CN107462653B - 干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的7种类固醇激素分别为：17‑羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11‑脱氧可的松和醛固酮。该方法检测经过预处理的干血斑中上述7种类固醇激素，样品经甲醇沉淀蛋白，并超声提取，提取后过滤净化，以甲醇和水作为流动相，经C18色谱柱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，内标定量法分析。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确性好，分析时间短，精密度及加标回收率满足检测要求。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来。人体内的类固醇激素主要包括性激素和肾上腺皮质激素。类固醇激素在人体中对于新陈代谢、维持内环境稳定、生长、发育及生殖行为等方面起着重要的调节作用。
人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等疾病息息相关。其中，先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia,CAH）是一组由于类固醇激素合成代谢过程中，某种酶的缺陷导致激素合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传疾病。在类固醇合成代谢中，游离胆固醇经过5种酶的催化，最终合成皮质醇、醛固酮、雄激素三大类固醇激素。不同的酶缺陷导致终产物合成不足或缺乏，导致不同的生化和临床表现，即使同一种酶缺陷，由于酶缺陷的程度不同，临床表现严重程度不一。目前，CAH的筛查主要是通过17-羟基孕酮的检测，针对21-羟化酶缺乏症进行筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确性高、灵敏度高的干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法可同时对类固醇代谢通路中17-羟基孕酮，雄烯二酮，11-脱氧可的松，皮质醇，孕酮，双氢睾酮以及醛固酮7种激素进行定量检测，通过检测干血滤纸片中7种类固醇激素的水平及相关的比值，为一次筛查多种CAH的类型提供技术基础，具有潜在临床应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的7种类固醇激素分别为：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮；所述的检测方法包括如下步骤：
(1) 血斑样本前处理：用3/16打孔器打4个血斑到12*75mm的玻璃试管中，加入含有4种内标物质的内标萃取液200μL，超声60min提取，置于高速离心机5000r/min涡旋15min，得到提取液，将提取液转入带有滤膜的96孔板中，离心后置于氮气吹仪中55℃吹干、然后加入100μL 50%的甲醇溶液复溶，覆盖铝箔；放入涡旋振荡器中以750rpm的速度涡旋震荡15min，进行上机检测；
（2）采用液相色谱串联质谱法检测经上述步骤处理的样本，利用液相色谱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，再采用同位素内标定量法分析,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑中7种类固醇激素的含量，得到检测结果；
所述液相色谱条件如下：
流动相A为水溶液，流动相B为纯甲醇溶液，柱温40℃，检测时间10min，
采用梯度洗脱方式，程序为0.01-0.5 min 45% B，0.5-2.0min 45%-55%B，2.0-4.0min 55%-90% B，4.0-6.0 min 90% B，6.0-6.1min 90%-45%B；
进样量10μL；流速0.35mL/min；柱温40℃；色谱柱：Shimadzu-Packed XR-ODSⅡ，2mm×75mm×2.2μm；
所述质谱条件如下：电喷雾电离源，多反应监测模式正、负离子模式，电喷雾电压为±5500V，离子源温度为 400℃，各个目标化合物的其它质谱参数锥孔电压DP、碰撞能量CE、碰撞室出口电压CXP如下表1所示：
上述的干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的含有4种内标物质的内标萃取液的制备方法为：分别称取一定量的d8-17-羟基孕酮、d4-皮质醇、d7-醛固酮和移取d3-双氢睾酮的氘代化合物4种内标物质，用甲醇溶解或稀释到1mg/mL，接着取各溶解或稀释后的同位素内标溶液混合配制成每个内标物质浓度都为50ng/mL的内标混合萃取液，即为含有4种内标物质的内标萃取液，所用的萃取液为甲醇。
上述的干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本和需要检测的血斑样本；其中，所述干血斑标准曲线样本按照如下步骤制备得到：
（1）空白全血的制备：采集健康志愿者的血样，采集后置于高速冷冻离心机3000r/min离心15min，离心分离血清和红细胞；在红细胞中加入等体积的0.9%氯化钠溶液进行洗涤，反复旋转试管进行充分清洗，然后再置于高速冷冻离心机上3000r/min离心15min，如此进行四次清洗，然后将上层的溶液去掉；在红细胞中加入与红细胞体积比为55:45的经过活性炭洗涤的空白血清，即制成人造空白全血；
（2）标准溶液的配制： 准确称取7种类固醇激素标准物质，用甲醇配制成1mg/mL的标准储备溶液，使用时再用甲醇稀释到所用浓度，置于-20℃的冰箱中保存；
（3）标准干血斑的制备：用甲醇稀释的一系列浓度的标准溶液加入到空白全血中，制成0.5、1、2、10、50、100ng/mL的标准系溶液，用移液器分别吸取50μL全血标准样品滴于干燥洁净的滤纸片的采样圈的中心位置，然后将滤纸片正面朝上置于血片晾干架上，室温条件下自然晾干，晾干后置于密封的塑料袋中，放入-20℃冰箱中储存备用。
本发明的有益效果为：
1、本发明干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法检测的样本是干血片样本，所需样本量少，样本容易采集，特别对于新生儿和儿童创伤性小，而且便于保存和运输。
2、本发明干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法灵敏度高、特异性强、准确性好，分析时间短，精密度及加标回收率满足检测要求，该方法可同时对类固醇代谢通路中17-羟基孕酮，雄烯二酮，11-脱氧可的松，皮质醇，孕酮，双氢睾酮以及醛固酮7种激素进行定量检测，通过检测干血滤纸片中7种类固醇激素的水平及相关的比值，为一次筛查多种CAH的类型提供技术基础，具有潜在临床应用价值。
附图说明
图1为7种类固醇激素标准物质的总离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法：
一、主要仪器设备：
1、API4500三重四级杆串联质谱仪（美国Applied biosysterm 公司）；
2、LC20ADXR高效液相色谱仪（日本SHIMADZ 公司）；
3、L353R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪仪器设备公司）；
4、TD5A台式离心机（盐城凯特实验仪器公司）；
5、Trinest 孵育振荡器（美国Perking Elmer公司）；
6、JP-080/S超声波清洗器（广州洁盟超声波清洗公司）；
7、MD200-1A氮气吹干仪（杭州奥盛实验设备公司）；
8、Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。
二、主要试剂
1、标准品：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮。
2、内标标准品：d8-17-羟基孕酮、d3-双氢睾酮、d4-皮质醇、d7-醛固酮。
3、其他试剂：甲醇（色谱纯 Fisher公司）、乙腈（色谱纯 Fisher公司）、乙酸乙酯、丙酮（色谱纯Sigma公司）、甲酸（色谱纯 Aladdin公司）所有试剂说明同甲醇。
4、空白全血的制备：为了与所测样本具有尽可能相同的基质需进行空白全血的制备，采集健康志愿者的全血2ml肝素钠抗凝，采集后置于高速离心机3000r/min离心15min，分离血清和红细胞；取出上部血清溶液，在红细胞中加入等体积的0.9%氯化钠溶液进行洗涤，反复旋转，震荡，进行充分清洗，然后再置于高速离心机上3000r/min离心15min，重复进行四次清洗，然后将上层的溶液去掉；吸取沉淀在离心管底部的红细胞，加入与红细胞体积比为55:45的经过活性炭洗涤的空白血清，即制成人造空白全血。
5、标准溶液的配制： 准确称取7种类固醇激素标准物质，用甲醇配制成1mg/mL的标准储备溶液，使用时再用甲醇稀释到所用浓度，置于-20℃的冰箱中保存。
6、标准干血斑的制备：用甲醇稀释的一系列浓度的标准溶液加入到空白全血中，制成0.5、1、2、10、50、100ng/mL的标准系溶液，用移液器分别吸取50μL全血标准样品滴于干燥洁净的903#滤纸片的采样圈的中心位置，然后将滤纸片正面朝上置于血片晾干架上，室温条件下自然晾干，晾干后置于密封的塑料袋中，放入-20℃冰箱中储存备用。
7、含有4种内标物质的内标萃取液的制备：分别称取一定量的d8-17-羟基孕酮、d4-皮质醇、d7-醛固酮和移取d3-双氢睾酮的氘代化合物4种内标物质，用甲醇溶解或稀释到1mg/mL，接着取各溶解或稀释后的同位素内标溶液混合配制成每个内标物质浓度都为50ng/mL的内标混合萃取液，即为含有4种内标物质的内标萃取液，所用的萃取液为甲醇。
三、方法
(1) 血斑样本前处理：用3/16打孔器打4个血斑到12*75mm的玻璃试管中，加入含有4种内标物质的内标萃取液200μL，超声60min提取，置于高速离心机5000r/min涡旋15min，得到提取液，将提取液转入带有滤膜的96孔板中，离心后置于氮气吹仪中55℃吹干、然后加入100μL 50%的甲醇溶液复溶，覆盖铝箔；放入涡旋振荡器中以750rpm的速度涡旋震荡15min，进行上机检测；所述的血斑样本包括干血斑标准曲线样本（即：标准干血斑）和需要检测的血斑样本；
（2）采用液相色谱串联质谱法检测经上述步骤处理的样本，利用液相色谱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，再采用同位素内标定量法分析,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑中7种类固醇激素的含量，得到检测结果；
所述液相色谱条件如下：
流动相A为水溶液，流动相B为纯甲醇溶液，柱温40℃，检测时间10min，
采用梯度洗脱方式，程序为0.01-0.5 min 45% B，0.5-2.0min 45%-55%B，2.0-4.0min 55%-90% B，4.0-6.0 min 90% B，6.0-6.1min 90%-45%B；
进样量10μL；流速0.35mL/min；柱温40℃；色谱柱：Shimadzu-Packed XR-ODSⅡ（2mm×75mm×2.2μm）；
所述质谱条件如下：电喷雾电离源( ESI )，多反应监测模式（MRM）正、负离子模式，电喷雾电压为±5500V，离子源温度为 400℃，各个目标化合物的其它质谱参数锥孔电压DP、碰撞能量CE、碰撞室出口电压CXP如下表1所示：
四、方法验证
1、总离子流色谱图：7种固醇激素的标准品和干血斑样品的峰型比较对称，没有其他杂质干扰,说明在此条件下能够得到良好的检测；图1为7种类固醇激素标准物质的总离子流色谱图。
2、标准曲线：采用同位素内标定量法,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑待测物的浓度。干血斑中7种类固醇激素在1-100ng/mL呈现良好的线性关系（r>0.99）。7种类固醇激素线性方程分别为：
17-羟基孕酮：Y=0.00148X+0.000653；
雄烯二酮：Y=0.0955X+0.0197；
双氢睾酮：Y=0.00159X+0.00178；
孕酮：Y=0.00365X+0.00274；
皮质醇：Y=0.000483X+0.0000228；
11-脱氧可的松：Y=0.00094X+0.000345；
醛固酮：Y=0.00786X+0.00545。
3、精密度和准确度实验：选取低中高溶度的三个样品进行加标回收实验，每个样品连续测定六次计算其平均回收率和批内的相对标准偏差，其平均回收率介于72.6-118.2%之间，相对标准偏差介于1.6-14.4%之间。
五、讨论
本研究建立的高效液相色谱三重四级杆串联质谱测定干血斑中17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮的检测方法。通过对前处理过程和仪器条件的优化，提高了方法的灵敏度，同时该方法操作简单，准确度高以及重现性好同时可以避免荧光免疫法的假阳性，可满足临床实验室对其的检测。
Claims (1)
1.干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述的7种类固醇激素分别为：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮；所述的检测方法包括如下步骤：
(1) 血斑样本前处理：用3/16打孔器打4个血斑到12*75mm的玻璃试管中，加入含有4种内标物质的内标萃取液200μL，超声60min提取，置于高速离心机5000r/min涡旋15min，得到提取液，将提取液转入带有滤膜的96孔板中，离心后置于氮气吹仪中55℃吹干、然后加入100μL 50%的甲醇溶液复溶，覆盖铝箔；放入涡旋振荡器中以750rpm的速度涡旋震荡15min，进行上机检测；
（2）采用液相色谱串联质谱法检测经上述步骤处理的样本，利用液相色谱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，再采用同位素内标定量法分析,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑中7种类固醇激素的含量，得到检测结果；
所述液相色谱条件如下：
流动相A为水溶液，流动相B为纯甲醇溶液，柱温40℃，检测时间10min，
采用梯度洗脱方式，程序为0.01-0.5 min 45% B，0.5-2.0min 45%-55%B，2.0-4.0 min55%-90% B，4.0-6.0 min 90% B，6.0-6.1min 90%-45%B；
进样量10μL；流速0.35mL/min；柱温40℃；色谱柱：Shimadzu-Packed XR-ODSⅡ，2mm×75mm×2.2μm；
所述质谱条件如下：电喷雾电离源，多反应监测模式正、负离子模式，电喷雾电压为±5500V，离子源温度为 400℃，各个目标化合物的其它质谱参数锥孔电压DP、碰撞能量CE、碰撞室出口电压CXP如下表所示：
所述的含有4种内标物质的内标萃取液的制备方法为：分别称取一定量的d8-17-羟基孕酮、d4-皮质醇、d7-醛固酮和移取d3-双氢睾酮的氘代化合物4种内标物质，用甲醇溶解或稀释到1mg/mL，接着取各溶解或稀释后的同位素内标溶液混合配制成每个内标物质浓度都为50ng/mL的内标混合萃取液，即为含有4种内标物质的内标萃取液，所用的萃取液为甲醇；
所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本和需要检测的血斑样本；其中，所述干血斑标准曲线样本按照如下步骤制备得到：
（1）空白全血的制备：采集健康志愿者的血样，采集后置于高速冷冻离心机3000r/min离心15min，离心分离血清和红细胞；在红细胞中加入等体积的0.9%氯化钠溶液进行洗涤，反复旋转试管进行充分清洗，然后再置于高速冷冻离心机上3000r/min离心15min，如此进行四次清洗，然后将上层的溶液去掉；在红细胞中加入与红细胞体积比为55:45的经过活性炭洗涤的空白血清，即制成人造空白全血；
（2）标准溶液的配制： 准确称取7种类固醇激素标准物质，用甲醇配制成1mg/mL的标准储备溶液，使用时再用甲醇稀释到所用浓度，置于-20℃的冰箱中保存；
（3）标准干血斑的制备：用甲醇稀释的一系列浓度的标准溶液加入到空白全血中，制成0.5、1、2、10、50、100ng/mL的标准系溶液，用移液器分别吸取50μL全血标准样品滴于干燥洁净的滤纸片的采样圈的中心位置，然后将滤纸片正面朝上置于血片晾干架上，室温条件下自然晾干，晾干后置于密封的塑料袋中，放入-20℃冰箱中储存备用。
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