CN114705787A - 基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法 - Google Patents
基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：1)干血斑样本前处理：1‑1)萃取：从干血斑样本上取血片，加入内标萃取液，震荡；1‑2)氮吹：离心，然后氮吹干；1‑3)衍生：加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量。本发明采用的干血斑采样具有极小的侵入性、样品采集简便，可以有效去除生物样本的基质效应，干血斑的运输和储存便利；本发明通过羟胺衍生可以提高羰基类固醇激素的离子化效率，通过流动相中加入氟化铵可以改善羟基类固醇的电离过程。
Description
技术领域
本发明涉及临床质谱体外检测技术领域，特别涉及一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法。
背景技术
类固醇激素包括糖皮质激素、盐皮质激素和性激素，其生理功能主要表现在调节糖代谢、调节水盐代谢以及调节性腺功能，对生命维持、机体发展、免疫调节、性功能调节和生育控制方面有明确的作用。通过LC-MS/MS进行类固醇分析已被广泛应用于先天性肾上腺皮质增生、原发性醛固酮增多症、库欣综合征、多囊卵巢综合征等疾病的筛查。
目前，临床中多通过液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取等方式处理人血清或血浆样本进行内源性的类固醇激素分析，但进行血清或血浆类固醇分析需要进行侵入性的静脉采血和样本采集，必须在短时间内低温下进行样本的保存和运输，非常不方便在临床中展开应用。对比而言，干血斑(DBS)是样本采集和保存的一个不错的选择。然而，干血斑技术在内源性类固醇激素的样本分析中却鲜有报道。专利CN 107462653A公开了一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其用甲醇萃取干血片后即可进行分析，但指标的离子化效率不高，检测下限无法满足临床需求。
所以，现在需要提供一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：
1)干血斑样本前处理：
1-1)萃取：从干血斑样本上取血片置于容器中，加入内标萃取液，震荡；
1-2)氮吹：离心，然后氮吹干；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；
2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量；
其中，所述12种类固醇激素包括：双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮、醛固酮和雄烯二酮。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取若干个血片置于离心管中，加入内标萃取液，室温下300-1500rpm下震荡20-80min；
1-2)氮吹：2500-10000rpm下离心2-10min，得到提取液，然后将提取液转移到新的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含50-200mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为15-60％的乙腈水溶液，300-1500rpm下混匀0.5-2min，然后在40-70℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取2个3mm的血片置于2mL的离心管中，加入100-400μL内标萃取液，室温下750rpm下震荡40min；
1-2)氮吹：5000rpm下离心5min，得到提取液，然后将提取液转移到新的2mL的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入40-160uL含100mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为30％的乙腈水溶液，750rpm下混匀1min，然后在60℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取2个3mm的血片置于2mL的离心管中，加入200μL内标萃取液，室温下750rpm下震荡40min；
1-2)氮吹：5000rpm下离心5min，得到提取液，然后将提取液转移到新的2mL的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入80uL含100mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为30％的乙腈水溶液，750rpm下混匀1min，然后在60℃下恒温衍生15-60min，制得测试样
优选的是，其中，液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱；
流动相：A相为0.2mM的氟化铵水溶液，B相为0.2mM的氟化铵甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，40％B；0-4min，60％B；4-5.7min，67％B；5.7-8.3min，70％B；8.3-8.5min，90％B；8.5-11.3min，90％B；11.3-11.5min，40％B；11.5-13min，40％B；
流速：0.7mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
优选的是，质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；气帘气30psi，喷雾气50psi，辅助加热气60psi，温度500℃，离子化电压：+5500V/-4500V，碰撞气：10psi。
优选的是，其中，内标萃取液的制备方法为：将双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8混合并通过甲醇稀释得到内标萃取液，内标萃取液中双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8的浓度依次为75ng/mL、100ng/mL、1500ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、15ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、1μg/mL和60ng/mL。
优选的是，其中，干血斑样本包括待测干血斑样本和用于构建标准曲线的干血斑标准曲线样本。
优选的是，其中，待测干血斑样本的制备方法为：用移液器吸取待测血液样品滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑样本。待测干血斑样本为现成的试样，或是将液体样本通过以下方法制备：用移液器吸取待测血液样品滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑样本。
优选的是，干血斑标准曲线样本的制备方法包括以下步骤：
S1、制备人造空白全血：
S1-1、使用肝素抗凝全血，以3000rpm的速度离心5min，弃去上层血浆后，加入等体积生理盐水溶液，充分混匀清洗后；
S1-2、再次以3000rpm离心5min，吸取并丢弃上层清液，重复此操作5次，即得红细胞；
S1-3、将红细胞与去激素人血清按照55:45比例混合，混匀后即得人造空白全血；
S2、制备全血标准曲线溶液：
取标准品双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮母液、醛固酮和雄烯二酮母液用甲醇进行稀释得到标准溶液，将标准溶液加入到人造空白全血中配制得到一系列浓度的全血标准曲线溶液；
S3、制备干血斑标准曲线样本：用移液器吸取全血标准曲线溶液滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑标准曲线样本；
通过将血斑标准曲线样本按照所述步骤1)进行前处理后，再供液相色谱串联质谱的方法进行检测，构建得到标准曲线。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法通过简单的一步萃取即可提取干血片中的类固醇，同时通过羟胺衍生、以及在流动相中加入氟化铵能提高羰基和羟基类固醇的离子化效率；
本发明中，采用的干血斑采样具有极小的侵入性、样品采集简便，干血斑的运输和储存便利；且采用干血斑技术还可以有效去除生物样本的基质效应；
本发明通过羟胺衍生可以提高羰基类固醇激素的离子化效率，通过流动相中加入氟化铵可以改善羟基类固醇的电离过程，明显提升类固醇指标的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明的实施例中获得的目标物色谱图；
图2为本发明的实施例中获得的12种类固醇激素的标准曲线；
图3为本发明的实施例中的不同萃取时间的对比结果；
图4为本发明的实施例中的不同浓度盐酸羟胺衍生效果的对比；
图5为本发明的实施例中的不同衍生时间效果的对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一、试剂来源说明
标准品：双氢睾酮(DHT)、脱氢表雄酮(DHEA)、17-羟孕酮(17-OHP)、孕酮(P)、皮质酮(B)、可的松(E)、醛固酮(Ald)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)购自Sigma-Aloric公司，雌三醇(E3)、17-羟孕烯醇酮(17-OHPreg)购自上海甄准生物科技有限公司，雄烯二酮(AD)购自北京振翔科技有限公司；孕酮-13C3购自Sigma-Aloric公司，雄烯二酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2购自上海甄准生物科技有限公司，双氢睾酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、醛固酮-d8购自上海谱芬生物技术有限公司。甲醇、乙腈购买于天津康科德公司。氟化铵、盐酸羟胺购自Sigma-Aloric公司。去激素人血清购买于Golden West Biologicals。高纯水是符合国际GB/T 6682-2008的一级水。
二、试剂配制
1、空白全血制备
使用肝素抗凝全血，以3000rpm的速度离心5min，弃去上层血浆后，加入等体积生理盐水溶液，充分混匀清洗后，再次以3000rpm离心5min，吸取并丢弃上层清液，重复此操作5次，即得红细胞；将红细胞与去激素人血清按照55:45比例混合，混匀后即得人造空白全血。
2、全血标准曲线溶液配制
取标准品双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇和17-羟孕烯醇酮母液1mg/mL，醛固酮和雄烯二酮母液100ug/mL用甲醇进行稀释得到标准溶液，加入到人造空白全血中配制一系列的标准曲线溶液，其中双氢睾酮DHT浓度分别为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL，雄烯二酮AD浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，脱氢表雄酮DHEA浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL，17-羟孕酮17-OHP浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，孕酮P浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，皮质酮B浓度分别为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，可的松E浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、50ng/mL，雌酮E1浓度分别为0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL，雌二醇E2浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL，雌三醇E3浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL，17-羟孕烯醇酮17-OHPreg浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，醛固酮Ald浓度分别为0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、0.75ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
3、干血斑标准曲线样本制备
用移液器吸取100μL全血标准样品滴于903#滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑标准曲线样本。干血斑样本需放置在-20℃冰箱中储存备用。
4、内标萃取液配制
将双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8混合并通过甲醇稀释得到内标萃取液，内标萃取液中双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8的浓度依次为75ng/mL、100ng/mL、1500ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、15ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、1μg/mL和60ng/mL。
三、检测方案
一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：
1)待测干血斑样本前处理：
1-1)萃取：从待测干血斑样本上取2个3mm的血片置于2mL的离心管中，加入200μL内标萃取液，室温下750rpm下震荡40min；
1-2)氮吹：5000rpm下离心5min，得到提取液，然后将提取液转移到新的2mL的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入80uL含100mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为30％的乙腈水溶液，750rpm下混匀1min，然后在60℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
其中，待测干血斑样本为现成的试样，或是将液体样本通过以下方法制备：用移液器吸取待测血液样品滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑样本。
2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量；
其中，所述12种类固醇激素包括：双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮、醛固酮和雄烯二酮。
(1)液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱(2.1×100mm，3.5μm)；
流动相：A相为0.2mM的氟化铵水溶液，B相为0.2mM的氟化铵甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，40％B；0-4min，60％B；4-5.7min，67％B；5.7-8.3min，70％B；8.3-8.5min，90％B；8.5-11.3min，90％B；11.3-11.5min，40％B；11.5-13min，40％B；
流速：0.7mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
(2)质谱条件为：
电喷雾离子源(ESI+/-)；检测方式：多反应监测(MRM)；气帘气(CUR)30psi，喷雾气(GS1)50psi，辅助加热气(GS2)60psi，温度(TEM)500℃，离子化电压(IS)+5500V/-4500V，碰撞气(CAD)10psi。每种化合物的母离子(Q1)、子离子(Q3)、驻留时间、去簇电压(DP)、碰撞能(CE)、碰撞池入口电压(EP)和出口电压(CXP)等质谱参数见下表1。
表1质谱采集参数
参照图1，为本实施例中获得的目标物色谱图。
其中，标准曲线构建方法为：将以上制备的血斑标准曲线样本按照所述步骤1)进行前处理后，再供液相色谱串联质谱的方法进行检测，即可构建得到标准曲线。参照图2为12种类固醇激素的标准曲线，其中，(a)DHT的标准曲线；(b)AD的标准曲线；(c)DEHA的标准曲线；(d)17-OHP的标准曲线；(e)P的标准曲线；(f)B的标准曲线；(g)E的标准曲线；(h)E1的标准曲线；(i)E2的标准曲线；(j)E3的标准曲线；(k)17-OHPreg的标准曲线；(l)Ald的标准曲线。
四、参数优化分析
1、不同萃取时间结果的对比
本实施例中优化了步骤1-1)中萃取剂从干血片中提取分析物所用的时间，对比类固醇指标的峰面积数据如图3所示，实验中以AD、17-OHP、B、E、E1为例，探究了不同萃取时间的实验效果，实验结果如图3所示。在10-50min的时间范围内，峰面积先增加后趋于稳定。这是由于当萃取时间不足时，干血片中的类固醇不能全部被提取进入萃取液；随着时间逐渐增加至40min时，几乎所有分析物都被提取，此时萃取达到临界点。因此经过优化，优选萃取步骤所用时间为40min。
2、不同浓度盐酸羟胺衍生结果的对比
本实施例中优化了衍生试剂中盐酸羟胺的浓度，对比类固醇指标的峰面积数据如图4所示，实验中以AD、17-OHP、B、E、E1为例，探究了不同浓度盐酸羟胺的衍生效果，实验结果如图3所示，在50-150mM的浓度范围内，峰面积先增加后趋于稳定。这是由于当盐酸羟胺浓度低于100mM时，其量不足以衍生所有的分析物；随着盐酸羟胺逐渐增加至100mM时，所有羰基类固醇均被衍生，此时盐酸羟胺浓度达到临界点。因此经过优化，优选使用盐酸羟胺的浓度为100mM。
3、不同衍生时间处理结果的对比
本实施例中优化了衍生过程所用的时间，对比类固醇指标的峰面积数据如图5所示，实验中以AD、17-OHP、B、E、E1为例，探究了不同衍生时间的效果，实验结果如图4所示，在10-50min的时间范围内，峰面积先增加后趋于稳定。这是由于当衍生时间低于30min时，反应时间太短，不足以衍生所有的分析物；随着衍生时间逐渐增加至30min，所有羰基类固醇均被衍生，此时衍生时间达到临界点。因此经过优化，优选使用的衍生时间为30min。
4、衍生化和非衍生化对于羰基类固醇影响的对比
本实施例中对比了衍生化和非衍生化后羰基类固醇的峰面积，其中非衍生化处理是在完成萃取和氮吹后，加入80uL甲醇水(1/1，v/v)溶液，充分混匀溶解后上机测试。对比类固醇指标的峰面积数据如下表2：
表2
非衍生时羰基类固醇所用的定量离子对与衍生化不同，部分指标的ESI检测模式也不同，质谱参数详见下表3：
表3
| 羰基类固醇 | 非衍生Q1/Q3(m/z) | ESI | DP(V) | CE(V) |
| AD | 287.2/97.1 | + | 65 | 35 |
| DHT | 291.2/255.2 | + | 45 | 28 |
| DHEA | 271/253.3 | + | 55 | 32 |
| P | 315.1/97.1 | + | 85 | 46 |
| 17-OHP | 331.1/97.2 | + | 62 | 37 |
| B | 347.1/329.3 | + | 60 | 25 |
| E | 361.1/163.2 | + | 57 | 35 |
| E1 | 269/145.1 | - | -100 | -50 |
| 17-OHPreg | 331.1/287.2 | - | -80 | -27 |
| Ald | 359.1/189 | - | -78 | -25 |
通过结果对比可知，羟胺衍生化会大幅度提高羰基类固醇激素的峰面积响应水平，这是由于羟胺会与类固醇分子结构中的羰基发生肟化反应，产物具有较高的离子化效率，从而产生较高的峰面积响应，证明衍生化有利于生物样本中痕量内源性类固醇激素的定量分析。
5、不同流动相组成对未衍生的羟基类固醇影响的对比
实验中探究了不同流动相对于E2和E3的影响，峰面积数据如下表4：
表4
| 流动相A/水 | 流动相B/甲醇 | E2 | E3 |
| 5mM甲酸铵 | 5mM甲酸铵 | 2.86E+03 | 4.23E+03 |
| 5mM乙酸铵+0.1％甲酸 | 5mM乙酸铵+0.1％甲酸 | 4.09E+03 | 3.55E+03 |
| 0.2mM氟化铵 | 0.2mM氟化铵 | 1.31E+05 | 1.05E+05 |
实验中尝试了在流动相A-水和B-甲醇中加入不同的成分，以观察其对未被衍生的羟基类固醇E2和E3电离过程的影响。实验发现在流动相中加入甲酸铵、乙酸铵和甲酸时，E2和E3的峰面积响应仅有103水平；但当加入0.2mM氟化铵时，二者的峰面积响应提升了将近50倍，表明流动相中加入氟化铵可以有效改善E2和E3的电离作用。
6、干血斑技术与液液萃取结果对比
实验中还探究了干血斑技术与常规液液萃取处理同一样本后指标的峰面积响应情况。具体实施方式：取一全血样本分为两份，其中一份按照干血斑技术进行萃取衍生等操作后上机测试；另一份低温离心后取45μL上层血浆进行液液萃取，加入1mL甲基叔丁基醚充分混匀，然后取900μL上清液进行氮吹，完全除去溶剂后，加入80μL甲醇水(1/1，v/v)溶液，充分混匀溶解后上机测试(液液萃取与(4)中非衍生羰基类固醇所用的定量离子对相同)。对比类固醇指标的峰面积数据如下表5：
表5
| 类固醇 | 干血斑 | 液液萃取 |
| AD | 2.67E+05 | 2.12E+05 |
| DHT | 2.41E+04 | 1.85E+04 |
| DHEA | 1.17E+05 | 9.29E+04 |
| P | 2.50E+05 | 1.21E+05 |
| 17-OHP | 8.38E+04 | 5.95E+04 |
| B | 9.16E+04 | 4.52E+04 |
| E | 1.36E+06 | 5.32E+05 |
| E1 | 6.79E+05 | 5.47E+05 |
| E2 | 1.04E+05 | 9.69E+04 |
| E3 | 1.33E+05 | 1.42E+05 |
| 17-OHPreg | 5.80E+04 | 3.47E+04 |
| Ald | 3.68E+05 | 2.76E+05 |
通过结果对比可知，对于羰基类固醇，采用干血斑处理的峰面积响应明显高于液液萃取，而对于未被衍生的羟基类固醇E2和E3，两种方式处理的结果峰面积相差不多，表明盐酸羟胺的衍生化可以有效提高羰基类固醇的离子化效率，进而提升其响应水平。对比结果表明基于衍生化的干血斑技术，在临床类固醇定量检测中具有明显的优势。
五、方法验证
7.1精密度
选取低、中、高三个浓度评价所建立方法的精密度，每个批次每个浓度样本分不少于5次进行处理，连续测定3个批次，总样本数不少于45份，分别评估每个浓度样本的批内精密度和批间精密度，结果如下表6所示。
由数据结果可知，低、中、高三个浓度的批内精密度和批间精密度均在15％以内，符合要求，表明方法具有较好的稳定性和可重现性。
表6
7.2加标回收
采用真实混合人全血的加标回收实验来评价方法的准确度。每个浓度两个平行样，每个样本测试两次，计算加标回收率，结果如下表7所示。
由数据结果可知，加标样品的检测值和理论值的偏差在±15％范围内，满足要求，表明所建立的干血斑方法可用于内源性类固醇激素的检测。
表7
7.3定量下限
根据DHT、AD、DHEA、17-OHP、P、B、E、E1、E2、E3、17-OHPreg、Ald的临床检测需求，设定方法的定量下限，连续检测10次，计算检测值和理论值的偏差以及测试结果的变异系数CV值。测试结果如下表8所示。
由结果可知，测试值和理论值的偏差均在15％以内，测试的平行样本变异系数在20％以内，由此可知将方法的定量下限定为DHT为0.2ng/mL，AD为0.05ng/mL，DHEA为1ng/mL，17-OHP为0.1ng/mL，P为0.05ng/mL，B为0.2ng/mL，E为0.5ng/mL，E为0.5ng/mL，E1为0.02ng/mL，E2为0.05ng/mL，E3为0.1ng/mL，17-OHPreg为0.5ng/mL，Ald为0.1ng/mL，符合临床检测的要求。
表8
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)干血斑样本前处理：
1-1)萃取：从干血斑样本上取血片置于容器中，加入内标萃取液，震荡；
1-2)氮吹：离心，然后氮吹干；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含盐酸羟胺的乙腈水溶液，混匀，然后恒温衍生，制得测试样；
2)采用液相色谱串联质谱的方法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到待测干血斑样本中的12种类固醇激素的含量；
其中，所述12种类固醇激素包括：双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮、醛固酮和雄烯二酮。
2.根据权利要求1所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取若干个血片置于离心管中，加入内标萃取液，室温下300-1500rpm下震荡20-80min；
1-2)氮吹：2500-10000rpm下离心2-10min，得到提取液，然后将提取液转移到新的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入含50-200mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为15-60％的乙腈水溶液，300-1500rpm下混匀0.5-2min，然后在40-70℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
3.根据权利要求2所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取2个3mm的血片置于2mL的离心管中，加入100-400μL内标萃取液，室温下750rpm下震荡40min；
1-2)氮吹：5000rpm下离心5min，得到提取液，然后将提取液转移到新的2mL的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入40-160uL含100mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为30％的乙腈水溶液，750rpm下混匀1min，然后在60℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
4.根据权利要求3所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)萃取：从干血斑样本上取2个3mm的血片置于2mL的离心管中，加入200μL内标萃取液，室温下750rpm下震荡40min；
1-2)氮吹：5000rpm下离心5min，得到提取液，然后将提取液转移到新的2mL的离心管中，然后氮吹干除去溶剂；
1-3)衍生：向步骤1-2)得到的产物中加入80uL含100mM盐酸羟胺的乙腈体积分数为30％的乙腈水溶液，750rpm下混匀1min，然后在60℃下恒温衍生15-60min，制得测试样。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，其中，液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱；
流动相：A相为0.2mM的氟化铵水溶液，B相为0.2mM的氟化铵甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，40％B；0-4min，60％B；4-5.7min，67％B；5.7-8.3min，70％B；8.3-8.5min，90％B；8.5-11.3min，90％B；11.3-11.5min，40％B；11.5-13min，40％B；
流速：0.7mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；气帘气30psi，喷雾气50psi，辅助加热气60psi，温度500℃，离子化电压：+5500V/-4500V，碰撞气：10psi。
7.根据权利要求1所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，其中，内标萃取液的制备方法为：将双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8混合并通过甲醇稀释得到内标萃取液，内标萃取液中双氢睾酮-13C3、雄烯二酮-13C3、脱氢表雄酮-13C3、17-羟孕酮-13C3、孕酮-13C3、皮质酮-d8、可的松-13C3、雌酮-13C3、雌二醇-d4、雌三醇-d3、17-羟孕烯醇酮-d2 13C2、醛固酮-d8的浓度依次为75ng/mL、100ng/mL、1500ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、15ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、1μg/mL和60ng/mL。
8.根据权利要求1所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，其中，干血斑样本包括待测干血斑样本和用于构建标准曲线的干血斑标准曲线样本。
9.根据权利要求8所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，其中，待测干血斑样本的制备方法为：用移液器吸取待测血液样品滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑样本。
10.根据权利要求9所述的基于衍生化的干血斑中12种类固醇激素的检测方法，其特征在于，干血斑标准曲线样本的制备方法包括以下步骤：
S1、制备人造空白全血：
S1-1、使用肝素抗凝全血，以3000rpm的速度离心5min，弃去上层血浆后，加入等体积生理盐水溶液，充分混匀清洗后；
S1-2、再次以3000rpm离心5min，吸取并丢弃上层清液，重复此操作5次，即得红细胞；
S1-3、将红细胞与去激素人血清按照55:45比例混合，混匀后即得人造空白全血；
S2、制备全血标准曲线溶液：
取标准品双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质酮、可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-羟孕烯醇酮母液、醛固酮和雄烯二酮母液用甲醇进行稀释得到标准溶液，将标准溶液加入到人造空白全血中配制得到一系列浓度的全血标准曲线溶液；
S3、制备干血斑标准曲线样本：用移液器吸取全血标准曲线溶液滴于滤纸片采样圈的中心位置，然后将滤纸片在室温下正面朝上自然晾干，即得干血斑标准曲线样本；
通过将血斑标准曲线样本按照所述步骤1)进行前处理后，再供液相色谱串联质谱的方法进行检测，构建得到标准曲线。
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