差不应大于0.2％，取两次平行测定的算数平均值为测定结果。