CN111398446A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，通过一步液‑液萃取获得待测溶液；通过在流动相中添加电解质氟化铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率；再采用质谱正‑负切换扫描模式同时检测12种激素，检测种类多，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，无需固相萃取或衍生，5.0min之内可完成12种激素的分离和检测，为临床上内分泌疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的 方法

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法。

背景技术

类固醇激素是一类脂溶性的小分子激素，又称为甾体激素。它们是由胆固醇经过一系列的酶催化代谢产生的，在调节机体新陈代谢、免疫调节、性功能调节，生长发育等方面起到重要的作用。类固醇激素按照生理功能可分为孕激素、盐皮质激素、糖皮质激素、雌激素和雄激素。孕酮、皮质酮、醛固酮属于盐皮质激素，17α-羟孕酮和皮质醇属于糖皮质激素，雌酮和雌二醇属于雌激素，硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮和雄烯二酮均属于雄激素。

孕酮(P4)又被称为黄体酮，来源是肾上腺、黄体和胎盘。孕酮检测可以确定排卵期，评估不孕、评估子宫异常出血、高危妊娠胎盘健康状况等。孕酮病理性增高可见于妊娠毒血症、先兆子痫、原发性高血压、先天性17-羟孕酮生成障碍等；孕酮病理性降低见于先兆流产、宫外孕、早产、闭经、胎儿发育迟缓、死胎、不孕症、黄体功能不全、肾上腺或甲状腺功能严重失调等。17α-羟孕酮和孕酮是其它类固醇激素的前提物质，其含量增多有助于受孕。

醛固酮(ALD)是一种盐皮质激素，主要作用于肾脏，进行钠离子及水份的再吸收。整体来说，醛固酮为一种增进肾脏对于离子及水分再吸收作用的一种激素，为肾素-血管紧张素系统的一部分。醛固酮增高见于原发性醛固酮增多症，其降低见于肾上腺皮质功能降低、原发性单一醛固酮减少症、高钠饮食、自主神经功能紊乱、妊娠高血压综合征等。

皮质醇(F)是一种糖皮质激素，也是身体中最重要的抗压力应激激素，保护身体免受过度压力损害。皮质醇会提高血糖水平，给身体提供逃避伤害所需的能量，同时与胰岛素协同工作为细胞提供产生能量所需的葡萄糖。高皮质醇含量的人，免疫能力非常弱，因为皮质醇可抑制大多数免疫细胞，特别是白细胞。总之，皮质醇通过两种相反但又相互联系的调节活动来维持生命：一是释放并激活身体的防御机制；二是关闭和调节同样的机制保护防止反应过头而引起细胞损害或死亡。

硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)主要由肾上腺皮质分泌，卵巢也会少量分泌，是所有性激素的前驱物质。研究显示DHEA-S具有抗衰老、维持心血管健康、降低血脂、降低血压、提升免疫系统功能、增强骨骼、使皮肤光滑细致、增强记忆力、增加活力等功效。DHEA-S在20-30岁之间处于峰值，随着年龄的增长会显著下降。

睾酮(T)主要由卵巢及肾上腺分泌，其含量增高多见于特发性性早熟(男性患儿可达成人水平)，肾上腺增生(男性患儿)，肾上腺皮质肿瘤，女性睾酮增多会出现多毛、痤疮、月经稀少或不孕等。睾酮可直接或先转变为活性更强的双氢睾酮(DHT)，与生精细胞的雄激素受体结合，促进精子的生成，还可刺激生殖器官的发育，促进男性第二性征出现并维持其正常形态。在男性成年后，双氢睾酮如果过量，将会产生诸如青春痘，脱发等病理现象。此外，中老年前列腺增生也与双氢睾酮有着密切的关系。

雄烯二酮(AD)是一种雄激素，具有激素原的特性，主要用于评估肾上腺、卵巢或睾丸功能。在男性，90％由肾上腺皮质分泌。在女性雄烯二酮的50％来自卵巢、50％来自肾上腺。女性的雄烯二酮过高可能引起雄激素过多症。成年男性雄烯二酮测定水平略低同龄女性，显著增高可能表明肾上腺皮质增生和性腺肿瘤。

雌酮(E1)和雌二醇(E2)是由卵巢主要合成的两种雌激素，其生理作用就是雌激素的生理作用。雌酮在育龄妇女含量较雌二醇低，但肥胖男女性、近停经妇女雌酮含量相对较雌二醇高，停经后E1/E2比值显著升高。雌酮为停经后妇女体内主要的雌激素，经由脂肪细胞转化而来。雌二醇是主要的雌性激素，负责调节女性特征、附属性器官的成熟和月经-排卵周期，促进乳腺导管系统的产生。雌二醇不仅对生殖和性功能有重要作用，也影响例如骨骼的其它器官。

以上类固醇激素的检测可有助于诊断一些内分泌紊乱的疾病，如先天性肾上腺皮质增生症，醛固酮增多症和库欣综合征等疾病。目前，免疫法是国内临床实验室最常用的方法，但缺点是特异性差，异嗜性抗体等干扰物质常导致假阳性或假阴性结果，而且免疫法通量低，一次只能测定一种激素。而LC-MS/MS技术同时检测保留时间和目标物母离子和碎片离子，特异性更高，潜在的干扰更少，特别适合复杂生物基质的定量检测。但是，目前的LC-MS/MS技术检测类固醇激素时仍然存在诸多问题，前处理多采用固相萃取或衍生法，操作复杂，成本高，在临床应用比较受限。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法。

本发明的技术方案如下：

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，

所述12种类固醇激素分别为：孕酮(P4)、17α-羟孕酮(17α-OHP4)、皮质酮(CORT)、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、雄烯二酮(AD)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、醛固酮(ALD)和皮质醇(F)；

上述12种类固醇激素对应的同位素内标物分别为：孕酮-d9(P4-d9)、17α-羟孕酮-d8(17α-OHP4-d8)、皮质酮-d8(CORT-d8)、脱氢表雄酮-d2(DHEA-d2)、硫酸脱氢表雄酮-d6(DHEAS-d6)、睾酮-d3(T-d3)、双氢睾酮-d3(DHT-d3)、雄烯二酮-13C3(AD-13C3)、雌酮-d4(E1-d4)、雌二醇-d4(E2-d4)、醛固酮-d4(ALD-d4)和皮质醇-d4(F-d4)；

将血清样本与所有待测物的内标溶液混合，通过一步液-液萃取获得待测溶液，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的12种类固醇激素，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，准确计算出12种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：含50～400μM氟化铵水溶液；流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Kinetex XB-C18(3.0×50mm，2.6μm)；(美国Phenomenex公司)

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在3.0-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.5-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至60:40。

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了12种类固醇激素及其对应同位素内标。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了氟化铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测类固醇激素的灵敏度更高，前处理只需一步液-液萃取，简单快捷且成本低，5分钟之内可同时检测12种重要类固醇激素。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为含50～100μM氟化铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为含50μM氟化铵水溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用含50～400μM氟化铵水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：KinetexXB-C18(3.0×50mm，2.6μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用孕酮-d9(P4-d9)、17α-羟孕酮-d8(17α-OHP4-d8)、皮质酮-d8(CORT-d8)、脱氢表雄酮-d2(DHEA-d2)、硫酸脱氢表雄酮-d6(DHEAS-d6)、睾酮-d3(T-d3)、双氢睾酮-d3(DHT-d3)、雄烯二酮-13C3(AD-13C3)、雌酮-d4(E1-d4)、雌二醇-d4(E2-d4)、醛固酮-d4(ALD-d4)和皮质醇-d4(F-d4)，作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中12种类固醇激素时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～1.0mL/min，优选为为0.5mL/min。

进一步地，柱温为40～60℃，优选为50℃。

更进一步地，进样体积为2～10μL，优选为5μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：水(含50μM氟化铵)；

流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)(美国Phenomenex公司)；

采用梯度洗脱的方式，见表1；流速为0.5mL/min，柱温为50℃，进样体积为5μL；

表1流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了12种类固醇激素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。

表2类固醇激素质谱参数

本发明提及的血清为人或动物血清。

在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入萃取液进行萃取，离心处理后取上清液经氮气流吹干后与复溶液混合，再次离心处理后取上清液。

优选地，萃取液为甲基叔丁基醚。

优选地，复溶液为40％～60％甲醇水溶液，在不影响本发明效果的情况下，例如，50％甲醇水溶液。

在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μL血清于1.5mL离心管，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入800μL甲基叔丁基醚进行萃取，在15℃，15000r/min离心5min后取700μL上清液经氮气流吹干后与80μL 50％甲醇水溶液混合，在15000r/min离心3min后取60μL上清液。

在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；再加入800μL甲基叔丁基醚，高速振荡(最大振速)5min；转速15000r/min 15℃离心5min；转移700μL上清液于另一离心管中，氮气吹至近干(无需加热)后；加入80μL 50％甲醇(盖好盖子)，高速振荡2min，15000r/min离心3min，移取60μL上清液于内衬管中待上样检测，进样量5μL。

在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

称取各同位素内标物，包括孕酮-d9(P4-d9)、17α-羟孕酮-d8(17α-OHP4-d8)、皮质酮-d8(CORT-d8)、脱氢表雄酮-d2(DHEA-d2)、硫酸脱氢表雄酮-d6(DHEAS-d6)、睾酮-d3(T-d3)、双氢睾酮-d3(DHT-d3)、雄烯二酮-13C3(AD-13C3)、雌酮-d4(E1-d4)、雌二醇-d4(E2-d4)、醛固酮-d4(ALD-d4)和皮质醇-d4(F-d4)，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和1mg/mL的同位素内标母液；

上述各同位素内标母液再以甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL孕酮-d9(P4-d9)、50ng/mL17α-羟孕酮-d8(17α-OHP4-d8)、200ng/mL皮质酮-d8(CORT-d8)、200ng/mL脱氢表雄酮-d2(DHEA-d2)、100000ng/mL硫酸脱氢表雄酮-d6(DHEAS-d6)、100ng/mL睾酮-d3(T-d3)、50ng/mL双氢睾酮-d3(DHT-d3)、100ng/mL雄烯二酮-13C3(AD-13C3)、10ng/mL雌酮-d4(E1-d4)、20ng/mL雌二醇-d4(E2-d4)、40ng/mL醛固酮-d4(ALD-d4)和1000ng/mL皮质醇-d4(F-d4)的同位素内标SI溶液；

取100μL SI溶液，加入900μL甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

进一步地，制备混合内标工作液时，采用的甲醇水溶液为30％～70％甲醇水溶液；优选为45％～55％甲醇水溶液；更优选为50％甲醇水溶液。

在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，除了硫酸脱氢表雄酮-d6(DHEAS-d6)，再用50％甲醇水溶液将其余各同位素内标母液稀释成10μg/mL的使用浓度，再将各使用浓度配制成混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL50％甲醇，混合均匀即为混合内标工作液。

表3混合内标SI溶液的配制

在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

以纯甲醇将孕酮(P4)、17α-羟孕酮(17α-OHP4)、皮质酮(CORT)、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、雄烯二酮(AD)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、醛固酮(ALD)和皮质醇(F)配制成浓度依次为2mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和4mg/mL L的标准品母液。

上述各标准品母液再以甲醇水溶液配制成包含有200ng/mL孕酮(P4)、200ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、400ng/mL皮质酮(CORT)、400ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、200000ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、200ng/mL睾酮(T)、100ng/mL双氢睾酮(DHT)、200ng/mL雄烯二酮(AD)、40ng/mL雌酮(E1)、40ng/mL雌二醇(E2)、40ng/mL醛固酮(ALD)和4000ng/mL皮质醇(F)的混合标准S0溶液。

将上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的八个浓度点为：

孕酮(P4)、17α-羟孕酮(17α-OHP4)、睾酮(T)和雄烯二酮(AD)的浓度相同，八个浓度依次为：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml和10ng/ml；

皮质酮(CORT)和脱氢表雄酮(DHEA)的浓度相同，八个浓度依次为：0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.4ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml；

硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)八个浓度依次为：50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml；

双氢睾酮(DHT)八个浓度依次为：0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml；

雌酮(E1)、雌二醇(E2)和醛固酮(ALD)八个浓度依次为：0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml和2ng/ml；

皮质醇(F)八个浓度依次为：1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。

进一步地，制备标准品溶液时，采用的甲醇水溶液为30％～70％甲醇水溶液；优选为45％～55％甲醇水溶液；更优选为50％甲醇水溶液。

更进一步地，制备标准品溶液时，空白血清基质溶液为5％～20％甲醇水溶液；优选为5％～15％甲醇水溶液；更优选为10％甲醇水溶液。

在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，除了硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)，再用50％甲醇水溶液将其余各标准品母液稀释成10μg/mL的使用浓度，再将各使用浓度配制成混合标准液S0溶液(详见表4)，混合均匀备用。

表4混合标准液S0的配制

取50μL混合标准S0溶液加入至950μL 10％甲醇水溶液中作为第一个高值浓度点S8，再逐级稀释至S1(详见表5)，各标曲点的浓度如表5中所列。

表5标曲的配制及浓度

(注：浓度单位均为ng/mL)

每个浓度点样品取200μL，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；再加入800μL甲基叔丁基醚，高速振荡(最大振速)5min；转速15000r/min 15℃离心5min；转移700μL上清液于另一离心管中，氮气吹至近干(无需加热)后；加入80μL 50％甲醇(盖好盖子)，高速振荡2min，15000r/min离心3min，移取60μL上清液于内衬管中待上样检测，进样量5μL。

本发明提及的甲醇水溶液的浓度一般指体积浓度。

本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有12种类固醇激素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，

QC(L)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至2000倍；

QC(M)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至400倍；

QC(H)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至50倍。

在一种方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以5％～20％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以5％～15％

甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

在一种更优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

QC(L)中包含：0.1ng/mL孕酮(P4)、0.1ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、0.2ng/mL皮质酮(CORT)、0.2ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、100ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、0.1ng/mL睾酮(T)、0.05ng/mL双氢睾酮(DHT)、0.1ng/mL雄烯二酮(AD)、0.02ng/mL雌酮(E1)、0.02ng/mL雌二醇(E2)、0.02ng/mL醛固酮(ALD)和2ng/mL皮质醇(F)。

QC(M)中包含：0.5ng/mL孕酮(P4)、0.5ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、1ng/mL皮质酮(CORT)、1ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、500ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、0.5ng/mL睾酮(T)、0.25ng/mL双氢睾酮(DHT)、0.5ng/mL雄烯二酮(AD)、0.1ng/mL雌酮(E1)、0.1ng/mL雌二醇(E2)、0.1ng/mL醛固酮(ALD)和10ng/mL皮质醇(F)。

QC(H)中包含：5ng/mL孕酮(P4)、5ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、10ng/mL皮质酮(CORT)、10ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、5000ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、5ng/mL睾酮(T)、2.5ng/mL双氢睾酮(DHT)、5ng/mL雄烯二酮(AD)、1ng/mL雌酮(E1)、1ng/mL雌二醇(E2)、1ng/mL醛固酮(ALD)和100ng/mL皮质醇(F)。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，只需通过一步液-液萃取便可获得待测溶液；通过在流动相中添加电解质氟化铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率；再采用质谱正-负切换扫描模式同时检测12种激素，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成12种激素的分离和检测，为临床上内分泌疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。

附图说明

图1为12种类固醇激素标准品的选择离子流色谱图；

图2为血清样本中12种类固醇激素的选择离子流色谱图。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1：

一、实验材料与仪器

1.材料

样本来自于武汉亚洲心脏病医院2018年3月份门诊收集的血清样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGALabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；HPLC级甲基叔丁基醚(Fisher，美国)；色谱柱Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)(美国Phenomenex公司)。

(3)标准品：P4、17α-OHP4、CORT、T、DHT、AD、E1和F购自德国Dr.Ehrensorfer公司；ALD、ALD-d4、P4-d9、CORT-d8、17α-OHP4-d8、DHEA-d2、F-d4、E1-d4、E2-d4购自TRC公司；DHEA和T-d3购自Cerilliant公司；DHEAS、DHEAS-d6和AD-13C3购自IsoSciences公司；E2和DHT-d3购自Sigma公司。

(4)质控品：含有12种类固醇激素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。

二、液质条件

(1)色谱条件：流动相A：水(含50μM氟化铵-水溶液)；流动相B：甲醇。色谱柱型号：Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.5mL/min，柱温为50℃，进样体积为5μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了12种类固醇激素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。

三、实验过程

(1)标准品配制：

准确称量3-5mg各标准品于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成标准品母液浓度，再用50％甲醇水溶液将11种标准品母液稀释成10μg/mL的使用浓度(DHEAS使用浓度即标准品母液浓度10000μg/mL)，再将各使用浓度配制成混合标准S0溶液(详见表4)。

将上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液(10％甲醇水溶液)配制成八个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：

取50μL混合标准S0溶液加入至950μL 10％甲醇水溶液中作为第一个高值浓度点S8，再逐级稀释至S1(详见表5)，各标曲点的浓度如表5中所列。

(2)混合内标工作液配制

准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成同位素内标母液浓度，再用50％甲醇水溶液将11种同位素内标母液稀释成10μg/mL的使用浓度(DHEAS-d6使用浓度即同位素内标母液浓度1000μg/mL)，再将各使用浓度配制成混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL50％甲醇，混合均匀得到混合内标工作液。

(3)质控品配制：

取上述混合标准S0溶液以10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

QC(L)中包含：0.1ng/mL孕酮(P4)、0.1ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、0.2ng/mL皮质酮(CORT)、0.2ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、100ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、0.1ng/mL睾酮(T)、0.05ng/mL双氢睾酮(DHT)、0.1ng/mL雄烯二酮(AD)、0.02ng/mL雌酮(E1)、0.02ng/mL雌二醇(E2)、0.02ng/mL醛固酮(ALD)和2ng/mL皮质醇(F)。

QC(M)中包含：0.5ng/mL孕酮(P4)、0.5ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、1ng/mL皮质酮(CORT)、1ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、500ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、0.5ng/mL睾酮(T)、0.25ng/mL双氢睾酮(DHT)、0.5ng/mL雄烯二酮(AD)、0.1ng/mL雌酮(E1)、0.1ng/mL雌二醇(E2)、0.1ng/mL醛固酮(ALD)和10ng/mL皮质醇(F)。

QC(H)中包含：5ng/mL孕酮(P4)、5ng/mL17α-羟孕酮(17α-OHP4)、10ng/mL皮质酮(CORT)、10ng/mL脱氢表雄酮(DHEA)、5000ng/mL硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、5ng/mL睾酮(T)、2.5ng/mL双氢睾酮(DHT)、5ng/mL雄烯二酮(AD)、1ng/mL雌酮(E1)、1ng/mL雌二醇(E2)、1ng/mL醛固酮(ALD)和100ng/mL皮质醇(F)。

(4)样品处理

1)标准品前处理：每个浓度点样品取200μL，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；再加入800μL甲基叔丁基醚，高速振荡(最大振速)5min；转速15000r/min15℃离心5min；转移700μL上清液于另一离心管中，氮气吹至近干(无需加热)后；加入80μL 50％甲醇(盖好盖子)，高速振荡2min，15000r/min离心3min，移取60μL上清液于内衬管中待上样检测，进样量5μL。

2)血清样品前处理：取200μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；再加入800μL甲基叔丁基醚，高速振荡(最大振速)5min；转速15000r/min15℃离心5min；转移700μL上清液于另一离心管中，氮气吹至近干(无需加热)后；加入80μL50％甲醇(盖好盖子)，高速振荡2min，15000r/min离心3min，移取60μL上清液于内衬管中待上样检测，进样量5μL。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各200μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。

四、方法验证

本发明的检测方法中，12种类固醇激素的标准品与血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为12种类固醇激素标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中12种类固醇激素的选择离子流色谱图。

1.标准曲线：

采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中类固醇激素待测物的浓度。12种类固醇激素在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，详见表6。

表6 12种类固醇激素的保留时间及线性范围

2.最低定量限

最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。因类固醇激素在人体含量低且结构相似，对方法的灵敏度和特异性要求很高，本发明人对检测方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足12种男女性激素同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表7。

表7方法定量下限数据表

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。随机选取一例人血清样品，其中1个不加标准品，其它2个分别加入低和高2个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，计算回收率结果，见表8。结果显示，血清中12种类固醇激素的加标回收率结果在85％-115％之间，均满足要求。

表8血清中12种类固醇激素的加标回收率结果(单位ng/mL)

4.精密度试验：取正常人血清样品一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定12种类固醇激素的浓度，连续三日统计批内和批间精密度，计算结果见表9。

表9批内、批间精密度试验结果(单位ng/mL)

五、讨论

本发明采用UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的孕酮(P4)、17α-羟孕酮(17α-OHP4)、皮质酮(CORT)、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、雄烯二酮(AD)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、醛固酮(ALD)和皮质醇(F)共12种类固醇激素。目前关于激素检测，前处理多采用固相萃取或衍生法，操作复杂，成本高，在临床应用受限。本方法是将血清样本与所有待测物的内标溶液混合，通过一步液-液萃取获得待测溶液；通过在流动相中添加电解质氟化铵，提高了某些目标化合物的离子化效率；采用质谱正-负切换扫描模式同时检测12种激素。

本发明考察了12种类固醇激素在血清中的批内批间精密度和加标回收率，结果均在85％-115％之间，符合要求；同时，因激素在人体内含量极低，对灵敏度的要求很高，本方法最低定量限可达10pg/mL，基本满足临床检测需求。

本发明方法灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成12种激素的分离和检测，为临床上内分泌疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中12种类固醇激素的方法，

所述12种类固醇激素分别为：孕酮、17α-羟孕酮、皮质酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、雌二醇、醛固酮和皮质醇；

上述12种类固醇激素对应的同位素内标物分别为：孕酮-d9、17α-羟孕酮-d8、皮质酮-d8、脱氢表雄酮-d2、硫酸脱氢表雄酮-d6、睾酮-d3、双氢睾酮-d3、雄烯二酮-13C3、雌酮-d4、雌二醇-d4、醛固酮-d4和皮质醇-d4；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的12种类固醇激素，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比，使用同位素内标法定量，准确计算出12种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：含50～400μM氟化铵水溶液；流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Kinetex XB-C18 3.0×50mm，2.6μm；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在3.0-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.5-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至60:40；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了12种类固醇激素及其对应同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为含50～100μM氟化铵水溶液；流速为0.2～1.0mL/min；柱温为40～60℃；进样体积为2～10μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为含50μM氟化铵水溶液；所述流速为0.5mL/min；所述柱温为50℃；所述进样体积为5μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清为人或动物血清。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入萃取液进行萃取，离心处理后取上清液经氮气流吹干后与复溶液混合，再次离心处理后取上清液；优选地，萃取液为甲基叔丁基醚；优选地，复溶液为40％～60％甲醇水溶液，更优选为50％甲醇水溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μL血清于1.5mL离心管，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入800μL甲基叔丁基醚进行萃取，在15℃，15000r/min离心5min后取700μL上清液经氮气流吹干后与80μL 50％甲醇水溶液混合，在15000r/min离心3min后取60μL上清液。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，

所述混合内标工作液按照如下方法制备：

称取各同位素内标物，包括孕酮-d9、17α-羟孕酮-d8、皮质酮-d8、脱氢表雄酮-d2、硫酸脱氢表雄酮-d6、睾酮-d3、双氢睾酮-d3、雄烯二酮-13C3、雌酮-d4、雌二醇-d4、醛固酮-d4和皮质醇-d4，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和1mg/mL的同位素内标母液；

上述各同位素内标母液再以甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL孕酮-d9、50ng/mL17α-羟孕酮-d8、200ng/mL皮质酮-d8、200ng/mL脱氢表雄酮-d2、100000ng/mL硫酸脱氢表雄酮-d6、100ng/mL睾酮-d3、50ng/mL双氢睾酮-d3、100ng/mL雄烯二酮-13C3、10ng/mL雌酮-d4、20ng/mL雌二醇-d4、40ng/mL醛固酮-d4和1000ng/mL皮质醇-d4的同位素内标SI溶液；

取100μL SI溶液，加入900μL甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述标准品按照如下方法制备：

以纯甲醇将孕酮、17α-羟孕酮、皮质酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、雌二醇、醛固酮和皮质醇配制成浓度依次为2mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和4mg/mL的标准品母液；

上述各标准品母液再以甲醇水溶液配制成包含有200ng/mL孕酮、200ng/mL17α-羟孕酮、400ng/mL皮质酮、400ng/mL脱氢表雄酮、200000ng/mL硫酸脱氢表雄酮、200ng/mL睾酮、100ng/mL双氢睾酮、200ng/mL雄烯二酮、40ng/mL雌酮、40ng/mL雌二醇、40ng/mL醛固酮和4000ng/mL皮质醇的混合标准S0溶液；

将上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的八个浓度点为：

孕酮、17α-羟孕酮、睾酮和雄烯二酮的浓度相同，八个浓度依次为：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml和10ng/ml；

皮质酮和脱氢表雄酮的浓度相同，八个浓度依次为：0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.4ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml；

硫酸脱氢表雄酮八个浓度依次为：50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml；

双氢睾酮八个浓度依次为：0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml；

雌酮、雌二醇和醛固酮八个浓度依次为：0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml和2ng/ml；

皮质醇八个浓度依次为：1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，

所述甲醇水溶液为30％～70％甲醇水溶液；优选为45％～55％甲醇水溶液；更优选为50％甲醇水溶液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述空白血清基质溶液为5％～20％甲醇水溶液；优选为5％～15％甲醇水溶液；更优选为10％甲醇水溶液。

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