CN110824091A - 一种类固醇激素检测方法 - Google Patents

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陈亮
张志栋
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Abstract

本发明公开了一种类固醇激素检测方法，步骤包括：向待测样品中加入内标物；进行衍生化反应；利用色谱串联质谱检测分析物。分析物同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11‑去氧皮质醇、17α‑羟孕酮、17α‑羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮。该方法操作步骤少，检测时间短，能特异灵敏地准确定量分析物。

Description

一种类固醇激素检测方法
技术领域
本发明属于激素检测方法技术领域，具体地指一种类固醇激素检测方法。
背景技术
对于可的松和醛固酮等类固醇激素，无需进行衍生化反应，便可直接通过色谱串联质谱进行定量分析。中国专利CN110187043A公开了“一种同时检测血清中13种甾体激素的方法”，能同时检测孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮、11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮。而雌二醇和雌三醇在生物体内含量较低，不易被分析，很难在检测中准确地定量。因此，检测人员通常会在检测前对雌二醇和雌三醇进行衍生化反应，使雌二醇和雌三醇分别转化为与各自化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。中国专利CN105842379A公开了“一种衍生化测定酚类雌激素的方法”，能够检测17β-雌二醇和雌三醇。
在实际检测时，对同一份样品，往往需要检测多种类固醇激素。现有技术为防止衍生化反应对可的松和醛固酮等类固醇激素产生影响，一般会对样品采用分步式前处理，即在检测前，将样品分成两份，其中一份不进行衍生化反应，直接进行色谱串联质谱分析，定量部分类固醇激素；另一份则进行衍生化反应，再进行色谱串联质谱分析，定量雌二醇和雌三醇。如此检测，不仅操作步骤较多，检测时间较长，且检测时使用的样品量减少，从而使定量结果误差增大。
发明内容
为解决现有技术中需要对样品采用分步式前处理，操作步骤较多，检测时间较长等问题，本发明提供一种类固醇激素检测方法。
本发明采用的技术方案是：一种类固醇激素检测方法，所述检测方法的步骤包括：
1)向待测样品中加入内标物；
2)进行衍生化反应操作；
3)利用色谱串联质谱检测分析物；
所述分析物同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；所述衍生化反应操作使第一类类固醇激素发生衍生化反应；
其中，所述第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；
所述第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮。
所述分析物还同时包括雌酮。
内标物以混合内标溶液的形式加入待测样品中，混合内标溶液的溶剂为甲醇。
在步骤1)加入内标物后，对待测样品进行一次提纯；一次提纯的步骤为：向待测样品中加入萃取剂混匀，再进行离心，取上清液，对取得的上清液进行吹干。
所述萃取剂为叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的混合液，其中，叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为40～60∶800～900∶90～110。
所述衍生化反应操作步骤为：向待测样品中加入40μL～60μL浓度为8mM～12mM的碳酸钠水溶液，加入40μL～60μL浓度为3mg/mL～7mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液；涡旋震荡1min～5min，在温度为55℃～65℃的条件保持3min～7min。
在步骤2)进行衍生化反应操作之后，向待测样品中加入40μL～60μL50％甲醇复溶。
在步骤3)检测分析物之前，对待测样品进行二次提纯；二次提纯的步骤为：离心，取上清液。
色谱条件为：流动相A液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；流动相B液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样10μL。
质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：550℃；离子源气体一：30psi；离子源气体二：30psi；锥孔气：20psi；碰撞气：9psi；扫描模式：MRM(多反应监测)。
本发明的有益效果是：对全部样品采用同样步骤，不用分步处理，操作步骤少，检测时间短，能特异灵敏地准确定量分析物。
附图说明
图1(A)为雌二醇标准品MRM谱图；图1(B)为雌二醇内标MRM谱图。
图2(A)为雌三醇标准品MRM谱图；图2(B)为雌三醇内标MRM谱图。
图3(A)为雌酮标准品MRM谱图；图3(B)为雌酮内标MRM谱图。
图4(A)为脱氢表雄酮标准品MRM谱图；图4(B)为脱氢表雄酮内标MRM谱图。
图5(A)为脱氢表雄酮硫酸酯标准品MRM谱图；图5(B)为脱氢表雄酮硫酸酯内标MRM谱图。
图6(A)为睾酮标准品MRM谱图；图6(B)为睾酮内标MRM谱图。
图7(A)为二氢睾酮标准品MRM谱图；图7(B)为二氢睾酮内标MRM谱图。
图8(A)为雄烯二酮标准品MRM谱图；图8(B)为雄烯二酮内标MRM谱图。
图9(A)为皮质醇标准品MRM谱图；图9(B)为皮质醇内标MRM谱图。
图10(A)为可的松标准品MRM谱图；图10(B)为可的松内标MRM谱图。
图11(A)为11-去氧皮质醇标准品MRM谱图；图11(B)为11-去氧皮质醇内标MRM谱图。
图12(A)为17α-羟孕酮标准品MRM谱图；图12(B)为17α-羟孕酮内标MRM谱图。
图13(A)为17α-羟孕烯醇酮标准品MRM谱图；图13(B)为17α-羟孕烯醇酮内标MRM谱图。
图14(A)为醛固酮标准品MRM谱图；图14(B)为醛固酮内标MRM谱图。
图15(A)为皮质酮标准品MRM谱图；图15(B)为皮质酮内标MRM谱图。
图16(A)为脱氧皮质酮标准品MRM谱图；图16(B)为脱氧皮质酮内标MRM谱图。
图17(A)为孕酮标准品MRM谱图；图17(B)为孕酮内标MRM谱图。
图18(A)为孕烯醇酮标准品MRM谱图；图18(B)为孕烯醇酮内标MRM谱图。
图19(A)为人血清样本中雌二醇MRM谱图；图19(B)为雌二醇内标MRM谱图。
图20(A)为人血清样本中雌三醇MRM谱图；图20(B)为雌三醇内标MRM谱图。
图21(A)为人血清样本雌酮MRM谱图；图21(B)为雌酮内标MRM谱图。
图22(A)为人血清样本脱氢表雄酮MRM谱图；图22(B)为脱氢表雄酮内标MRM谱图。
图23(A)为人血清样本脱氢表雄酮硫酸酯MRM谱图；图23(B)为脱氢表雄酮硫酸酯内标MRM谱图。
图24(A)为人血清样本睾酮MRM谱图；图24(B)为睾酮内标MRM谱图。
图25(A)为人血清样本二氢睾酮MRM谱图；图25(B)为二氢睾酮内标MRM谱图。
图26(A)为人血清样本雄烯二酮MRM谱图；图26(B)为雄烯二酮内标MRM谱图。
图27(A)为人血清样本皮质醇MRM谱图；图27(B)为皮质醇内标MRM谱图。
图28(A)为人血清样本可的松MRM谱图；图28(B)为可的松内标MRM谱图。
图29(A)为人血清样本11-去氧皮质醇MRM谱图；图29(B)为11-去氧皮质醇内标MRM谱图。
图30(A)为人血清样本17α-羟孕酮MRM谱图；图30(B)为17α-羟孕酮内标MRM谱图。
图31(A)为人血清样本17α-羟孕烯醇酮MRM谱图；图31(B)为17α-羟孕烯醇酮内标MRM谱图。
图32(A)为人血清样本醛固酮MRM谱图；图32(B)为醛固酮内标MRM谱图。
图33(A)为人血清样本皮质酮MRM谱图；图33(B)为皮质酮内标MRM谱图。
图34(A)为人血清样本脱氧皮质酮MRM谱图；图34(B)为脱氧皮质酮内标MRM谱图。
图35(A)为人血清样本孕酮MRM谱图；图35(B)为孕酮内标MRM谱图。
图36(A)为人血清样本孕烯醇酮MRM谱图；图36(B)为孕烯醇酮内标MRM谱图。
图37为雌二醇的定量标准曲线。
图38为雌三醇的定量标准曲线。
图39为雌酮的定量标准曲线。
图40为脱氢表雄酮的定量标准曲线。
图41为脱氢表雄酮硫酸酯的定量标准曲线。
图42为睾酮的定量标准曲线。
图43为二氢睾酮的定量标准曲线。
图44为雄烯二酮的定量标准曲线。
图45为皮质醇的定量标准曲线。
图46为可的松的定量标准曲线。
图47为11-去氧皮质醇的定量标准曲线。
图48为17α-羟孕酮的定量标准曲线。
图49为17α-羟孕烯醇酮的定量标准曲线。
图50为醛固酮的定量标准曲线。
图51为皮质酮的定量标准曲线。
图52为脱氧皮质酮的定量标准曲线。
图53为孕酮的定量标准曲线。
图54为孕烯醇酮的定量标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。为了突出本发明的重点，本文对一些常规的操作进行了省略，或仅作简单描述。
需要理解到的是：虽然本发明已通过具体实施方式对其进行了较为详细的描述，但这些描述并非对本发明专利范围的限制，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变动，均属于本发明所保护的范围。
本文方法学研究实验的样本来自杭州度安医学检验实验室。
本文所使用的仪器包括：Triple Quad 4500MD&Jasper HPLC三重四级杆质谱仪(美国，AB SCIEX)；医用高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；超纯水仪(加拿大颇尔富迪生物分析仪器(上海)有限公司)；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；氮吹仪(MD200，杭州奥盛仪器有限公司)；移液器(BRAND，0.5～10μL，10～200μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
本文所使用的试剂和耗材包括：甲醇(美国，Merk)；甲酸(阿拉丁)；甲酸铵(Macklin)；叔丁基甲醚(美国，Merk)；乙酸乙酯(美国，Merk)；二氯甲烷(Macklin)；牛血清白蛋白(美国，Sigma-Aldrich)；磷酸盐缓冲液(美国，Sigma-Aldrich)；碳酸钠(阿拉丁)；丹磺酰氯(阿拉丁)；色谱柱：ACE EXCEL-2PFP-C18(2.1mmx100mm)。
本文所使用的标准品包括：雌二醇、雌三醇、雌酮、脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮；均购自美国，CIL和IsoSciences。
本文所使用的的内标物包括：雌二醇-13C6、雌三醇-13C3、雌酮-13C3、脱氢表雄酮-D3、脱氢表雄酮硫酸酯-D6、睾酮-D3、二氢睾酮-D3、雄烯二酮-13C3、皮质醇-13C3、可的松-D8、11-去氧皮质醇-D5、17α-羟孕酮-D8、17α-羟孕烯醇酮-13C3D2、醛固酮-D8、皮质酮-D8、孕酮-D9和孕烯醇酮-D4；均购自美国，CIL和IsoSciences。
一种类固醇激素检测方法，包括以下步骤：
1)准备工作
配制混合标准液：分别称取雌二醇标准品、雌三醇标准品、雌酮标准品、脱氢表雄酮标准品、脱氢表雄酮硫酸酯标准品、睾酮标准品、二氢睾酮标准品、雄烯二酮标准品、皮质醇标准品、可的松标准品、11-去氧皮质醇标准品、17α-羟孕酮标准品、17α-羟孕烯醇酮标准品、醛固酮标准品、皮质酮标准品、脱氧皮质酮标准品、孕酮标准品和孕烯醇酮标准品，用甲醇配制成混合标准液。混合标准液中各组分的浓度如表1所示。
表1混合标准液中各组分浓度
Figure BDA0002322245050000051
Figure BDA0002322245050000061
使用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液，将混合标准液稀释50倍，得到第一个工作曲线浓度点W1；再分别使用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液，将W1稀释定容至W2-W9。其中，W2浓度为W1浓度的60％；W3浓度为W1浓度的40％；W4浓度为W1浓度的20％；W5浓度为W1浓度的5％；W6浓度为W1浓度的2％；W7浓度为W1浓度的1％；W8浓度为W1浓度的0.5％；W9浓度为W1浓度的0.2％。
配制混合内标溶液：分别称取雌二醇-13C6标准品、雌三醇-13C3标准品、雌酮-13C3标准品、脱氢表雄酮-D6标准品、脱氢表雄酮硫酸酯-D6标准品、睾酮-D3标准品、二氢睾酮-D3标准品、雄烯二酮-13C3标准品、皮质醇-13C3标准品、可的松-D8标准品、11-去氧皮质醇-D5标准品、17α-羟孕酮-D8标准品、17α-羟孕烯醇酮-13C3D2标准品、醛固酮-D8标准品、皮质酮-D8标准品、孕酮-D9标准品和孕烯醇酮-D4标准品，用甲醇配制成混合内标溶液。混合内标溶液中各组分的浓度如表2所示，其中脱氧皮质酮和17α-羟孕酮的内标物均为17α-羟孕酮-D8。
表2混合内标溶液中各组分浓度
Figure BDA0002322245050000062
配制萃取剂：混合叔丁基甲醚、乙酸乙酯和二氯甲烷，配制萃取剂。萃取剂中叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为50∶850∶100。
2)待测样品处理
取400μL血清置于洁净离心管中；向离心管中加入200μL混合内标溶液，涡旋震荡混匀2min，进行蛋白沉淀；然后加入1500μL萃取剂，涡旋震荡5min，在温度为8℃、转速为1400rpm的条件下离心5min；取上清液800μL至洁净孔板内；在室温下氮气吹干；加入50μL浓度为10mM的碳酸钠水溶液，加入50μL浓度为5mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液；涡旋震荡2min，在温度为60℃的条件衍生5min；衍生结束冷却后加入50μL的50％甲醇复溶，涡旋震荡2min，在温度为8℃、转速为3600rpm的条件下离心10min，取其上清液，准备进样。
3)仪器检测
使用三重四级杆质谱仪，对待测样品中的分析物进行检测。
色谱条件为：
流动相A液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；
流动相B液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；
流速：0.3mL/min；
柱温：40℃；
进样10μL，流动相梯度洗脱参数如表3所示。
表3流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流动相A液(％) 流动相B液(％)
0 45 55
4.5 40 60
5 0 100
7.5 0 100
7.6 45 55
9 45 55
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)正负切换模式；
喷雾电压(Ionspray Voltage)：正离子模式为5.5KV，负离子模式为-4.5KV；离子源温度(Temperature)：550℃；
离子源气体一(Ion Source Gas1)：30psi；
离子源气体二(Ion Source Gas2)：30psi；
锥孔气(Curtain Gas)：20psi；
碰撞气(Collision Gas)：9psi；
扫描模式：MRM(多反应监测)；
分析物及内标物的质谱参数如表4所示。
表4分析物及内标物的质谱参数
Figure BDA0002322245050000081
Figure BDA0002322245050000091
Figure BDA0002322245050000101
其中，雌酮、雌酮-13C3、雌二醇、雌二醇-13C6、雌三醇和雌三醇-13C3这几种化合物的母离子是化合物与丹磺酰氯反应后产物的质谱参数，这些参数通过标准品衍生后优化质谱条件得出；另外脱氧皮质酮使用17α-羟基孕酮-D8做为内标。
如图1至图18所示，十八种分析物的MRM质谱图基本没有杂峰干扰，说明在这个条件下能够得到很好的检测。
用本方法测试的400μL血清试剂样品，在9min内完成了全部分析物的测试，能够分析类固醇代谢的通路。如图19至图36所示，分析物与可能的干扰物之间得到了理想的分离和检测。
4)定量计算
对浓度为W1-W9的混合标准液进行处理和检测，处理和检测方式与待测样品的相同。检测得到标准品和内标峰面积。以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，得到标准曲线和标准曲线方程。标准曲线如图37至图54所示，标准曲线方程如表5所示。
表5标准曲线方程
分析物 曲线浓度(ng/mL) 标准曲线方程 线性系数
雌二醇 0.02-10 y＝0.43393x+1.22616e5 0.99989
雌三醇 0.02-10 y＝0.19028x+4.71434e4 0.99879
雌酮 0.02-10 y＝0.36301x+0.00134 0.99973
脱氢表雄酮 0.2-100 y＝0.38415x+0.05823 0.99987
脱氢表雄酮硫酸酯 16-8000 y＝0.01581x+0.07621 0.9995
睾酮 0.02-10 y＝0.39523x+0.00238 0.99955
二氢睾酮 0.04-20 y＝0.24936x+0.00872 0.99908
雄烯二酮 0.02-10 y＝0.98508x+0.02489 0.99928
皮质醇 1.0-500 y＝0.05472x+0.02057 0.99981
可的松 0.4-200 y＝0.11719x+0.01065 0.99959
11-去氧皮质醇 0.02-10 y＝0.43489x+6.39094e5 0.99977
17α-羟孕酮 0.4-200 y＝0.20640x+0.00238 0.99913
17α-羟孕烯醇酮 0.04-20 y＝1.51873x+0.81697 0.99857
醛固酮 0.02-10 y＝0.63184x+0.01019 0.99995
皮质酮 0.1-50 y＝0.18703x+0.00348 0.99981
脱氧皮质酮 0.02-10 y＝0.27399x+0.00651 0.99831
孕酮 0.4-200 y＝0.01876x+0.00386 0.99693
孕烯醇酮 0.02-10 y＝0.37530x+0.02778 0.99908
可以看出，分析物在各自的浓度范围内的标准曲线方程线性良好，相关系数都在0.999以上，满足定量要求。
将待测样品检测得到内标峰面积代入回归方程中，计算得到对应分析物的浓度，所得待测样品中分析物的含量如表6所示。
表6待测样品中分析物的含量
分析物 含量(ng/mL)
雌二醇 0.059
雌三醇 0.013
雌酮 0.022
脱氢表雄酮 0.365
脱氢表雄酮硫酸酯 838.8
睾酮 1.129
二氢睾酮 0.178
雄烯二酮 0.635
皮质醇 107.61
可的松 14.13
11-去氧皮质醇 0.499
17α-羟孕酮 0.258
17α-羟孕烯醇酮 1.231
醛固酮 0.056
皮质酮 3.597
脱氧皮质酮 0.111
孕酮 10.919
孕烯醇酮 0.271
对本发明检测方法的精密度和准确度进行检测：
配制质控样品：移取混合标准液400μL，用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液定容至20mL制得高质控样品。移取混合标准液80μL，用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液定容至20mL制得中质控样品。移取混合标准液12μL，用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液定容至20mL制得低质控样品。高质控样品、中质控样品和低质控样品中各组分的浓度如表7所示。
表7高质控样品、中质控样品和低质控样品中各组分浓度
Figure BDA0002322245050000121
Figure BDA0002322245050000131
对质控样品进行处理和检测，处理和检测方式与待测样品的相同。
1)精密度检测
分别取6个高质控样品、6个中质控样品和6个低质控样品，对每个样品中的分析物进行检测。合格的标准要求每一个水平浓度的质控样品(即高质控样品、中质控样品和低质控样品)中，分析物浓度测试结果的CV(变异系数)≤15％。
高质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在1.10％～8.23％范围内；中质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在1.06％～9.15％范围内；低质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在2.32％～8.27％范围内。
可以看出，每个浓度水平的质控样品中，分析物浓度测试结果的CV均小于10％，说明该测试方法具有较高的精密度。
2)准确度检测：
分析三天的不同浓度水平的质控样品，每个浓度水平均取6个样品。合格的标准要求三天测量的每一个浓度水平的质控样品的中，分析物浓度测试结果准确度的CV≤15％。高质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在89.76％～104.01％范围内，CV在2.23％～7.06％范围内；中质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在89.67％～105.71％范围内，CV在1.85％～8.17％范围内；低质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在90.25％～104.52％范围内，CV在2.47％～8.14％范围内。
可以看出，每个浓度水平的质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的CV均小于10％，说明该测试方法具有较高的准确度。

Claims (10)

1.一种类固醇激素检测方法，其特征在于，
所述检测方法的步骤包括：
1)向待测样品中加入内标物；
2)进行衍生化反应操作；
3)利用色谱串联质谱检测分析物；
所述分析物同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；所述衍生化反应操作使第一类类固醇激素发生衍生化反应；
其中，所述第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；
所述第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮。
2.根据权利要求1所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，所述分析物还同时包括雌酮。
3.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，内标物以混合内标溶液的形式加入待测样品中，混合内标溶液的溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，在步骤1)加入内标物后，对待测样品进行一次提纯；一次提纯的步骤为：向待测样品中加入萃取剂混匀，再进行离心，取上清液，对取得的上清液进行吹干。
5.根据权利要求4所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，所述萃取剂为叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的混合液，其中，叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为40～60∶800～900∶90～110。
6.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，所述衍生化反应操作步骤为：向待测样品中加入40μL～60μL浓度为8mM～12mM的碳酸钠水溶液，加入40μL～60μL浓度为3mg/mL～7mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液；涡旋震荡1min～5min，在温度为55℃～65℃的条件保持3min～7min。
7.根据权利要求4所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，在步骤2)进行衍生化反应操作之后，向待测样品中加入40μL～60μL 50％甲醇复溶。
8.根据权利要求7所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，在步骤3)检测分析物之前，对待测样品进行二次提纯；二次提纯的步骤为：离心，取上清液。
9.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，色谱条件为：流动相A液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；流动相B液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样10μL。
10.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测方法，其特征在于，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：550℃；离子源气体一：30psi；离子源气体二：30psi；锥孔气：20psi；碰撞气：9psi；扫描模式：多反应监测。
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