CN115656400B - 一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测尿液中11‑脱氢血栓烷B₂(11‑dehydro thromboxane B₂，11dhTxB₂)的液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)方法和试剂盒，包括如下内容：(1)一种用于检测尿液中11dhTxB₂的液相色谱‑串联质谱方法，步骤如下：尿液样本加入稳定剂，用酸化剂调节pH后孵育一段时间，再加入同位素内标，然后经特异性固相萃取柱对11dhTxB₂进行除杂、纯化和富集，使用液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)对样本提取液进行分析。(2)一种用于检测尿液中11dhTxB₂的试剂盒，包括特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、稳定剂、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。本发明可实现尿液中11dhTxB₂的精准定量检测，具有良好的特异性、灵敏度、精密度和准确度。

Description

一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱 方法和试剂盒

技术领域

本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。

技术背景

11-脱氢血栓烷B₂(11-dehydro-thromboxane B₂，11dhTXB₂)是血栓烷素A₂(thromboxane A₂，TXA₂)的终末代谢产物，主要经肾排出。血栓烷素A₂(TXA₂)是一种前列腺素的代谢产物，在止血和心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。TXA₂有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体(TPR)激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。但是TXA₂高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B₂(thromboxane B₂，TXB₂)。TXB₂随后在肝中被转化为半衰期更长的11-脱氢血栓烷素B₂(11dhTXB₂)，并经尿液排出。体外血小板激活会明显影响血清TXB₂的测定结果，却对血清11dhTXB₂水平无影响，同时尿液与血清中11dhTXB₂的浓度有良好的相关性，因而测定尿液11dhTXB2的含量能更有效的反映体内TXA2的产生。

目前，已报道的11dhTXB₂的检测方法有放射性免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。市面上的商业化试剂盒多采用ELISA法测定，包括第一代基于多克隆抗体的ELISA试剂盒和第二代基于单克隆抗体的ELISA试剂盒，但第一代试剂盒已被停用。第二代试剂盒所使用的单克隆抗体会与另一种TXA2的代谢产物，11-脱氢-2,3-dinor-血栓烷素B₂(11-dh-2,3-dinor-TxB₂)产生交叉反应，显著影响检测结果，使检测值存在较大变异性，降低了第二代ELISA试剂盒的准确性和临床实用性。此外，市面上的11dhTXB₂试剂盒检测范围窄(300～4000pg/mL)，对人尿液中更高和/或更低水平的11dhTXB₂不能准确测定。GC-MS测定尿液中11dhTXB₂，前处理过程极其复杂，包括提取、衍生和富集过程，检测时间长，目前只应用于科研领域。LC-MS/MS是一种采用液相色谱分离、质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。采用固相萃取法可有效去除待测物干扰物并进行富集，以提高方法灵敏度。由于11dhTXB₂为小分子代谢物，且在尿液中影响其浓度的因素多，测得的尿11dhTXB₂浓度需用尿肌酐浓度进行校正，以排除尿液浓度和肾功能的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。该方法先加入稳定剂提高尿液样本的稳定性，再用酸化剂调节尿液pH，孵育一段时间后，采用特异性固相萃取材料，高效富集尿液中的11-脱氢血栓烷B₂(11dhTXB₂)，有效去除尿液中基质的干扰，实现对11-脱氢血栓烷B₂(11dhTXB₂)的精准检测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种尿液中11-脱氢血栓烷B₂的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、稳定剂、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。

优选的所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有苯基或C4～C18的正构烷基的亲和材料。

优选的所述校准液为用乙腈配制的9个浓度的溶液；其浓度范围为为0.5～100ng/mL。

优选的所述内标为11dhTxB₂-d₄，其浓度为5～50ng/mL。

优选的所述稀释液为pH2.0～4.0的PBS溶液。

优选的所述稳定剂为抗坏血酸、柠檬酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽中的一种或几种，其质量分数为0.01％～20％的水溶液。

优选的所述酸化剂为含10％～50％浓盐酸的水溶液。

优选的所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇。

优选的所述平衡液和淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂(甲醇、乙腈或乙醇)的混合溶液，

其体积比为(60～100)％：(40～0)％；有机试剂为甲醇、乙腈或乙醇。

优选的所述洗脱液为按体积比计含1％～10％甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。

一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂(11dhTxB₂)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)

方法，包括以下步骤：

(1)尿液样本与稳定剂混匀，加入酸化剂，使其pH在2.0～4.0之间；

(2)经酸化的尿液样本于25℃～45℃孵育1h～4h后，加入内标液混合，离心；

(3)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的尿液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用洗脱液洗脱并收集；

(4)将步骤(3)得到的洗脱液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算尿液样本中11-脱氢血栓烷B₂的含量。

优选的，步骤(4)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：

质谱条件：离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；

注：*为定量离子。

本发明的有益效果：

1、本发明使用的尿液样本，无创伤性、对患者要求低，有利于临床样本的采集；

2、本发明提供的稳定剂，可有效延长尿液样本的稳定时间，有利于尿液样本的运输、储存；

3、本发明提供的前处理方法，孵育过程可有效将11-脱氢血栓烷B₂开环转化为闭环形式，并去除杂质，实现对人尿液11-脱氢血栓烷B₂的精准检测；

4、本发明提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，有利于高通量测定临床样本；

5、本发明为首个基于液质方法开发的11-脱氢血栓烷B₂检测试剂盒，准确度高、特异性强，检测范围宽，易于临床推广和应用。

附图说明

图1为尿液中11dhTxB₂和11dhTxB₂-d₄的色谱图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的试剂盒。

一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的试剂盒，其组成见下表：

名称	成分
		固相萃取柱	特异性固相萃取柱
校准液	乙腈配制的9个浓度的11dhTxB2的校准品
		稀释液	PBS溶液(pH 3.0)
稳定剂	0.01％谷胱甘肽水溶液
		酸化剂	20％浓盐酸
活化液	甲醇
		平衡液	水
淋洗液1	水
		淋洗液2	10％甲醇
洗脱液	3％甲酸甲醇
		质控样本	2个浓度的11dhTxB2尿液样本
内标液	浓度为10ng/mL的11dhTxB2-d4溶液

其中，校准液中11dhTxB₂浓度见下表：

序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										浓度ng/mL	0.5	1	2	4	8	20	40	75	100

实施例2一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的液相色谱-串联质谱方法

该发明的检测方法主要包括以下主要步骤：

1、基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷B₂提取过程

(1)5mL尿液加入50μL稳定剂，混匀，用酸化剂调节pH至2.0～4.0；

(2)取(1)尿液500μL于35℃孵育3h，加入50μL内标液混匀，振荡5分钟，离心；

(3)特异性固相萃取柱(固相萃取材料是以硅胶为基质的含有C18的正构烷基，规格50mg/1mL)用300μL活化液活化、300μL平衡液平衡，加入上清液样本后，用300μL淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终采用150μL洗脱液洗脱，收集。

2、液质分析条件

(1)检测设备：AB SCIEX Triple Quad 4500MD液相色谱串联质谱仪

(2)色谱条件：

色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：

(3)质谱条件：

离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；

注：*为定量离子。

3、检测结果计算

采用校准曲线法计算尿液中11-脱氢血栓烷B₂的浓度。取50μL校准溶液加入450μL稀释液混合，按照步骤1中“基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷B₂提取过程”项进行样品处理后，进行液质分析。根据各物质峰面积As和相应内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)对浓度C进行权重线性回归，拟合校准曲线，权重为1/C²(C为浓度值，单位：ng/mL)。尿液中11-脱氢血栓烷B₂同其内标测得的峰面积之比代入校准曲线，计算尿液中11-脱氢血栓烷B₂的浓度。

表1.LC-MS/MS法测定11-脱氢血栓烷B₂结果分析

实施例3一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂的液相色谱-串联质谱方法的准确度和精密度

基于试剂盒的检测方法的准确度和精密度评价实施方案如下：

采用添加低、中、高3个浓度的混合血浆样本作为待测样本，对3个浓度样本每批次各6份进行检测，测定3个批次，测定实施过程同实施例2，分别计算准确度、批内CV和批间CV，结果显示如下表，显示该方法具有优异的准确度和精密度性能。

表2方法的准确度和精密度性能

实施例4尿液中加入稳定剂前后稳定性对比

1、分别选取6个不同人尿液进行不加稳定剂样本室温24小时和6小时稳定性考察，基于试剂盒的检测方法测定结果见表3。

表3不加稳定剂人尿液样本室温稳定性结果

结果显示：尿液在采尿管中室温放置24小时后检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差RE％均超出±15％，即室温放置24小时人尿液样本不稳定。尿液在采尿管中室温放置6小时后检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差RE％＜±15％，即室温放置6小时人尿液样本稳定。

2、选取6个不同人尿液进行加入稳定剂样本室温稳定性考察，基于试剂盒的检测方法测定结果见表4。

表4加入稳定剂后人尿液样本室温稳定性结果

结果显示：在采尿管中加入稳定剂后室温放置7天检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差RE％＜±15％，即加入稳定剂后室温放置7天尿液样本稳定。

实施例5参考区间

在确定本试剂盒的参考区间时，从医院或健康体检中心收集健康人(或正常人)尿液样本1530例，按下表分组，其中男性和女性各765例。计算正常人样本检测值的单侧95％(上限)作为参考值。

经计算所得本试剂盒参考区间结果如下：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂（11dhTxB₂）的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成包括：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、稳定剂、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本；

所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有C18的正构烷基的亲和材料；

所述校准液为用乙腈配制的9个不同浓度的溶液；浓度范围为0.5~100 ng/mL；

所述内标液为5~50 ng/mL 11dhTxB₂-d₄；

所述稀释液为pH 2.0~4.0的PBS溶液；

所述稳定剂为质量分数0.01％的谷胱甘肽水溶液；

所述酸化剂为含10%~50%浓盐酸的水溶液；

所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇；

所述平衡液和淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂的混合溶液，其体积比为(60~100) %：(40~0) %；所述有机溶液为甲醇、乙腈或乙醇；

所述洗脱液为按体积比计含1%~10%甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。

2.一种使用权利要求1所述的试剂盒检测尿液中11-脱氢血栓烷B₂（11dhTxB₂）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）尿液样本与稳定剂混匀，加入酸化剂，使其pH在2.0~4.0之间；

（2）经酸化的尿液样本于25℃~45℃孵育1h~4h后，加入内标液混合，离心；

（3）特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的尿液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用洗脱液洗脱并收集；

（4）将步骤（3）得到的洗脱液，采用液相色谱-串联质谱进行分析，通过校准液建立的校准曲线计算尿液样本中11-脱氢血栓烷B₂（11dhTxB₂）的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5 μL；流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：乙腈溶液；梯度洗脱条件：

；

质谱条件：离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测（MRM）；

；

注：为定量离子。