CN110927289A - 一种类固醇激素检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类固醇激素检测试剂盒，属于激素检测试剂盒技术领域。该试剂盒包括：混合标准液、混合内标溶液、稀释剂A和稀释剂B；混合标准液的溶质同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；混合标准液的溶剂为甲醇；第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11‑去氧皮质醇、17α‑羟孕酮、17α‑羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮。使用本发明试剂盒，能够特异灵敏地快速定量分析物，操作步骤少，无需分步处理。

Description

一种类固醇激素检测试剂盒
技术领域
本发明属于激素检测试剂盒技术领域，具体地指一种类固醇激素检测试剂盒。
背景技术
对于可的松和醛固酮等类固醇激素，无需进行衍生化反应，便可直接通过色谱串联质谱进行定量分析。中国专利CN110187043A公开了“一种同时检测血清中13种甾体激素的方法”，能同时检测孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮、11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮。而雌二醇和雌三醇在生物体内含量较低，不易被分析，很难在检测中准确地定量。因此，检测人员通常会在检测前对雌二醇和雌三醇进行衍生化反应，使雌二醇和雌三醇分别转化为与各自化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。中国专利CN105842379A公开了“一种衍生化测定酚类雌激素的方法”，能够检测17β-雌二醇和雌三醇。
在实际检测时，对同一份样品，往往需要检测多种类固醇激素。现有技术为防止衍生化反应对可的松和醛固酮等类固醇激素产生影响，一般会对样品采用分步式前处理，即在检测前，将样品分成两份，其中一份不进行衍生化反应，直接进行色谱串联质谱分析，定量部分类固醇激素；另一份则进行衍生化反应，再进行色谱串联质谱分析，定量雌二醇和雌三醇。如此检测，不仅操作步骤较多，检测时间较长，且检测时使用的样品量减少，从而使定量结果误差增大。
发明内容
为解决现有技术中需要对样品采用分步式前处理，操作步骤较多，检测时间较长等问题，本发明提供一种类固醇激素检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：一种类固醇激素检测试剂盒，所述试剂盒包括：
混合标准液、混合内标溶液、稀释剂A和稀释剂B；
所述混合标准液的溶质同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；混合标准液的溶剂为甲醇；所述第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；所述第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮；
所述稀释剂A为空白血清基质溶液；
所述稀释剂B为甲醇。
所述混合标准液的溶质还同时包括雌酮。
所述空白血清基质溶液为40mg/mL～60mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液。
所述试剂盒还包括衍生剂，所述衍生剂为8mM～12mM碳酸钠水溶液和3mg/mL～7mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液。
所述试剂盒还包括流动相；流动相A液为含3mM～7mM甲酸铵和0.08％～0.12％甲酸的水溶液；流动相B液为含3mM～7mM甲酸铵和0.08％～0.12％甲酸的甲醇溶液。
所述试剂盒还包括复溶剂；所述复溶剂为50％甲醇溶液。
所述试剂盒还包括萃取剂；所述萃取剂为叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的混合液，其中，叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为40～60∶800～900∶90～110。
所述试剂盒还包括高质控品、中质控品和低质控品；所述高质控品、中质控品和低质控品均由稀释剂A稀释混合标准液获得。
所述混合标准液为含有200ng/mL～300ng/mL雌二醇、200ng/mL～300ng/mL雌三醇、200ng/mL～300ng/mL雌酮、2000ng/mL～3000ng/mL脱氢表雄酮、200000ng/mL～300000ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯、200ng/mL～300ng/mL睾酮、400ng/mL～600ng/mL二氢睾酮、200ng/mL～300ng/mL雄烯二酮、10000ng/mL～15000ng/mL皮质醇、4000ng/mL～6000ng/mL可的松、200ng/mL～300ng/mL11-去氧皮质醇、400ng/mL～600ng/mL17α-羟孕酮、4000ng/mL～6000ng/mL17α-羟孕烯醇酮、200ng/mL～300ng/mL醛固酮、1000ng/mL～1500ng/mL皮质酮、200ng/mL～300ng/mL脱氧皮质酮、4000ng/mL～6000ng/mL孕酮、200ng/mL～300ng/mL孕烯醇酮的甲醇溶液。
所述混合内标溶液为含有3ng/mL～7ng/mL雌二醇-13C6、3ng/mL～7ng/mL雌三醇-13C3、3ng/mL～7ng/mL雌酮-13C3、20ng/mL～30ng/mL脱氢表雄酮-D6、80ng/mL～120ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-D6、3ng/mL～7ng/mL睾酮-D3、3ng/mL～7ng/mL二氢睾酮-D3、3ng/mL～7ng/mL雄烯二酮-13C3、30ng/mL～50ng/mL皮质醇-13C3、15ng/mL～25ng/mL可的松-D8、3ng/mL～7ng/mL11-去氧皮质醇-D5、5ng/mL～15ng/mL17α-羟孕酮-D8、15ng/mL～25ng/mL17α-羟孕烯醇酮-13C3D2、3ng/mL～7ng/mL醛固酮-D8、5ng/mL～15ng/mL皮质酮-D8、35ng/mL～45ng/mL孕酮-D9、5ng/mL～15ng/mL孕烯醇酮-D4的甲醇溶液。
本发明的有益效果：使用本发明试剂盒，能够特异灵敏地定量分析物，在9min内完成多种分析物的测试，操作步骤少，无需分步处理。
附图说明
图1(A)为雌二醇标准品MRM谱图；图1(B)为雌二醇内标MRM谱图。
图2(A)为雌三醇标准品MRM谱图；图2(B)为雌三醇内标MRM谱图。
图3(A)为雌酮标准品MRM谱图；图3(B)为雌酮内标MRM谱图。
图4(A)为脱氢表雄酮标准品MRM谱图；图4(B)为脱氢表雄酮内标MRM谱图。
图5(A)为脱氢表雄酮硫酸酯标准品MRM谱图；图5(B)为脱氢表雄酮硫酸酯内标MRM谱图。
图6(A)为睾酮标准品MRM谱图；图6(B)为睾酮内标MRM谱图。
图7(A)为二氢睾酮标准品MRM谱图；图7(B)为二氢睾酮内标MRM谱图。
图8(A)为雄烯二酮标准品MRM谱图；图8(B)为雄烯二酮内标MRM谱图。
图9(A)为皮质醇标准品MRM谱图；图9(B)为皮质醇内标MRM谱图。
图10(A)为可的松标准品MRM谱图；图10(B)为可的松内标MRM谱图。
图11(A)为11-去氧皮质醇标准品MRM谱图；图11(B)为11-去氧皮质醇内标MRM谱图。
图12(A)为17α-羟孕酮标准品MRM谱图；图12(B)为17α-羟孕酮内标MRM谱图。
图13(A)为17α-羟孕烯醇酮标准品MRM谱图；图13(B)为17α-羟孕烯醇酮内标MRM谱图。
图14(A)为醛固酮标准品MRM谱图；图14(B)为醛固酮内标MRM谱图。
图15(A)为皮质酮标准品MRM谱图；图15(B)为皮质酮内标MRM谱图。
图16(A)为脱氧皮质酮标准品MRM谱图；图16(B)为脱氧皮质酮内标MRM谱图。
图17(A)为孕酮标准品MRM谱图；图17(B)为孕酮内标MRM谱图。
图18(A)为孕烯醇酮标准品MRM谱图；图18(B)为孕烯醇酮内标MRM谱图。
图19(A)为人血清样本中雌二醇MRM谱图；图19(B)为雌二醇内标MRM谱图。
图20(A)为人血清样本中雌三醇MRM谱图；图20(B)为雌三醇内标MRM谱图。
图21(A)为人血清样本雌酮MRM谱图；图21(B)为雌酮内标MRM谱图。
图22(A)为人血清样本脱氢表雄酮MRM谱图；图22(B)为脱氢表雄酮内标MRM谱图。
图23(A)为人血清样本脱氢表雄酮硫酸酯MRM谱图；图23(B)为脱氢表雄酮硫酸酯内标MRM谱图。
图24(A)为人血清样本睾酮MRM谱图；图24(B)为睾酮内标MRM谱图。
图25(A)为人血清样本二氢睾酮MRM谱图；图25(B)为二氢睾酮内标MRM谱图。
图26(A)为人血清样本雄烯二酮MRM谱图；图26(B)为雄烯二酮内标MRM谱图。
图27(A)为人血清样本皮质醇MRM谱图；图27(B)为皮质醇内标MRM谱图。
图28(A)为人血清样本可的松MRM谱图；图28(B)为可的松内标MRM谱图。
图29(A)为人血清样本11-去氧皮质醇MRM谱图；图29(B)为11-去氧皮质醇内标MRM谱图。
图30(A)为人血清样本17α-羟孕酮MRM谱图；图30(B)为17α-羟孕酮内标MRM谱图。
图31(A)为人血清样本17α-羟孕烯醇酮MRM谱图；图31(B)为17α-羟孕烯醇酮内标MRM谱图。
图32(A)为人血清样本醛固酮MRM谱图；图32(B)为醛固酮内标MRM谱图。
图33(A)为人血清样本皮质酮MRM谱图；图33(B)为皮质酮内标MRM谱图。
图34(A)为人血清样本脱氧皮质酮MRM谱图；图34(B)为脱氧皮质酮内标MRM谱图。
图35(A)为人血清样本孕酮MRM谱图；图35(B)为孕酮内标MRM谱图。
图36(A)为人血清样本孕烯醇酮MRM谱图；图36(B)为孕烯醇酮内标MRM谱图。
图37为雌二醇的定量标准曲线。
图38为雌三醇的定量标准曲线。
图39为雌酮的定量标准曲线。
图40为脱氢表雄酮的定量标准曲线。
图41为脱氢表雄酮硫酸酯的定量标准曲线。
图42为睾酮的定量标准曲线。
图43为二氢睾酮的定量标准曲线。
图44为雄烯二酮的定量标准曲线。
图45为皮质醇的定量标准曲线。
图46为可的松的定量标准曲线。
图47为11-去氧皮质醇的定量标准曲线。
图48为17α-羟孕酮的定量标准曲线。
图49为17α-羟孕烯醇酮的定量标准曲线。
图50为醛固酮的定量标准曲线。
图51为皮质酮的定量标准曲线。
图52为脱氧皮质酮的定量标准曲线。
图53为孕酮的定量标准曲线。
图54为孕烯醇酮的定量标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细说明。为了突出本发明的重点，本文对一些常规的设备、装置、部件和操作进行了省略，或仅作简单描述。
需要理解到的是：虽然本发明已通过具体实施方式对其进行了较为详细的描述，但这些描述并非对本发明专利范围的限制，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变动，均属于本发明所保护的范围。
本文实验的样本来自杭州度安医学检验实验室。
本文所使用的仪器包括：Triple Quad 4500MD&Jasper HPLC三重四级杆质谱仪(美国，AB SCIEX)；医用高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；超纯水仪(加拿大颇尔富迪生物分析仪器(上海)有限公司)；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)；氮吹仪(MD200，杭州奥盛仪器有限公司)；移液器(BRAND，0.5～10μL，10～200μL，100～1000μL)；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
本文所使用的试剂和耗材包括：甲醇(美国，Merk)；甲酸(阿拉丁)；甲酸铵(Macklin)；叔丁基甲醚(美国，Merk)；乙酸乙酯(美国，Merk)；二氯甲烷(Macklin)；牛血清白蛋白(美国，Sigma-Aldrich)；磷酸盐缓冲液(美国，Sigma-Aldrich)；碳酸钠(阿拉丁)；丹磺酰氯(阿拉丁)；色谱柱：ACE EXCEL-2PFP-C18(2.1mmx100mm)。
本文所使用的标准品包括：雌二醇、雌三醇、雌酮、脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮；均购自美国，CIL和IsoSciences。
本文所使用的的内标物包括：雌二醇-13C6、雌三醇-13C3、雌酮-13C3、脱氢表雄酮-D3、脱氢表雄酮硫酸酯-D6、睾酮-D3、二氢睾酮-D3、雄烯二酮-13C3、皮质醇-13C3、可的松-D8、11-去氧皮质醇-D5、17α-羟孕酮-D8、17α-羟孕烯醇酮-13C3D2、醛固酮-D8、皮质酮-D8、孕酮-D9和孕烯醇酮-D4；均购自美国，CIL和IsoSciences。
本发明类固醇激素检测试剂盒的制备方法：
(1)流动相：
流动相A液：配制含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；
流动相B液：配制含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液。
(2)混合标准液：
分别称取雌二醇标准品、雌三醇标准品、雌酮标准品、脱氢表雄酮标准品、脱氢表雄酮硫酸酯标准品、睾酮标准品、二氢睾酮标准品、雄烯二酮标准品、皮质醇标准品、可的松标准品、11-去氧皮质醇标准品、17α-羟孕酮标准品、17α-羟孕烯醇酮标准品、醛固酮标准品、皮质酮标准品、脱氧皮质酮标准品、孕酮标准品和孕烯醇酮标准品，用甲醇配制成混合标准液。混合标准液中各组分的浓度如表1所示。
表1混合标准液中各组分浓度
组分 浓度(ng/mL)
雌二醇 250
雌三醇 250
雌酮 250
脱氢表雄酮 2500
脱氢表雄酮硫酸酯 250000
睾酮 250
二氢睾酮 500
雄烯二酮 250
皮质醇 12500
可的松 5000
11-去氧皮质醇 250
17α-羟孕酮 500
17α-羟孕烯醇酮 5000
醛固酮 250
皮质酮 1250
脱氧皮质酮 250
孕酮 5000
孕烯醇酮 250
(3)稀释剂：
稀释剂A：配制50mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液(牛血清白蛋白磷酸盐溶液)；
稀释剂B：甲醇。
(4)复溶剂：
配制50％甲醇溶液。
(5)质控品：
移取混合标准液400μL，用50mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液定容至20mL制得高质控样品。移取混合标准液80μL，用50mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液定容至20mL制得中质控样品。移取混合标准液12μL，用50mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液定容至20mL制得低质控样品。高质控样品、中质控样品和低质控样品中各组分的浓度如表2所示。
表2高质控样品、中质控样品和低质控样品中各组分浓度
中文名称 代号 高质控(ng/mL) 中质控(ng/mL) 低质控(ng/mL)
雌二醇 E2 5 1 0.15
雌三醇 E3 5 1 0.15
雌酮 E1 5 1 0.15
脱氢表雄酮 DHEA 50 10 1.5
脱氢表雄酮硫酸酯 DHEA-S 5000 1000 150
睾酮 TTST 5 1 0.15
二氢睾酮 DHT 10 2 0.3
雄烯二酮 A4 5 1 0.15
皮质醇 CORT 250 50 7.5
可的松 CO 100 20 3
11-去氧皮质醇 11-DC 5 1 0.15
17α-羟孕酮 OHPG 10 2 0.3
17α-羟孕烯醇酮 17-OHP 100 20 3
醛固酮 ALDS 5 1 0.15
皮质酮 CORTC 25 5 0.75
脱氧皮质酮 DOC 5 1 0.15
孕酮 PG 100 20 3
孕烯醇酮 PREGN 5 1 0.15
(6)衍生剂：
配制10mM碳酸钠水溶液；配制5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液。
(7)萃取剂：
混合叔丁基甲醚、乙酸乙酯和二氯甲烷，配制萃取剂；萃取剂中叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为50∶850∶100。
(8)混合内标溶液：
分别称取雌二醇-13C6标准品、雌三醇-13C3标准品、雌酮-13C3标准品、脱氢表雄酮-D6标准品、脱氢表雄酮硫酸酯-D6标准品、睾酮-D3标准品、二氢睾酮-D3标准品、雄烯二酮-13C3标准品、皮质醇-13C3标准品、可的松-D8标准品、11-去氧皮质醇-D5标准品、17α-羟孕酮-D8标准品、17α-羟孕烯醇酮-13C3D2标准品、醛固酮-D8标准品、皮质酮-D8标准品、孕酮-D9标准品和孕烯醇酮-D4标准品，用甲醇配制成混合内标溶液。混合内标溶液中各组分的浓度如表3所示，其中脱氧皮质酮和17α-羟孕酮的内标物均为17α-羟孕酮-D8。
表3混合内标溶液中各组分浓度
组分 浓度(ng/mL)
雌二醇-13C6 5
雌三醇-13C3 5
雌酮-13C3 5
脱氢表雄酮-D6 25
脱氢表雄酮硫酸酯-D6 100
睾酮-D3 5
二氢睾酮-D3 5
雄烯二酮-13C3 5
皮质醇-13C3 40
可的松-D8 20
11-去氧皮质醇-D5 5
17α-羟孕酮-D8 10
17α-羟孕烯醇酮-13C3D2 20
醛固酮-D8 5
皮质酮-D8 10
孕酮-D9 40
孕烯醇酮-D4 10
使用本发明类固醇激素检测试剂盒的测试方法：
1)待测样品处理
取400μL血清置于洁净离心管中；向离心管中加入200μL混合内标溶液，涡旋震荡混匀2min，进行蛋白沉淀；然后加入1500μL萃取剂，涡旋震荡5min，在温度为8℃、转速为1400rpm的条件下离心5min；取上清液800μL至洁净孔板内；在室温下氮气吹干；加入50μL浓度为10mM的碳酸钠水溶液，加入50μL浓度为5mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液；涡旋震荡2min，在温度为60℃的条件衍生5min；衍生结束冷却后加入50μL的50％甲醇复溶，涡旋震荡2min，在温度为8℃、转速为3600rpm的条件下离心10min，取其上清液，准备进样。
2)仪器检测
使用三重四级杆质谱仪，对待测样品中的分析物进行检测。
色谱条件为：
流动相A液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；
流动相B液：含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；
流速：0.3mL/min；
柱温：40℃；
进样10μL，流动相梯度洗脱参数如表4所示。
表4流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流动相A液(％) 流动相B液(％)
0 45 55
4.5 40 60
5 0 100
7.5 0 100
7.6 45 55
9 45 55
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)正负切换模式；
喷雾电压(Ionspray Voltage)：正离子模式为5.5KV，负离子模式为-4.5KV；
离子源温度(Temperature)：550℃；
离子源气体一(Ion Source Gas1)：30psi；
离子源气体二(Ion Source Gas2)：30psi；
锥孔气(Curtain Gas)：20psi；
碰撞气(Collision Gas)：9psi；
扫描模式：MRM(多反应监测)；
分析物及内标物的质谱参数如表5所示。
表5分析物及内标物的质谱参数
Figure BDA0002322239550000101
Figure BDA0002322239550000111
Figure BDA0002322239550000121
其中，雌酮、雌酮-13C3、雌二醇、雌二醇-13C6、雌三醇和雌三醇-13C3这几种化合物的母离子是化合物与丹磺酰氯反应后产物的质谱参数，这些参数通过标准品衍生后优化质谱条件得出；另外脱氧皮质酮使用17α-羟基孕酮-D8做为内标。
如图1至图18所示，十八种分析物的MRM质谱图基本没有杂峰干扰，说明在这个条件下能够得到很好的检测。
用本试剂盒测试的400μL血清试剂样品，在9min内完成了全部分析物的测试，能够分析类固醇代谢的通路。如图19至图36所示，分析物与可能的干扰物之间得到了理想的分离和检测。
3)定量计算
使用50mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液，将混合标准液稀释50倍，得到第一个工作曲线浓度点W1；再分别使用50mg/mL牛血清白蛋白磷酸盐溶液，将W1稀释定容至W2-W9。其中，W2浓度为W1浓度的60％；W3浓度为W1浓度的40％；W4浓度为W1浓度的20％；W5浓度为W1浓度的5％；W6浓度为W1浓度的2％；W7浓度为W1浓度的1％；W8浓度为W1浓度的0.5％；W9浓度为W1浓度的0.2％。
对浓度为W1-W9的混合标准液进行处理和检测，处理和检测方式与待测样品的相同。检测得到标准品和内标峰面积。以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，得到标准曲线和标准曲线方程。标准曲线如图37至图54所示，标准曲线方程如表6所示。
表6标准曲线方程
Figure BDA0002322239550000122
Figure BDA0002322239550000131
可以看出，分析物在各自的浓度范围内的标准曲线方程线性良好，相关系数都在0.999以上，满足定量要求。
将待测样品检测得到内标峰面积代入回归方程中，计算得到对应分析物的浓度，所得待测样品中分析物的含量如表7所示。
表7待测样品中分析物的含量
Figure BDA0002322239550000132
Figure BDA0002322239550000141
对使用本发明类固醇激素检测试剂盒的测试方法的精密度和准确度进行检测：
对质控样品进行处理和检测，处理和检测方式与待测样品的相同。
1)精密度检测
分别取6个高质控样品、6个中质控样品和6个低质控样品，对每个样品中的分析物进行检测。合格的标准要求每一个水平浓度的质控样品(即高质控样品、中质控样品和低质控样品)中，分析物浓度测试结果的CV(变异系数)≤15％。
高质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在1.10％～8.23％范围内；中质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在1.06％～9.15％范围内；低质控样品中，分析物浓度测试结果的CV在2.32％～8.27％范围内。
可以看出，每个浓度水平的质控样品中，分析物浓度测试结果的CV均小于10％，说明使用本发明类固醇激素检测试剂盒的测试方法具有较高的精密度。
2)准确度检测：
分析三天的不同浓度水平的质控样品，每个浓度水平均取6个样品。合格的标准要求三天测量的每一个浓度水平的质控样品的中，分析物浓度测试结果准确度的CV≤15％。高质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在89.76％～104.01％范围内，CV在2.23％～7.06％范围内；中质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在89.67％～105.71％范围内，CV在1.85％～8.17％范围内；低质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的总平均值在90.25％～104.52％范围内，CV在2.47％～8.14％范围内。
可以看出，每个浓度水平的质控样品中，分析物浓度测试结果准确度的CV均小于10％，说明使用本发明类固醇激素检测试剂盒的测试方法具有较高的准确度。

Claims (10)

1.一种类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
混合标准液、混合内标溶液、稀释剂A和稀释剂B；
所述混合标准液的溶质同时包括第一类类固醇激素和第二类类固醇激素；混合标准液的溶剂为甲醇；所述第一类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：雌二醇和雌三醇；所述第二类类固醇激素选自以下类固醇激素中的至少一种：脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、皮质醇、可的松、11-去氧皮质醇、17α-羟孕酮、17α-羟孕烯醇酮、醛固酮、皮质酮、脱氧皮质酮、孕酮和孕烯醇酮；
所述稀释剂A为空白血清基质溶液；
所述稀释剂B为甲醇。
2.根据权利要求1所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述混合标准液的溶质还同时包括雌酮。
3.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述空白血清基质溶液为40mg/mL～60mg/mL牛血清白蛋白PBS溶液。
4.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括衍生剂，所述衍生剂为8mM～12mM碳酸钠水溶液和3mg/mL～7mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液。
5.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相；流动相A液为含3mM～7mM甲酸铵和0.08％～0.12％甲酸的水溶液；流动相B液为含3mM～7mM甲酸铵和0.08％～0.12％甲酸的甲醇溶液。
6.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括复溶剂；所述复溶剂为50％甲醇溶液。
7.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括萃取剂；所述萃取剂为叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的混合液，其中，叔丁基甲醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷的体积比为40～60∶800～900∶90～110。
8.根据权利要求1或2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括高质控品、中质控品和低质控品；所述高质控品、中质控品和低质控品均由稀释剂A稀释混合标准液获得。
9.根据权利要求2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述混合标准液为含有200ng/mL～300ng/mL雌二醇、200ng/mL～300ng/mL雌三醇、200ng/mL～300ng/mL雌酮、2000ng/mL～3000ng/mL脱氢表雄酮、200000ng/mL～300000ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯、200ng/mL～300ng/mL睾酮、400ng/mL～600ng/mL二氢睾酮、200ng/mL～300ng/mL雄烯二酮、10000ng/mL～15000ng/mL皮质醇、4000ng/mL～6000ng/mL可的松、200ng/mL～300ng/mL11-去氧皮质醇、400ng/mL～600ng/mL17α-羟孕酮、4000ng/mL～6000ng/mL17α-羟孕烯醇酮、200ng/mL～300ng/mL醛固酮、1000ng/mL～1500ng/mL皮质酮、200ng/mL～300ng/mL脱氧皮质酮、4000ng/mL～6000ng/mL孕酮、200ng/mL～300ng/mL孕烯醇酮的甲醇溶液。
10.根据权利要求2所述的类固醇激素检测试剂盒，其特征在于，所述混合内标溶液为含有3ng/mL～7ng/mL雌二醇-13C6、3ng/mL～7ng/mL雌三醇-13C3、3ng/mL～7ng/mL雌酮-13C3、20ng/mL～30ng/mL脱氢表雄酮-D6、80ng/mL～120ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-D6、3ng/mL～7ng/mL睾酮-D3、3ng/mL～7ng/mL二氢睾酮-D3、3ng/mL～7ng/mL雄烯二酮-13C3、30ng/mL～50ng/mL皮质醇-13C3、15ng/mL～25ng/mL可的松-D8、3ng/mL～7ng/mL11-去氧皮质醇-D5、5ng/mL～15ng/mL17α-羟孕酮-D8、15ng/mL～25ng/mL17α-羟孕烯醇酮-13C3D2、3ng/mL～7ng/mL醛固酮-D8、5ng/mL～15ng/mL皮质酮-D8、35ng/mL～45ng/mL孕酮-D9、5ng/mL～15ng/mL孕烯醇酮-D4的甲醇溶液。
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