CN115266977A - 一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法 - Google Patents

一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种测定DL‑对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法。该方法是将DL‑对氯苯丝氨酸乙酯用稀酸溶液配制成溶液，采用一种化学键合固定相色谱柱，以缓冲盐加离子对试剂，用酸调pH至0.8‑12为缓冲盐溶液，缓冲盐加离子对试剂溶液与有机改性剂以适当比例进行梯度洗脱，然后在适当的检测波长、流速和柱温下检测，再根据谱图计算样品含量。采用本发明方法可使DL‑对氯苯丝氨酸乙酯、对氯苯丝氨酸、对氯苯甲醛得到较好的分离，准确测出DL‑对氯苯丝氨酸乙酯的含量，方法简单、可靠、迅速、灵敏度高、重现性和专属性好，为DL‑对氯苯丝氨酸乙酯质量标准的制定建立基础。

Description

一种测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法
技术领域
本发明涉及一种测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，特别是涉及一种利用高效液相色谱法(HPLC)进行的DL-对氯苯丝氨酸乙酯中测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的分析方法。
背景技术
DL-对氯苯丝氨酸乙酯是一种有机中间合成体，可以用于合成新型氟苯尼考类抗生素，其中氟苯尼考是专用于兽药的广谱抗生素，具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的广谱活性，广泛用于动物细菌感染的预防和治疗。据专利CN201611146617.X报道，近年来，许多细菌开始显示出对氟苯尼考的耐药性，促使了人们对新抗生素的需求，新型氟苯尼考类抗生素具有保留或超过氟苯尼考的活性，具有广阔的应用前景，而用于合成新型氟苯尼考类抗生素的DL-对氯苯丝氨酸乙酯，其市场前景可期。
氟苯尼考对应的中间体之一是DL-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，韩玉英等在《DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的合成及拆分》一文中报道了DL-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析的高效液相色谱(峰面积归一法)条件，采用Hyper ODS2 C18色谱柱，流动相V(乙腈)：V(水)＝7:3，检测器波长，UV254nm。(精细化工，2011，28(6)：599-602.)该分析方法仅能对DL-对甲砜基苯丝氨酸乙酯进行分析，无法对DL-对氯苯丝氨酸乙酯进行分析。
公开号为CN 101832981 A的中国专利申请公开了一种测定D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，该方法采用硅胶表面涂覆纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)固定相的手性柱，以正己烷、异丙醇和三乙胺的混合溶液作为流动相，进行HPLC分析，可以测定对D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯中D酯和L酯的含量。此方法与本专利申请的含量分析方法有本质区别。
此外，申请人在实际工作中发现DL-对氯苯丝氨酸乙酯的合成过程中，主要可能存在的两种杂质对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛，现有的测定分析方法没有特别针对这两种杂质进行很好的检测，导致这些检测方法难以符合实际需求。
目前尚未有对DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的测定分析方法进行详细的阐述。综上所述，为了配合DL-对氯苯丝氨酸乙酯应用的发展，本发明进行了一项测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的分析方法研究。
发明内容
本发明提供了一种DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，该分析方法操作简单，结果准确，重现性好，灵敏度高，并且便于对对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛的检测。
一种测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，包括以下步骤：
(1)将DL-对氯苯丝氨酸乙酯待测样品进行稀释，得到供试液；
(2)采用高效液相色谱对步骤(1)的供试液进行分析，得到液相色谱数据；
所述的高效液相色谱所用的流动相为流动相A与流动相B的混合溶液；
所述的流动相A为缓冲盐与离子对试剂溶液；
所述的流动相B为有机相；
所述的缓冲盐与离子对试剂溶液配制方法如下：
将无机盐、离子对试剂与超纯水混合，然后用酸调pH至2.0～6.0得到；
(3)根据步骤(2)得到的液相色谱数据计算待测样品中DL-对氯苯丝氨酸乙酯的含量。
步骤(1)中，可以用0.8～1.2moL moL/L盐酸水溶液、0.1％磷酸水溶液、超纯水、起始洗脱比例溶液配制对照品溶液(如需要用到)及样品溶液，优选为优选0.8～1.2moL moL/L盐酸水溶液或超纯水。
作为优选，步骤(2)中，分析所用的色谱柱为化学键合固定相色谱柱：UltimateXB-pHenyl(Ⅱ)，优选C18、C8、C3、AQ或苯基柱，更优选C18：柱长30～250mm(更优选250mm)；柱内径优选为1.0～10mm(更优选4.6mm)；色谱柱填料粒度范围在1.8～10μm(更优选5μm)。
所述检测器为可变波长检测器，检测波长为190～360nm，优选220～230nm，更优选225nm。
流动相流速为1.0～2.0mL/min，更优选为1.0mL/min。
作为优选，步骤(2)中，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液中无机盐选自钠、钾、铵的醋酸盐、磷酸盐或硫酸盐，优选为磷酸二氢钾，缓冲盐在水中的浓度为0-100mM(更优选为10mM)，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵、庚烷磺酸钠、四丁基溴化铵或十二烷基磺酸钠，优选为四丁基氢氧化铵，在水中的浓度为0.5-1.5mM(更优选为1.0mM)。
所述的有机改性剂选自乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙酮中的一种。
作为优选，所述的无机盐选为磷酸二氢钾，离子对试剂选为40％四丁基氢氧化铵，所述的有机相选自乙腈或甲醇。
作为优选，用来调节缓冲盐与离子对试剂溶液的pH值的酸选自磷酸、硫酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸、高氯酸或盐酸，优选磷酸，pH范围为0.8～12，更优选为0.8～5.0。
作为优选，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液用酸调pH至2.0～3.0。
作为优选，分析时采用梯度洗脱方法。
在实际操作过程中，为了减轻溶液混合时对分析过程的影响，一般不是直接将缓冲盐与离子对试剂溶液与有机相进行混合，而是在线进行混合分析。作为优选，流动相A为缓冲盐与离子对试剂溶液；流动相B为乙腈。
作为进一步的优选，梯度洗脱的流程如下：
(1)0～7min，流动相A与流动相B的体积比为90～85：10～15；
(2)7～12min，流动相A与流动相B的体积比为80～60：40～60；
(3)12～17min，流动相A与流动相B的体积比为50～40：60～50；
(4)17.1～27min，流动相A与流动相B的体积比为85～90：10～15
作为优选，所述的DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量通过面积归一法计算得到。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明对于DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品，均无需特别处理，只需要准确称量后用稀释液溶解稀释即可。
(2)采用本发明的方法利用HPLC测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯中DL-对氯苯丝氨酸乙酯的含量，操作简单、结果准确、重现性好、灵敏度高，为DL-对氯苯丝氨酸乙酯质量标准的建立奠定基础。
(3)本发明的检测方法能够检测出DL-对氯苯丝氨酸乙酯的对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛两种杂质，因而特别适合DL-对氯苯丝氨酸乙酯合成工艺和产品质量的控制。
附图说明
图1实施例2中DL-对氯苯丝氨酸乙酯在流动相A的pH为2.0时的系统适应性色谱图，主峰出峰时间为12.241min。
图2实施例2中DL-对氯苯丝氨酸乙酯的样品溶液在流动相A的pH为2.2时色谱图，主峰出峰时间为12.100min。
图3为实施例3中DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液在流动相流速为1.1ml/min时的色谱图，主峰出峰时间为12.043min。
图4为实施例4中DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液在柱温为40℃时的色谱图，主峰出峰时间为12.310min。
图5为DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品在波长为223nm时的色谱图，主峰出峰时间为12.002min。
图6为现有DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法检测出DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液色谱图，主峰出峰时间为23.215min。
图7为pH＝2.0HClO4为流动相A条件下的DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液色谱图，主峰出峰时间为8.392min。
图8为DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品氧化降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.104min。
图9为DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品酸降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.144min。
图10为DL-对氯苯丝氨酸乙酯样品碱降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.134min。
以下结合实施例对本发明做进一步说明，但这些实施例不得用于解释本发明保护范围的限制。
各实施例所用仪器均为Agilent高效液相色谱仪；DL-对氯苯丝氨酸乙酯对照品为自制，含量大于99.5％。
在进行梯度洗脱时，流动相之间的比例，如无特殊说明，都为体积比。
具体实施方式
实施例1
色谱条件：
可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；色谱柱：Ultimate XB-C18。
流动相和洗脱方式：
流动相A为缓冲盐与离子对试剂溶液；流动相B为乙腈。洗脱方式为梯度洗脱。梯度洗脱程序见下表：
时间(min) 0 7 12 17 17.1 27
流动相A 90 80 40 40 90 90
流动相B 10 20 60 60 10 10
酸(对氯苯丝氨酸)储备液：称取50mg对氯苯丝氨酸对照品于100ml容量瓶中，加入1mol/L HCL溶解后，用纯水定容，摇匀。
醛(对氯苯甲醛)储备液：称取醛(对氯苯甲醛)对照品50mg于100ml容量瓶中，加乙腈5ml溶解后，用乙腈：水＝1:1稀释至刻度，称重、摇匀。
系统适应性溶液：称取DL-对氯苯丝氨酸乙酯对照品30mg于50ml容量瓶中，加入1mol/L HCL溶解后，分别加入1ml酸储备液和醛储备液于同一容量瓶中，加水定容，摇匀。(对氯苯丝氨酸浓度为0.01mg/ml)。
供试液(样品溶液)：称取DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品60mg于100ml容量瓶中，加入1mol/L HCL溶解后，用纯水定容，摇匀。(浓度为0.6mg/ml)。
实施例2
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；色谱柱：Ultimate XB-C18。
缓冲盐加离子对试剂溶液：10mM磷酸二氢钾，1.0mM 40％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值至2.0±0.2。
以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)
系统适应性溶液
Figure BDA0003763948850000061
Figure BDA0003763948850000062
样品溶液
Figure BDA0003763948850000063
缓冲盐加离子对试剂溶液的pH值为2.0时，进系统适应性溶液得到的色谱图见图1，pH为2.2时，进样品溶液得到的色谱图之一见图2。
实施例3
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；将流速改为：0.9mL/min～1.1mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；色谱柱：Ultimate XB-C18。
流动相A：pH＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相B：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变流速与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
系统适应性溶液
Figure BDA0003763948850000071
样品溶液
Figure BDA0003763948850000072
其中，流速1.1mL/min时，进样品溶液得到的色谱图之一见图3。
实施例4
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃和40℃；进样体积：10μL；色谱柱：Ultimate XB-C18。
流动相A：pH＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相B：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变柱温与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
系统适应性溶液
Figure BDA0003763948850000073
样品溶液
Figure BDA0003763948850000081
其中，柱温为40℃时，进样品溶液得到的色谱图之一见图4。
实施例5
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：223nm和227nm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；色谱柱：Ultimate XB-C18。
流动相A：pH＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相B：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变检测波长与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
系统适应性溶液
Figure BDA0003763948850000082
样品溶液
Figure BDA0003763948850000083
其中，波长为223nm时，进样品溶液得到的色谱图之一见图5。
对比例1
采用现有DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法(色谱柱：Hyper ODS2C18色谱柱，流动相V(乙腈)：V(水)＝7:3，检测器波长，UV254 nm；流速，1.0mL/min)，对DL-对氯苯丝氨酸乙酯进行检测，结果如下：
样品溶液
Figure BDA0003763948850000091
由上述数据可以看出现有DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法只能检测出酸和酯的含量，检测不出醛含量，且运行时间过长，故不适合DL-对氯苯丝氨酸乙酯制备和质量控制过程中的监测。本专利的检测方法可以检测出已知杂质酸、醛以及一些未知杂质。其中，现有DL-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法检测出的样品溶液图之一见图6。
对比例2
改变流动相的种类，选择用pH＝2.0HClO4水溶液代替缓冲盐加离子对试剂溶液作为流动相A，其它条件不变，对DL-对氯苯丝氨酸乙酯进行检测，结果如下：
系统适应性溶液
Figure BDA0003763948850000092
样品溶液
Figure BDA0003763948850000093
由上述数据可以看出流动相A为pH＝2.0HClO4时，主成分酯的拖尾因子大于1.5，不符合方法学验证的要求，且醛的响应值很低。其中pH＝2.0HClO4流动相条件下的样品溶液色谱图见图7。
实施例6
本方法对DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的测定分析方法的学术性考察。
专属性
氧化降解
称取60mg DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml容量瓶中，加4ml30％H2O2放置3h后，加2ml 1N盐酸溶解，加水定容，摇匀。同时做空白。
检测数据
氧化降解试验结果
Figure BDA0003763948850000101
氧化降解后的图谱之一见图8。
酸降解
称取60mg DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml容量瓶中，加4ml1mol/L HCl溶液64h后用1mol/L NaOH调节pH至中性(pH≈6～7)，加水定容，摇匀。
检测数据
酸降解试验结果
Figure BDA0003763948850000102
酸降解后的图谱之一见图9。
碱降解
称取60mg DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml样品瓶中，加3.0ml1mol/L NaOH溶液，30s后用0.1mol/L HCl溶液调节pH至中性(pH＝6～7)，加2ml1N盐酸,溶解，加水定容，摇匀。
检测数据
碱降解试验结果
Figure BDA0003763948850000103
碱降解后的图谱之一见图10。
样品在强氧化性、酸性、碱性条件下有明显降解。
线性关系考察
准确称取DL-对氯苯丝氨酸乙酯标准品适量，分别配成浓度为LOQ、60％(0.36mg/ml)、80％(0.48mg/ml)、100％(0.6mg/ml)、120％(0.72mg/ml)、的浓度，各进3针，以图谱中主峰面积的平均值对被测溶液浓度进行线性回归；要求：相关系数R≥0.999，截距≤2.0％。
DL-对氯苯丝氨酸乙酯
Figure BDA0003763948850000111
稳定性试验
称取DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品60mg于100ml容量瓶中，加入1N盐酸2ml溶解加水定容，摇匀。作为稳定性溶液，稳定性溶液在配制完成后在室温条件下间隔0、2、4、6、8、10、16、20、24小时各进样品溶3针。要求：主含量其余各时间点测定结果与0小时测定结果的偏差≤2％，RSD≤1％，且较0小时溶液无杂质峰出现。
Figure BDA0003763948850000112
Figure BDA0003763948850000121
Figure BDA0003763948850000131
方法精密度
选取同一批DL-对氯苯丝氨酸乙酯湿品，分别称取6份样品，每份溶液进2针；要求：主峰面积的RSD≤1％。
Figure BDA0003763948850000132
色谱系统精密度
进系统适应性溶液6针；要求：主峰面积的RSD≤1％。
Figure BDA0003763948850000133
Figure BDA0003763948850000141

Claims (10)

1.一种测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将DL-对氯苯丝氨酸乙酯待测样品进行稀释，得到供试液；
(2)采用高效液相色谱对步骤(1)的供试液进行分析，得到液相色谱数据；
所述的高效液相色谱所用的流动相为流动相A与流动相B的混合溶液；
所述的流动相A为缓冲盐与离子对试剂溶液；
所述的流动相B为有机相；
所述的缓冲盐与离子对试剂溶液配制方法如下：
将无机盐、离子对试剂与超纯水混合，然后用酸调pH至2.0～6.0得到；
(3)根据步骤(2)得到的液相色谱数据计算待测样品中DL-对氯苯丝氨酸乙酯的含量。
2.根据权利要求1所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，步骤(1)中，用0.8～1.2moL/L的稀盐酸或超纯水稀释待测样品。
3.根据权利要求1所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，步骤(2)中分析所用色谱柱为化学键合固定相色谱柱：Ultimate XB-C18；
检测器为可变波长检测器，检测波长为220～230nm；
流动相流速为0.8～1.5mL/min。
4.根据权利要求1所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的无机盐选自钠、钾、铵的醋酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸一氢盐、硫酸氢盐或硫酸盐，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵、庚烷磺酸钠、四丁基溴化铵或十二烷基磺酸钠；
所述的有机相选自乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙酮中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，所述的无机盐选自磷酸二氢钾，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵，所述的有机相选自甲醇或乙腈。
6.根据权利要求5所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液为10-100mM磷酸二氢钾与0.5-1.5mM四丁基氢氧化铵水溶液混合后，再用磷酸调pH值至1.8～2.2得到；所述的有机相为乙腈。
7.根据权利要求6所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，步骤(2)中，先分别配制浓度不同的流动相A和流动相B，然后采用梯度洗脱的方法进行分析。
8.根据权利要求7所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，步骤(2)中，梯度洗脱的流程如下：
(1)0～7min，流动相A与流动相B的体积比为90～85：10～15；
(2)7～12min，流动相A与流动相B的体积比为80～60：40～60；
(3)12～17min，流动相A与流动相B的体积比为50～40：60～50；
(4)17.1～27min，流动相A与流动相B的体积比为85～90：10～15。
9.根据权利要求7所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，梯度洗脱的流程如下：
时间(min) 0 7 12 17 17.1 27 流动相A 90 80 40 40 90 90 流动相B 10 20 60 60 10 10
10.根据权利要求1所述的测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量通过面积归一法计算得到。
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