CN110208393A - 一种检测血清中5种雄激素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测血清中5种雄激素的方法，包括：将待测血清样品与内标溶液混合，采用混合提取溶剂，通过液‑液萃取前处理得到检测液，采用超高效液相色谱‑串联质谱技术对所述检测液进行检测；超高效液相色谱条件：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液；质谱条件：正离子模式，采用多反应监测的质谱扫描模式；该5种雄激素为脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮。本发明的方法同时检测5种雄激素的检测时间仅5分钟，检测通量大；操作简便，耗时少；特异性强，灵敏度高，精密度高，检测限低，检测范围广，实际应用前景广阔。

Description

一种检测血清中5种雄激素的方法

技术领域

本发明涉及医疗分析检测技术领域，更具体地，涉及一种检测血清中5种雄激素的方法。

背景技术

雄激素是一类重要的类固醇激素，雄性激素又称男性激素，是维持正常性欲及生殖功能的激素。雄性激素能够调节人体脂肪组织的分布和组成百分比，抑制体内脂肪的增加或增多。低雄性激素水平会造成肥胖、腹部脂肪堆积，其他代谢疾病也很可能如影随形。因此，雄性激素升高或降低与生长发育、多种临床疾病息息相关，如性早熟、多囊卵巢高泌乳素血症、先天性肾上腺皮质增生症、Cushing综合症、分泌雄激素的肿瘤及甲状腺疾病等。

雄性激素能促进雄性器官的生长、精子发生和雄性第二性征的发育，促进男性副性征如胡须、阴毛的出现和维持男性性欲等作用。另外它对全身代谢也起一定的调节作用，雄性激素有强大的促进蛋白质合成使机体呈氮正平衡的作用，这在儿童表现尤为突出，如促进骨胳肌发育、促进骨胳中钙盐沉着，使骨胳增厚生长，并有增加基础代谢、刺激红细胞生成等作用。雄性激素可促进RNA聚合酶和氨基酰转移酶，还能促进糖酵解中的己糖激酶、磷酸果糖激酶，也促进线粒体的细胞呼吸酶类，从而供应细胞合成代谢所需要的能量。

目前临床上生化检测雄激素一般采用放射免疫分析法或化学发光法普遍存在交叉反应性强，特异性差，灵敏度低，准确度低等问题，无法准确获得一些儿童、老人及女性体内低浓度雄激素含量。雄激素潜在的结构及其高度相似性，导致分离困难，离子化效率低，使其在常规条件下难以准确检测。现有技术中，尚未见到有关能同时有效且准确地检测出血清中脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮五种雄激素的方法，亟需在提取方法、分离方法及质谱检测方法上进行改进。

上述5种雄激素的信息表如下表1所示：

表1 5种雄激素信息表

其中，脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)由肾上腺皮质网状带中的细胞色素P450c17为主酶催化胆固醇合成；女性的DHEA全部由肾上腺皮质分泌，但男性的DHEA约5-30％由睾丸产生。DHEA作为甾体激素前体，对合理控制雄激素和雌激素的平衡起到至关重要的作用。因其能根据受体的性别来自动调节雄雌激素达到最佳状态的特点被称为“性黄金”。其临床检测值对于小儿性发育水平的评估具有显著的参考价值。

睾酮(Testosterone)又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种类固醇激素，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮。对身体的肌肉、骨骼、心血管系统等有积极的作用。

雄烯二酮(androstenedione)既表现出雄激素的性质，也具备睾酮的雌激素特性。

双氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)可由睾丸直接产生，也可以由周围组织将雄激素和雌激素作为前体物质转化而来。其作用是刺激生殖器官的发育,促进男性第二性征出现并维持其正常形态。

雄酮(Androstrone)是从精巢或尿中提取出的具有雄性激素作用的一种甾类化合物。

它们都是临床生化分析的重要检测激素，它们的升高或减少与多毛症，先天性睾丸发育不全(Klinefelter综合征)、多囊卵巢综合征、不完全假两性畸形、小儿性发育障碍、男性性功能减退、男性发育延迟等疾病有关。

在现有技术中，可以使用液-质联用方法检测雄激素，可对待测激素进行分离富集，降低基质干扰，提高灵敏度。通常采用衍生化耗时长，成本高，副反应多。另外也有学者用大气压光离子化(APPI)离子源，但这种模式一般都需要使用甲苯，其毒性太大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测血清中5种雄激素的方法，该方法具有前处理简单，检测速度快，灵敏度高，精确度高，通量大可批量检测的优点。

本发明采用如下技术方案：

一种检测血清中5种雄激素的方法，其特征在于，

所述雄激素为脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮；

具体包括如下步骤：

S1、将待测血清样品与内标溶液混合，通过液-液萃取前处理得到检测液；

S2、采用超高效液相色谱-串联质谱技术结合同位素稀释内标法对所述检测液进行检测；

所述内标溶液为含睾酮-D₃和脱氢表雄酮-D₆同位素内标物的甲醇溶液；

所述超高效液相色谱条件为：

流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液；

流动相B为0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液；

流动相梯度洗脱参数为：

所述质谱条件为：

模式为正离子模式，采用多反应监测的质谱扫描模式。

其中，流动相A和流动相B的比例均为体积比。

本发明通过大量的研究得出，在上述流动相梯度洗脱参数下，可以在短时间内非常有效且准确地测定出5种雄激素，灵敏度高。

在本发明的超高效液相色谱-串联质谱技术中超高效液相色谱可以使用本领域中常用的色谱柱，为了提高分离效果和分离度，优选使用型号为Shim-pack GIST C5(2μm，100*2.1mm)的色谱柱。

在本发明一个优选方案中，为了使检测结果更加准确，用时更短，所述超高效液相色谱-串联质谱技术采用三重四极杆质谱仪，所述质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为1.5-3 L/min，干燥气流量为3-8L/min，加热气流量为8-15 L/min，接口温度150-250℃，DL温度80-125℃，加热块温度260-350℃；

质谱检测参数为：

在本发明一个优选方案中，所述流动相梯度洗脱参数为：

其中，所述流动相的流速优选为0.4ml/min，色谱柱的柱温优选为40℃。

其中，为了进一步提高灵敏度，优选地，所述加热气流量为8 L/min，接口温度200℃，DL温度100℃，加热块温度300℃。

在本发明中，优选使用甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶液，进行液-液萃取前处理。

在本发明一个优选方案中，为了提高稳定性，准确度和灵敏度以及分离效率，所述液-液萃取的前处理具体包括：

向待测血清样品与内标溶液的混合液中加入800-1000μL体积比为1：5的甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶液，震荡后在10000-15000r/min、2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液400-800μL，N₂气吹干，加入80-150μL的50-70％甲醇溶液复溶，混合均匀，在10000-15000r/min、2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液，得到所述检测液。

在本发明中，可以使用本领域中常用的方法来得到各激素的具体浓度值。具体为：

结合步骤S2得到的检测结果和各雄激素的标准工作曲线，得到各雄激素在血清中的含量值。

详细地，所述雄激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，

将已知且不同浓度的脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮的甲醇溶液分别与内标溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准检测液中各雄激素与内标物峰面积比为Y轴，标准检测液中各雄激素浓度为X轴，得到各雄激素的标准工作曲线；所述超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S2中的检测条件。

其中，

上述前处理步骤与在制备检测液的前处理步骤相同；

上述超高效液相色谱-串联质谱技术中所有的参数与测定检测液的相应参数相同；

上述标准待测液是将空白血清基质、混合内标溶液以及不同浓度含有5种激素的标准混合液混合制得。

在本发明中，优选使用胎牛血清为空白血清基质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所提供的方法能同时检测血清中的5种雄激素，耗时只有5分钟，效率远远高于分别检测各个激素含量的方法以及传统的放射免疫分析法(RIA)，大大缩短了检测时间，增大了检测通量，适合大批量样品的检测，具有较高的应用价值；

(2)本发明所提供的方法通过液-液萃取，同时结合特定体积比的甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶液进行萃取，分离富集待测雄激素组分，使得检测结果稳定性大大提高，与其他激素检测前处理方法相比，该方法操作简便，耗时少；

(3)本发明所提供的方法使用高液相色谱-质谱串联检测技术，特异性强，选择性好，灵敏度高且无交叉污染，该方法的检测限低，检测范围广，精密度好，能准确定量体内低浓度的激素，可以真实反应人体内激素的水平，适用于临床医疗的生化检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中血清样品中5种雄激素的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术检测5种雄激素的方法，包括以下步骤：

1、材料

方法学研究的实验样本来自于武汉康圣达医学检验所有限公司的2015年6月体检的血清样本。

2、仪器与试剂耗材

仪器：岛津8050三重四极杆质谱仪，岛津30A超高效液相色谱仪，超纯水仪(Millipore超纯水机)，高速冷冻离心机(GL-20M高速冷冻离心机)，涡旋混匀仪(美国SCILOGEX公司)，电子分析天平(FA1004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，GM-12水浴氮吹仪(北京成萌伟业科技有限公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司，北京)，容量瓶，EP管。

试剂耗材：色谱柱为Shim-pack GIST C5(2um，100*2.1mm)，色谱纯甲醇(Sigma-Aldrich公司)，甲基叔丁基醚(阿拉丁试剂有限公司，中国)，乙酸(国药集团化学试剂有限公司)。

标准品和同位素内标物：睾酮、脱氢表雄酮、4-雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮标准品，睾酮-D₃和脱氢表雄酮-D₆内标均购自于sigma-aldrich公司。

3、方法

(1)色谱条件：

色谱柱为Shim-pack GIST C5(2um，100*2.1mm)，流动相A为0.1％甲酸-水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸甲醇溶液，流速为0.2-0.4ml/min，柱温为40℃；

流动相梯度洗脱参数为：

(2)质谱条件：

采用正离子离子化模式，多反应监测的质谱扫描模式，正离子模式，采用多反应监测的质谱扫描模式，电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为1.5 L/min，干燥气流量为3 L/min，加热气流量为10 L/min，接口温度200℃，DL温度100℃，加热块温度300℃；

质谱检测参数为：

(3)混合标准溶液配制：

分别准确称取5mg上述5种激素的标准品分别加入5ml甲醇完全溶解，得到浓度为1×10^-4g/ml的标准品母液，将其混合后接着用甲醇稀释成不同浓度的混合标准溶液。

(4)混合内标溶液配制：

分别准确称取5mg氘代同位素标品睾酮-D₃和脱氢表雄酮-D₆，分别加入5ml甲醇完全溶解，得到浓度为1×10^-4g/ml的2种内标品母液，将其接着用甲醇稀释成所需浓度的混合内标溶液。

(5)标准待测液配制：

取一定量胎牛血清，分别加入内标溶液和不同浓度的混合标准溶液，得到不同浓度的标准待测液。

(6)检测液配制：

取一定量待测血清样品，加入混合内标溶液，得到检测液。

(7)样品前处理：

向标准待测液和检测液中分别进行前处理：向标准待测液和检测液中分别加入1000μL体积比为1：5的甲醇与甲基叔丁基醚混合溶液，震荡，4℃下15000r/min冷冻离心5min，取上层清液800μL，用N₂吹干，加入150μL的70％甲醇溶液复溶，涡旋混合器上混合20秒，4℃下15000r/min冷冻离心5min，吸取100μL上层清液于超高效液相进样瓶，上机检测。

4、检测结果

结果如图1所示，采用同位素内标定量法，以标准物与内标物峰面积比为Y轴，标准物浓度为X轴，建立标准工作曲线。

所得到的5种雄激素的线性方程和检测液中的浓度计算结果如下表2所示。

表2 5种雄激素的线性方程和检测液中的浓度计算结果

具体检测结果如图1所示，图1中各数字所代表的组分为：1为雄烯二酮，2为睾酮，3为脱氢表雄酮，4为双氢睾酮，5为雄酮。5种雄激素全部在5分钟内完成检测，所测得准确度为≥98.5％。

实施例2

本实施例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术检测5种雄激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：

流动相梯度洗脱参数为：

5种雄激素在6分钟内完成检测，所测得准确度和灵敏度与实施例1接近。

对比例1

本对比例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测5种雄激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：

流动相梯度洗脱参数为：

对比例1与实施例1相比，灵敏度与准确度均有所下降，灵敏度(依据最低检测定量限)减小了20％，准确度降低3.3％。

对比例2

本对比例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测5种雄激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：

质谱检测参数为：

对比例2与实施例1相比，灵敏度与准确度均有所下降，灵敏度(依据最低检测定量限)减小了35％，准确度降低4.2％。

对比例3

本实施例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术检测5种雄激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：所述前处理为采用体积比为1：1的甲醇和甲基叔丁基醚的混和溶液进行液-液萃取法处理血清样本；

前处理具体包括：向待测血清样品与内标溶液的混合液中加入800-1000μL体积比为1：1的甲醇和甲基叔丁基醚的混和溶液，震荡后在10000-15000r/min，2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液400-800μL，N₂气吹干，加入80-150μL的50-70％甲醇溶液复溶，混合均匀，在10000-15000r/min、2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液，得到所述检测液进行超高效液相色谱-串联质谱检测。

所得结果显示提取效率较实施例1降低32.1％，检测灵敏度亦随之降低。

实验例1

对实施例1中5种雄激素的检测方法进行方法学验证实验。

1、精密度实验

取实际血清样本，分别加入低中高三个水平的质控品，进行精密度实验，每个浓度检测5次，计算检测结果的平均值以及相对标准偏差(RSD％)。方法学验证实验数据分别如表3-7所示。

表3脱氢表雄酮精密度数据实验(单位：ng/mL)

表4睾酮精密度数据实验(单位：ng/mL)

表5雄烯二酮精密度数据实验(单位：ng/mL)

表6双氢睾酮精密度数据实验(单位：ng/mL)

表7雄酮精密度数据实验(单位：ng/mL)

2、加标回收率

制备一批混合血清样本，测得基础浓度，分别加入低、中和高三个水平的样本，进行加标回收率实验，其中每个浓度检测3次。

表8各激素回收率汇总表(单位：ng/mL)

本发明采用操作简便的液-液萃取的前处理方法，利用液相色谱-串联质谱技术快速准确检测血清中雄激素，采用同位素内标定量可以极大地消除基质干扰，使结果更加准确。该方法可以大大改善传统化学发光(CLIA)或放射免疫分析法(RIA)中交叉反应性强，特异性差，灵敏度低，准确度低等问题；且该发明的方法检测速度快，通量大可节省时间、批量检测。

上述的检验结果表明，本发明的同时检测血清中5中雄激素的检测方法低浓度下精密度≤20％，中浓度和高浓度≤15％，说明该方法精密度良好。加标回收率在75-120％之间，满足FDA对于生物样本的回收率的要求。

综上所述，该方法精密度好，特异性强、准确度高，检测限低且前处理简单，5min内即可完成检测，大大节省了时间，满足临床检测的要求。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测血清中5种雄激素的方法，其特征在于，

所述雄激素为脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮；

具体包括如下步骤：

S1、将待测血清样品与内标溶液混合，通过液-液萃取前处理得到检测液；

S2、采用超高效液相色谱-串联质谱技术结合同位素稀释内标法对所述检测液进行定量检测；

所述内标溶液为含睾酮-D₃和脱氢表雄酮-D₆同位素内标物的甲醇溶液；

所述超高效液相色谱条件为：

流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液；

流动相B为0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液；

流动相梯度洗脱参数为：

所述质谱条件为：

离子化模式为正离子模式，检测采用多反应监测的质谱扫描模式。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为1.5-3L/min，干燥气流量为3-8L/min，加热气流量为8-15L/min，接口温度150-250℃，DL温度80-125℃，加热块温度260-350℃；

质谱检测参数为：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相梯度洗脱参数为：

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.4ml/min，色谱柱的柱温为40℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加热气流量为8L/min，接口温度200℃，DL温度100℃，加热块温度300℃。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述前处理为使用甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶液进行液-液萃取前处理；

优选地，所述前处理具体包括：向待测血清样品与内标溶液的混合液中加入800-1000μL体积比为1：5的甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶液，震荡后在10000-15000r/min，2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液400-800μL，N₂气吹干，加入80-150μL的50-70％甲醇溶液复溶，混合均匀，在10000-15000r/min、2-5℃下冷冻离心2-6min，取上层清液，得到所述检测液。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括，结合步骤S2得到的检测结果和各雄激素的标准工作曲线，得到各雄激素在血清中的含量值。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述雄激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括：

将已知且不同浓度的脱氢表雄酮、睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮和雄酮的甲醇溶液分别与内标溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准检测液中各雄激素与内标物峰面积比为Y轴，标准检测液中各雄激素浓度为X轴，得到各雄激素的标准工作曲线；所述超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S2中的检测条件。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述空白血清基质为胎牛血清。