CN109828073A - 唾液中几种类固醇激素的定性定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人体唾液中几种类固醇激素的定性定量检测方法，具体涉及一种唾液中8种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的激素为17‑羟基孕酮、孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮。该检测方法将人体唾液样本冷冻处理后经蛋白沉淀，超声提取并过滤，随后与内标液混合，反相SPE柱纯化和目标产物的化学衍生。保证了唾液中这几种目标激素的充分溶出，排除唾液中杂质的干扰，确保了检测结果的准确性和稳定性。随后，采用液相色谱分离与质谱离子对检测联用的方法对这8种激素进行同步定性和定量分析。该方法适用于人体唾液中结构类似、化学物理性质接近的激素分子的同步批量检测，具有灵敏度高、精密度高、重复性好、检测速度快等优点。充分满足了临床检验的需要，具有较高的临床应用价值。

Description

唾液中几种类固醇激素的定性定量检测方法

技术领域

本发明涉及唾液样本检测技术领域，尤其是涉及一种人体唾液中8种类固醇激素的检测方法。

背景技术

人体内的类固醇激素按药理作用分为肾上腺皮质类固醇激素和性激素两大类。而类固醇激素都是由胆固醇激素为母体合成的，是一类脂溶性激素，它们在结构上都是环戊烷多氢菲衍生物。这些激素的功能虽然很不相同，但它们在结构上却很相似。因为它们都是从胆固醇衍生而来，而且在体内在相应酶的作用下可以相互转变，达到体内类固醇激素代谢通路的平衡状态。胆固醇首先代谢成孕烯醇酮，然后在酶的作用下，一部分转化为孕酮，产生孕激素和下游的盐皮质激素；另一部分转化为17-羟基孕酮和脱氢表雄酮，再分别转化为糖皮质激素以及雄激素。雄激素最后再代谢生成雌激素。因此，体内的类固醇激素代谢是一个完整的通路，各种激素之间存在微妙的平衡关系。某些代谢通路的阻碍或缺失必将影响其它代谢通路的平衡，从而造成体内其它激素水平的变化，引起代谢相关的疾病发生。无论是某些通路上酶的缺失或活性降低，还是外源性激素的介入，都会不可避免的造成代谢通路的失衡。因此，准确的监控体内各类激素的水平变化以及相互之间的比例关系对于这些疾病的预防和风险评估起到至关重要的作用，同时也可以用来监控这些疾病的临床治疗效果和预后恢复评估。

先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一组由肾上腺皮质类固醇合成通路各阶段各类催化酶的缺陷，引起的以皮质类固醇合成障碍为主的常染色体隐性遗传性疾病。患者需要通过终身激素治疗的方法对疾病进行控制。而激素替代治疗的方法必须是个性化，同时必须随时密切监控体内激素及其代谢的反馈。临床上一般通过内分泌激素监测以及体格生长指标、青春发育进程和骨龄监测作为近期的判断指标，两者需有机结合，综合判断。但空腹采血取样检测不便于多点监控，病人依从性差。同时，血样检测各激素测值尚无单个的"金标准"切割值，各激素参数需结合临床指标调节剂量。而唾液中各种类固醇激素都是以活性物质的形式存在，客观反应了体内真实的激素代谢状况。同时，由于唾液取样为无创取样，方便快捷，不需要专业医护人员的陪同，病人就可以自行多次取样。因此，通过唾液取样的方式对患者体内相关激素含量进行跟踪监测，可以建立个性化的新型激素治疗方案及安全性评价体系。通过唾液检测各类相关激素的水平及比例，在临床上可以指导这类疾病的个性化治疗，也为这类疾病的长期安全性评估提供重要的依据。

因此，本研究开发一种唾液中多种类固醇激素的检测方法。该方法具有检测灵敏度高、重复性好、检测速度快，检测批量大的优点，能高效的对多种激素进行精确的定量检测，具有良好的科研和临床应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱联用串联质谱技术检测人体唾液中多种类固醇激素产物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

1、一种人体唾液中几种类固醇激素的检测方法，其特征在于，将人体唾液样本冷冻处理后经蛋白沉淀，超声提取并过滤，随后与内标液混合，反相SPE柱纯化和目标产物的化学衍生得到待测样本；

2、将上述待测样本通过液相色谱和质谱联用检测，同步对几种激素进行定性和定量的批量检测；

进一步的，上述步骤1中样本冷冻时间为>24小时、温度为-20℃；

进一步的，上述步骤1中蛋白沉淀所用的有机溶剂包括甲醇、乙腈或丙酮，优选的有机溶剂为甲醇，温度为4℃，时间为>10分钟。更进一步的，所述的有机溶剂为甲醇；

进一步的，上述步骤1中反相SPE的洗脱溶剂为甲醇或丙酮；

进一步的，上述步骤1中化学衍生法使用的化学衍生试剂为乙酰肼三甲基氯化铵或吡啶酰氯、羟胺、甲基羟胺、邻羟基胺等肟化衍生试剂中的一种；

更进一步的，所述的化学衍生法使用的试剂为乙酰肼三甲基氯化铵；

更进一步的，所述的化学衍生法反应时间为5-30分钟，反应温度为50-70℃；

进一步的，上述步骤2中具体包括以下步骤：

步骤1)称取8种激素的标准品，用甲醇溶解得到不同浓度的标准液；

步骤2)称取内标样品定容为内标液，随后加入步骤1)中的标准液，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤3)将步骤2)中得到的待测标准液和权利要求1中得到的待测样本通过液质联用检测，经过标准曲线计算得到唾液中8种激素的种类和含量。

进一步的，所述激素包括17-羟基孕酮、孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮；

进一步的，上述步骤液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相A为水，0.01％TFA，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，0.01％TFA，乙腈与甲醇的质量比为9-1:1-9。流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0-1min,A:100-80％,B:0-20％；

1.1-4min,A:80-20％,B:20-80％；

4.1-5min,A:20-0％,B:80-100％；

5.1-6min,A:0-80％,B:100-20％；

6.1min,A:80-100％,B:20-0％。

更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-100mm*1.8-3mm,1.8-3μm。

进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM扫描，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

进一步的，在电喷雾正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：脱氢表雄酮(m/z 402.4–343.2)；17-羟基孕酮(m/z 444.5–385.3)、孕酮(m/z 428.5–369.3)、雄烯二酮(m/z 440.4—381.2)、睾酮(m/z 402.4–343.2)、皮质醇(m/z476.5–417.3)、皮质酮(m/z 474.5–415.3)、醛固酮(m/z 474.5–415.3)。

与已有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明提供的人体唾液样本冷冻处理后经蛋白沉淀，超声提取并过滤，随后与内标液混合，反相SPE柱纯化和目标产物的化学衍生后进行液质联用的分析。冷冻及蛋白沉淀处理，反相SPE柱的选择、化学衍生处理的条件优化等可以使得目标激素成分充分溶出，大大降低样本中其它杂质的干扰，并可以提高检测的灵敏度和效率，从而可以真实的反应待测样品中目标激素的含量，使得检测结果的准确性、重复性和稳定性大大提高；

2、本发明提供的人体唾液激素的检测方法适用于目标激素的同步批量检测。这些激素分子结构非常相近，化学物理性质也很接近，同时进行快速分离鉴定具有很大的技术难度。本发明提供的液相分离及质谱检测的方法可以高效准确的对所有目标产物进行定性定量分析，满足大批量实验室检测的需要，具有较高的应用价值；

3、本发明提供的人体唾液激素的检测方法具有灵敏度高、精确度高、重复性好以及检测速度快的优点，适用于临床检测，为临床上评估类固醇催化酶缺陷引起的疾病，如先天性肾上腺皮质增生症的精准治疗和用药安全性水平提供了可靠的检测方法。

附图说明

图1：唾液中几种类固醇激素标准品总离子流图(从上到下依次为：醛固酮、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、DHEA、皮质酮、皮质醇)。

图2：人唾液中几种类固醇激素检测结果总离子流图(A：女性检测结图；B：男性检测结果图)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明保护的范围。

实施例1。

1.材料。

方法学研究实验的样本来自于四川省成都市妇女儿童中心医院内分泌科2019年2月至3月部分就诊患者的唾液样本。

仪器：API 4000三重四级杆质谱仪(Applied Biosystem公司)；Agilent液相色谱系统(配自动进样器)；十万分之一天平；色谱柱(C18)；氮吹仪；高速台式冷冻离心机；冻干机；固相萃取柱；可调移液器；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

试剂耗材：色谱纯甲醇；乙腈；甲酸；乙酸铵；抗坏血酸；乙酸钠；碳酸氢钠；氢氧化钠；丙酮；乙酰肼三甲基氯化铵；冰醋酸；氢氧化钠；活性炭；磷酸。

标准品：脱氢表雄酮、17-羟基孕酮、孕酮、雄烯二酮、睾酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮购于Sigma-Aldrich；8种待测物质的同位素内标购于CDN Isolopes。

2.方法。

色谱条件：流动相A：水，0.01％TFA；流动相B：10％v/v乙腈甲醇的混合溶液，0.01％TFA。采用梯度洗脱方式。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾电离正离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kV；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。监测的目标物如下：脱氢表雄酮(m/z 402.4–343.2)；17-羟基孕酮(m/z 444.5–385.3)、孕酮(m/z 428.5–369.3)、雄烯二酮(m/z 440.4—381.2)、睾酮(m/z 402.4–343.2)、皮质醇(m/z 476.5–417.3)、皮质酮(m/z474.5–415.3)、醛固酮(m/z 474.5–415.3)。分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行系统优化，以达到最佳的稳定性和灵敏度。

标准品配制：分别准确称取标准品各1mg，分别置于10mL的容量瓶中，加入含0.1％抗坏血酸的甲醇溶液，配制成浓度分别为100μg/mL的标准品母液；分别从以上标准品母液中移取用溶液定容，得到浓度为1μg/mL，然后用甲醇将浓度由逐级稀释；接着分别取浓度为加入到离心管中，再加入去离子水定容到，配制成混合标准液。

称取内标品，加入完全溶解得到浓度为1mg/mL的内标溶液。然后用甲醇将内标溶液的浓度稀释至50ng/mL，配制得到内标工作溶液。

样品处理。

1mL唾液样本收集在10mL的冷凝管中，放置在-20℃冰箱中冷冻。24小时后取出室温下解冻。随后加入5mL甲醇，摇匀后放置在4℃冰箱中10分钟。取出冷凝管，离心过滤，去除沉淀的蛋白，取上清液超声提取并过滤。氮气吹干后溶解在0.1％磷酸溶液中，随后与内标液混合，上样加到反相SPE柱上洗涤。随后用2mL的甲醇溶液从SPE柱上洗脱，加入1％的甲酸溶液调整pH为2-3。在60℃的反应温度下，加入乙酰肼三甲基氯化铵溶液进行衍生反应10分钟，0.22μm滤膜过滤后进样。

3.方法建立与优化。

方法验证。

专属性。

取0.5ml空白基质2份，分2组处理：

1.保留空白；

2.加入10μl含有8个激素标准品的混标工作液(4ng/ml),以及10μl内标溶液(50ng/ml)2组样品涡旋混匀10s，放置30min。之后进行SPE萃取，氮吹和衍生。滤膜过滤后进样分析。

比较两组色谱图，分析唾液中内源性物质对被测化合物和内标的干扰。

专属性验证结果表明在标准品出峰位置，空白基质样品均未出现明显干扰峰。8种类固醇激素的标准品和唾液样品的峰型对称，在低浓度时基本没有杂峰干扰。可参见附图1。

基质标准曲线。

取系列浓度基质标准曲线样品，从低浓度到高浓度连续进样，每个浓度2次进样进行分析。以被测物EM浓度为横坐标，被测物与内标物峰面积比值为纵坐标，采用线性回归，得到回归方程和相关系数。

8种激素的标准品总离子流图图，见附图1。

校准曲线：采用内标定量法，利用软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算唾液中待测物的浓度。各个目标产物在各自的浓度范围内(20ng/ml-0.01ng/ml)的线性拟合方程线性良好，拟合系数大于0.99，满足定量的要求。

最低定量限。

取空白基质0.5ml，加入一定量混标工作液(0.01ng/ml)和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析，同一浓度平行处理6份。

代入基质标准曲线，计算浓度的精密度小于20％，回收率在100±20％之间时，该浓度为最低定量限。

某一浓度的信噪比大于3，定为最低检出限。

实验结果显示，回收率在87％-109％之间，精密度在3％-12％之间，0.01ng/ml为最低定量限。

基质效应。

分2组处理样品：

1.取甲醇0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析；

2.取空白基质0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析。每个浓度选取3份不同来源空白基质。

计算：将第2组得到的标准品峰面积分别除以第1组所得的相应标准品峰面积(×100％)，即得各标准品的基质效应。

要求基质效应在85％-115％，且基质加标和甲醇溶液加标均应满足RSD＜15％。

实验结果表明，8个类固醇激素的基质效应范围为88％-114％，能够满足方法验证要求。

准确度和精密度。

选质控高中低和LLOQ浓度进行准确度和精密度考察。样品采用空白基质配制。

同一天每一样品连续分析6次，测定准确度和日内精密度。

4个浓度样品每日连续进样2次，每次测完后放置于4℃冰箱中保存，连续3天测定，分析日间精密度。R标曲需同时进行测定。

精密度的RSD＜15％，准确度在100±15％范围内。LLOQ的准确度放宽到±20％，RSD≤20％。

实验结果表明，8个类固醇激素的准确度在89％-113％之间，批内精密度在5％-9％之间，日间精密度在8％-14％之间。最低定量限准确度在82％-102％之间，批内精密度在9％-13％之间，日间精密度＜18％。

稳定性。

①日内稳定性。

室温放置24小时稳定性。

高中低浓度质控样品，前处理后，室温下放置24小时，0、4、8、24小时分别进样测定，每样每次测定2针。计算测得浓度的回收率和RSD值。

放置时间应超过单个批次样品分析所需时间；要求RSD＜15％，准确度在100±15％范围内。

实验结果表明，被测的8种类固醇激素室温放置24小时是稳定的。4次测定的准确度范围为88％-113％，RSD在6％-9％之间。

②日间稳定性。

高中低浓度质控样品，前处理后，日内稳定性样品在完成24小时测定后，转入4℃放置，24小时后再取出放入室温，按①中方法重新测定。每天控制在同一时间，保证相同的时间间隔下，连续考察3天内的日间稳定性。

计算测得浓度的回收率和RSD值；要求RSD＜15％，准确度在100±15％范围内。

实验结果表明，被测的8种类固醇激素按以上方法放置4天是稳定的。4次测定的准确度范围为85％-108％，RSD在6％-11％之间。

实施例2。

研究实验的样本来自于四川省华西公共卫生学院附属医院2019年5月至6月部分志愿者的唾液样本。

其中，样品编号1-6；7-9为男性样本。

本实验中试剂和仪器设备同实施例1。

本实验中色谱条件和质谱检测条件同实施例1。

唾液样品检测总离子图，在低浓度时基本没有杂峰干扰，见附图2。

测定结果及数据统计：

Claims (10)

1.一种人体唾液中几种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

1)将人体唾液样本冷冻处理后经蛋白沉淀，超声提取并过滤，随后与内标液混合，反相SPE柱纯化和目标产物的化学衍生得到待测样本；

2)将上述待测样本通过液相色谱和质谱联用检测，同步对几种激素进行定性和定量的批量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中样本冷冻时间为>24小时、温度为-20℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中蛋白沉淀所用的有机溶剂包括甲醇、乙腈或丙酮，优选的有机溶剂为甲醇，温度为4℃，时间为>10分钟。

4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中反相SPE的洗脱溶剂为甲醇或丙酮。

5.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中化学衍生的试剂为乙酰肼三甲基氯化铵或吡啶酰氯、羟胺、甲基羟胺、邻羟基胺等肟化衍生试剂中的一种；所述的化学衍生法反应时间为5-30分钟，反应温度为50-70℃。

6.根据权利要求1-5项任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤具体包括以下步骤：步骤1)称取8种激素的标准品，用甲醇溶解得到不同浓度的标准液；

步骤2)称取内标样品定容为内标液，随后加入步骤1)中的标准液，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤3)将步骤2)中得到的待测标准液和权利要求1中得到的待测样本通过液质联用检测，经过标准曲线计算得到唾液中8种激素的种类和含量。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相A为水，0.01％TFA，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，0.01％TFA，乙腈与甲醇的质量比为9-1:1-9；

流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0-1min,A:100-80％,B:0-20％；

1.1-4min,A:80-20％,B:20-80％；

4.1-5min,A:20-0％,B:80-100％；

5.1-6min,A:0-80％,B:100-20％；

6.1min,A:80-100％,B:20-0％。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-100mm*1.8-3mm,1.8-3μm。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液质联用检测的质谱条件为：采用电喷雾(ESI)离子源，正离子MRM扫描方式，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

10.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述包括人体唾液中8种类固醇激素；

采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：脱氢表雄酮(m/z402.4–343.2)；17-羟基孕酮(m/z444.5–385.3)、孕酮(m/z428.5–369.3)、雄烯二酮(m/z440.4—381.2)、睾酮(m/z402.4–343.2)、皮质醇(m/z476.5–417.3)、皮质酮(m/z474.5–415.3)、醛固酮(m/z474.5–415.3)。