CN114689771A - 一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒 - Google Patents

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CN114689771A CN202210257091.1A CN202210257091A CN114689771A CN 114689771 A CN114689771 A CN 114689771A CN 202210257091 A CN202210257091 A CN 202210257091A CN 114689771 A CN114689771 A CN 114689771A
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Abstract

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒。针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血清中的ADS、DHEA和DHEAS时，对于多组分的测定需要大量的样品量和时间，且缺乏高质量游离态激素的测定手段，对由游离态激素的测定大多使用间接测试，基本手段为测量总激素以及蛋白总量，然后利用质量方程对游离态激素进行理论估算，其准确度不足，操作麻烦等技术问题，本申请提供一种同时检测血清中三种游离雄激素含量的方法，具有检出限低、准确度高、重现性好、耗时短的优点。本申请还提供了一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，仅需300μL血清样品即可实现检测，操作快速简便。

Description

一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒。
背景技术
无论是成人，还是青少年和新生儿，类固醇激素的定量测定对于评估肾上腺和性腺功能、鉴别诊断和治疗药物监测都很重要，对诊断新生儿先天性肾上腺增生和类固醇合成缺陷尤为重要。许多实验室对雄激素的测定往往仅限于睾酮。为了更准确地评价两性雄激素的状况，测量其他雄激素，如雄烯二酮(ASD)、脱氢表雄酮(DHEA)和硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)，可以更全面的了解女性体内最丰富的循环雄激素的信息。
ASD和DHEA由肾上腺和性腺产生，是体内合成雌激素和睾酮激素的重要前体。DHEAS在女性几乎全部来自肾上腺，在男性则有一些来自于睾丸，是最丰富的循环雄激素。ASD、DHEA和DHEAS的分泌随年龄变化，从青少年开始分泌，在20430岁达到顶峰，然后逐渐下降。因为这三种化合物有一半以上的产量来自自肾上腺，是指示肾上腺雄性激素产量的良好标志物。ASD、DHEA和DHEAS常一起作为女性高雄激素的初筛项目，高雄激素血症是多囊卵巢综合征女性(PCOS)的一个常见特征，同时存在少排卵和/或微多囊卵巢形态，则可确诊为PCOS。因此，将患者定义为高雄激素血症具有重要的临床意义。不幸的是，临床上和生理性高雄激素症的评估通常依赖于不准确的方法。
常规的雄激素检测方法为自动化学发光免疫法，对于低浓度的样品存在很大的高估，可能会对许多多囊卵巢综合征女性的表型进行错误的分类，在个体代谢风险的估计方面存在错误。大多数常规实验室用于评估这些激素的方法的敏感性和准确性都很差，尤其是在女性参考范围。该领域主要科学团体推荐的液相或气相色谱-质谱法和平衡透析法，通常只在研究实验室和一些临床实验室可用。如中国专利申请公布号CN114088859A，发明名称为“一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法”，公开了的方法提出了一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法，通过对超高效液相色谱的流动相和洗脱条件进行优化，使多组同分异构体得以分离，通过优化液相条件和质谱参数可以同时检测含量跨度在ng级至pg级的不同类固醇激素，实现了对样品中包含多组同分异构体在内的29种类固醇激素含量的同步检测，但依然存在检测限达不到检测游离ASD、DHEA和DHEAS的要求。此外，目前没有高质量的游离态化合物检测方法时，依赖于总化合物和性激素结合球蛋白测量，或游离雄激素指数或质量方程计算生物利用度分数计算游离态化合物的方法是不充分的。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血清中的ASD、DHEA和DHEAS时，采用免疫测定法只能对单个物质进行测定，对于多组分的测定需要大量的样品量和时间，且同时对多组分雄激素进行测定，缺乏高质量游离态激素的测定手段，对由游离态激素的测定大多使用间接测试，基本手段为测量总激素以及蛋白总量，然后利用质量方程对游离态激素进行理论估算，其准确度不足，操作麻烦的技术问题，本申请提供一种同时测的血清中三种游离雄激素含量的方法，具有检出限低、准确度高、重现性好、耗时短的优点。本申请还提供了一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，仅需300μL血清样品即可实现检测，操作快速简便。
2、技术方案
为达到上述目的，提供的技术方案为：
本发明的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，包括以下步骤：
包括先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素的步骤；
包括使用高效液相色谱串联质谱检测所述三种游离雄激素的步骤。
进一步的，所述超滤包括以下步骤：
在血清样品中加入缓冲液，静置，于4440℃，2000g离心1h。
优选的，600μL缓冲液加入300μL样品，静置5min，于25℃，2000g离心1h，最优的，于37℃，2000g离心1h。
优选的，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；pH为7.4。
进一步的，所述液液萃取包括以下步骤：
超滤后得超滤液，在所述超滤液中加入内标溶液和萃取剂，涡旋3min，于4℃，12000g离心5min。
所述萃取剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正己烷、二氯甲烷中的一种或几种；500μL超滤液加入30μL内标溶液和50041000μL萃取溶液。
优选的，萃取后，取上层液体，氮吹干后加入100μL的04100％甲醇溶液复溶，涡旋1min，取90μL加入96孔板，待上机检测。
进一步的，校准曲线溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；
质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL，DHEA的浓度为54250ng/mL，DHEAS的浓度为5042500ng/mL；
ASD、DHEA和DHEAS的内标溶液分别为ASD-d7、DHEA-d6和DHEAS-d6，溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
优选的，采用替代基质配制校准曲线和质控样品，所述替代基质为水、甲醇、乙腈中的一种或几种。
进一步的，所述校准曲线溶液中，ASD、DHEA和DHEAS的浓度梯度如下所示：
Figure BDA0003549067290000031
所述质控品溶液中，ASD的浓度梯度为0.1、1、5ng/mL；DHEA的浓度梯度为5、50、250ng/mL；DHEAS的浓度梯度为50、500、2500ng/mL。
进一步的，所述高效液相色谱条件为：进样器温度：8℃；柱温：40℃；洗脱梯度如下：
Figure BDA0003549067290000032
所述流动相A：含氟化铵水溶液；
所述流动相B：含甲醇溶液。
优选的，使用ACQUITY
Figure BDA0003549067290000034
BEH C18(2.1×50mm 1.7μm)(Waters)色谱柱；所述流动相A为045mM氟化铵水溶液。
进一步的，所述质谱条件为：多反应监测参数如下：
Figure BDA0003549067290000033
扫描模式：多反应离子监测；电离模式：正、负离子模式；正离子毛细管电压：3.0kV，负离子毛细管电压：-2.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂气流速：800L/Hr。
一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，所述试剂盒包括以下组分：
校准品溶液；质控品溶液；内标准品溶液；替代基质；活化剂；缓冲液；萃取剂；流动相。
进一步的，校准溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；
质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL、DHEA的浓度为54250ng/mL、DHEAS的浓度为5042500ng/mL；
内标准品溶液分别为ASD-d7、DHEA-d6和DHEAS-d6溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
进一步的，所述萃取剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正己烷、二氯甲烷中的一种或几种。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素，再使用高效液相色谱串联质谱对所述三种游离雄激素进行检测，相比现有技术，所需的样品体积仅需300μL，使用超滤分离游离的ASD、DHEA和DHEAS，相比平衡透析操作更简便且耗时短，利用液液萃取对分析物的快速富集和提纯，操作简便。经前处理后，使用性能稳定的短柱和超高液相色谱串联质谱，对流动相和质谱方法的优化，将分析析时间缩短至4.0min，增加分析的线性范围，提高分析的灵敏度，测试结果的准确度和精密度较好。
ASD、DHEA和DHEAS的方法检出限(S/N>3)分别为0.005ng/mL、0.1ng/mL和1ng/mL，对应定量限(S/N>10)0.01ng/mL、0.5ng/mL和5ng/mL，分析灵敏度高。
本申请样品制备简单，分析速度快、线性范围广、灵敏度高、重现性好、特异性高，可以适用于检测人体血清中游离ASD、DHEA和DHEAS的含量用于临床的医疗诊断。
(2)本发明的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，包含校准品溶液、质控品溶液、内标准品溶液、替代基质、活化剂、缓冲液、萃取剂和流动相，可以用来检测病人的血清中游离ASD、DHEA和DHEAS的含量来筛查ASD、DHEA和DHEAS异常引起的相关疾病，通过超滤测定高生理活性的血清游离ASD、DHEA和DHEAS，更能反映体内的ASD、DHEA和DHEAS生物效应，更为有效辅助临床诊断。
4、附图说明
图1是ASD的校准曲线；
图2是DHEA的校准曲线；
图3是DHEAS的校准曲线；
图4是血清中三种游离雄激素及其同位素内标的色谱图。
5、具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：
表1检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000051
本实施例中，其中，检测前，先将校准曲线溶液用替代基质稀释，ASD的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL；DHEA的浓度梯度为1、2.5、10、25、50、100、250、500ng/mL；DHEAS的浓度梯度为10、25、100、250、500、1000、2500、5000ng/mL。所述质控品溶液用替代基质稀释，其浓度分别为ASD：0.1、1、5ng/mL；DHEA：5、50、250ng/mL；DHEAS：50、500、2500ng/mL。内标ASD-d7、DHEA-d6和DHEAS-d6的浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。本实施例的试剂盒，采集的血清样品不需要衍生化处理，且样品体积仅需300μL，利用液液萃取对分析物的快速富集和提纯，使用超滤分离游离的雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮，相比平衡透析操作更简便且耗时短，操作简便。校准瓶溶液，质控品溶液采用高浓度封装，便于规模化生产，节约成本。
实施例2
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例1，所不同的是，校准品溶液、质控品溶液和内标准品溶液的浓度及梯度。
表2检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000061
本实施例的试剂盒，校准品溶液内含ASD的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL；DHEA的浓度梯度为1、2.5、10、25、50、100、250、500ng/mL；DHEAS的浓度梯度为10、25、100、250、500、1000、2500、5000ng/mL。所述质控品溶液浓度分别为ASD：0.1、1、5ng/mL；DHEA：5、50、250ng/mL；DHEAS：50、500、2500ng/mL。检测前无需再进行稀释，操作更加简便，节约检测时间，适用于日检测量较多的大型医院等使用场景。
实施例3
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，萃取剂的种类不同。
表3检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000062
实施例4
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，萃取剂的种类不同。
表4检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000071
实施例5
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，萃取剂的种类不同。
表5检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000072
实施例6
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，复溶液的种类不同。
表6检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000073
实施例7
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，复溶液的种类不同。
表7检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000081
实施例8
本实施例的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，流动相的种类不同。
表8检测血清中游离雄激素含量的试剂盒的组份
Figure BDA0003549067290000082
实施例9
本实施例的一种同时检测血清中三种游离雄激素含量的方法，使用实施例14实施例8的试剂盒，包括如下步骤：
1.实验材料
1.1试剂
如实施例148的试剂盒组分。
1.2主要仪器设备和耗材
LC-MS/MS：Waters Acquity超高效液相色谱系统和Waters Xevo TQS串联质谱；
色谱柱：ACQUITY
Figure BDA0003549067290000092
BEH C18(2.1×50mm 1.7μm)(Waters)；
漩涡混合器(Vortex-Genie 2,Scientific Industries,Inc.)；
台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；
MD200系列氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
2.溶液及试剂的配制
2.1校准曲线和质控品的配制
仅实施例1所述试剂盒组成需要此步骤操作：采用替代基质配制校准曲线和质控品，最终校准曲线浓度梯度对应ASD的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL；DHEA的浓度梯度为1、2.5、10、25、50、100、250、500ng/mL；DHEAS的浓度梯度为10、25、100、250、500、1000、2500、5000ng/mL。高浓度、中等浓度和低浓度质控品配制在替代基质中，其浓度分别为ASD：0.1、1、5ng/mL；DHEA：5、50、250ng/mL；DHEAS：50、500、2500ng/mL。这些质控品用于考察实验方法的精密度、准确度、提取回收率和稳定性。
2.2流动相和其它溶液的配制
流动相A——0.5mM氟化铵水溶液(实施例8为纯水溶液)；
流动相B——甲醇溶液；
3.样品的制备
使用不含任何添加剂的真空采血管采集患者的血清样本。在超滤管中加入活化剂，在37℃，2000g的条件下离心10min以活化超滤管；300μL血清/校准溶液/质控品加入600μL缓冲液，转移到已经活化的超滤管中，在37℃，2000g的条件下离心大约1小时；取出500μL超滤液加入30μL内标溶液，加入800mL萃取液溶液进行液液萃取，涡旋3min，4℃，12000g离心5min，取上层液体，氮吹干后加入100μL的复溶液复溶，涡旋3min，取90μL加入96孔板，待上机检测。
表9标准曲线工作液浓度和内标浓度
Figure BDA0003549067290000091
4.仪器条件
4.1液相条件
本实验选用ACQUITY
Figure BDA0003549067290000093
BEH C18(2.1×50mm 1.7μm)(Waters)色谱柱，以同时含0.5mM氟化铵水溶液(A)或纯水(A，实施例8)和甲醇(B)为流动相，洗脱梯度见表10，流速0.40mL/min，分析时间为4.0min。
进样器温度：8℃
柱温：40℃
运行时间：4.0min
洗脱梯度：
表10流动相的洗脱梯度
Figure BDA0003549067290000101
4.2质谱条件
优化结果如下：
扫描模式：多反应离子监测
电离模式：正、负离子模式
正离子毛细管电压：3.0kV；负离子毛细管电压：-2.5kV
离子源温度：150℃
脱溶剂温度：550℃；脱溶剂气流速：800L/Hr；
表11多反应监测参数
Figure BDA0003549067290000102
5.数据处理
由MassLynx软件采集分析物和内标的色谱图和积分处理，校正曲线以1/x2为加权系，用校准曲线样品中分析物的峰面积和内标的峰面积的比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归，得到游离ASD、DHEA和DHEAS的浓度。
6.结果与讨论
以实施例1的结果为例：
本方法建立了一种UPLC-MS/MS测定血清中游离ASD、DHEA和DHEAS的含量，在300μL的样品用量上依次采用超滤法和液液萃取来提取分析物。
ASD、DHEA和DHEAS的方法检出限(S/N>3)分别为0.005ng/mL、0.1ng/mL和1ng/mL，对应定量限(S/N>10)0.01ng/mL、0.5ng/mL和5ng/mL，分析灵敏度高。
样品在动态监测范围内有良好的线性关系，相关系数r2>0.99，符合分析要求。
采用加标回收的方法来评估正确度和回收率，加标回收率均在可接受范围(96.8±7.4％)内，符合分析要求。
采用三种低、中、高浓度的质控瓶6次重复进样来评估对批内精密度，测试5天来评估批间精密度，批内和批间精密度变异系数分别为5.4％和7.2％，均小于15％，符合分析要求。
对处理后样品的重复进样考察在8℃进样盘放置24小时，室温放置24小时，冻融三次，在-80℃储存14天的稳定性。结果显示偏差在±15％以内，变异系数小于15％，结果符合要求。
综上所述，该方法样品制备简单，分析速度快、线性范围广、灵敏度高、重现性好、特异性高，可以适用于检测人体血清中游离ASD、DHEA和DHEAS的含量用于临床的医疗诊断。
实施例148结果比对分析：
实施例1和实施例2中试剂盒的组分类似，区别在于：实施例1的校准曲线和质控品需要用户使用时配制，而实施例2的校准曲线和质控品溶液已提前配好，用户可直接使用，但两个试剂盒的检测效果一致；实施例245中试剂盒的组分仅萃取液组分不一致，在使用实施例245试剂盒均可以完成游离ASD、DHEA和DHEAS的检测，但灵敏度上存在区别，这是由于不同萃取液对三个化合物的萃取效率不同，其中，甲基叔丁基醚的萃取效率略高于乙酸乙酯、高于二氯甲烷，远高于正己烷，设置不同灵敏度的试剂盒原因在于不同用户实验室的质谱仪的型号或灵敏度存在差异，用户可根据最终调试或测试结果选择合适的试剂盒。试剂盒2、6、7的组分仅复溶液组分不一致，在使用实施例2、6、7试剂盒均可以完成游离ASD、DHEA和DHEAS的检测，但灵敏度上存在区别，这是由于不同的复溶液对三个化合物的溶解度不同，其中40％甲醇水溶液高于甲醇和乙腈，设置不同灵敏度的试剂盒原因在于不同用户实验室的质谱仪的型号或灵敏度存在差异，用户可根据最终调试或测试结果选择合适的试剂盒。实施例2和8的组分仅流动相不一致，在使用实施例2和8试剂盒均可以完成游离ASD、DHEA和DHEAS的检测，但灵敏度上存在区别，这是由于不同的流动相对三个化合物的质谱信号不同，其中含氟化铵的流动相灵敏度高于纯水，同时本发明还比较不同氟化铵浓度对三个化合物的信号影响，其中0.5mM的氟化铵灵敏度最高，设置不同灵敏度的试剂盒原因在于不同用户实验室的质谱仪的型号或灵敏度存在差异，用户可根据最终调试或测试结果选择合适的试剂盒。
总结：血清ASD、DHEA和DHEAS作为体内雄激素的常见检测项目，是作为肾上腺雄激素异常的主要标志物，常用的免疫法检测法由于方法特异性和准确性都较差，其在低浓度时经常被高估，这些局限性使得生化性高雄激素血症的诊断不精确，在PCOS诊断和表型分配方面都存在潜在的错误。而本申请一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法和试剂盒，先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素，再使用高效液相色谱串联质谱检测所述三种游离雄激素，可以简单、快速、高效、灵敏、准确测定三种游离激素。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，其特征在于：包括以下步骤：
包括先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素的步骤；
包括使用高效液相色谱串联质谱检测所述三种游离雄激素的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述超滤包括以下步骤：
在血清样品中加入缓冲液，静置，于4440℃，2000g离心1h。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述液液萃取包括以下步骤：
超滤后得超滤液，在所述超滤液中加入内标溶液和萃取剂，涡旋3min，于4℃，12000g离心5min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：
校准曲线溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；
质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL，DHEA的浓度为54250ng/mL，DHEAS的浓度为5042500ng/mL；
ASD、DHEA和DHEAS的内标溶液分别为ASD-d7、DHEA-d6和DHEAS-d6，溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
5.根据权利要求4所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述校准曲线溶液中，ASD、DHEA和DHEAS的浓度梯度如下所示：
Figure FDA0003549067280000011
所述质控品溶液中，ASD的浓度梯度为0.1、1、5ng/mL；DHEA的浓度梯度为5、50、250ng/mL；DHEAS的浓度梯度为50、500、2500ng/mL。
6.根据权利要求5所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述高效液相色谱条件为：进样器温度：8℃；柱温：40℃；洗脱梯度如下：
Figure FDA0003549067280000012
Figure FDA0003549067280000021
所述流动相A：含氟化铵水溶液；
所述流动相B：含甲醇溶液。
7.根据权利要求6所述的一种测定检测血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述质谱条件为：多反应监测参数如下：
Figure FDA0003549067280000022
扫描模式：多反应离子监测；电离模式：正、负离子模式；正离子毛细管电压：3.0kV，负离子毛细管电压：-2.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂气流速：800L/Hr。
8.一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分：
校准品溶液；质控品溶液；内标准品溶液；替代基质；活化剂；缓冲液；萃取剂；流动相。
9.根据权利要求8所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，其特征在于：
校准溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；
质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL、DHEA的浓度为54250ng/mL、DHEAS的浓度为5042500ng/mL；
内标准品溶液分别为ASD-d7、DHEA-d6和DHEAS-d6溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
10.根据权利要求8所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，其特征在于：所述萃取剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正己烷、二氯甲烷中的一种或几种。
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