CN113049719A - 一种检测游离睾酮的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种检测游离睾酮的方法及试剂盒。针对现有技术中游离睾酮检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高和检测下限难以突破的技术问题，本申请提供一种检测游离睾酮的方法，将检测样品超滤、固相萃取再进行高效液相色谱串联质谱分析，用检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归，计算游离睾酮含量，本方案所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低。本申请还提供了一种用于游离睾酮检测的试剂盒，使检测步骤简化。

Description

一种检测游离睾酮的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种检测游离睾酮的方法及试剂盒。

背景技术

睾酮在人体的睾酮正常值要根据男女性别来决定，同时也要根据年龄来决定，成年人男性一般是在14～25.4nmol/L，而成年女性则是在1.3～2.8nmol/L。如果是男性儿童，一般是大于8.8nmol/L，而女性儿童一般大于0.7nmol/L。在女性和儿童体内的含量总浓度非常低，比正常男性低一个数量级，而游离的睾酮只占总量的2％不到，因此，要求游离睾酮的体内检测方法具有更高的灵敏度。游离的睾酮含量比总的睾酮更具有临床上的诊断意义，测定男性体内游离睾酮水平可代表生物活性睾酮水平的高低，游离睾酮在调查老年男性的雄激素状态方面具有更大的信息，更适合用于研究女性的雄激素过剩、性腺功能障碍、男性的性发育和青春期障碍，多囊卵巢综合征，以及监测雌激素治疗的反应等。血清中游离睾酮的含量很低，所以前处理过程必须能够从血清基质中高效提取目标物，并在保留、浓缩目标物的前提下去除尽可能多的杂质，减少干扰。

临床生物样品中内源性激素的测定方法主要采用放射免疫分析法和化学发光免疫法等免疫分析法，如中国专利申请公布号CN109633180A，发明名称为“一种游离睾酮化学发光检测试剂盒及其制备方法”，公开了一种游离睾酮化学发光检测试剂盒及其制备方法，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；R1试剂包括缓冲液I和链霉亲和素磁珠，链霉亲和素磁珠在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.05～0.2％；R2试剂包括化学发光标记物标记的游离睾酮-牛血清白蛋白和缓冲液Ⅱ，化学发光标记物标记的游离睾酮-牛血清白蛋白在缓冲液Ⅱ中的浓度为50～100ng/mL；R3试剂包括生物素标记的游离睾酮抗体和缓冲液Ⅲ，生物素标记的游离睾酮抗体在缓冲液Ⅲ中的浓度为150～500ng/mL。该方案由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应，导致其灵敏度与特异性和准确度都不足，准确度与精密度很差。

目前国内外关于体内定量分析游离睾酮的文献报道较少，通常测的都是总的睾酮的含量，一般采用气质联用的方法来检测，如中国专利申请公布号CN109633041A，发明名称为“衍生化HPLC法测定药物中双氢睾酮的方法”，公开了一种衍生化HPLC法测定药物中双氢睾酮的方法，包括以下步骤：以苯甲酰卤类化合物为衍生化试剂对待测药物中的双氢睾酮进行衍生化反应，得到含有双氢睾酮衍生化产物的样品；以所述含有双氢睾酮衍生化产物的样品配制供试品溶液，将所述供试品溶液用高效液相色谱进行检测，所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器。该方案样品前处理过程中需要进行衍生化处理，操作较为复杂，所需样品体积大。

关于游离睾酮的测定的技术难点既在于提取后定量分析方法，还在于在前处理过程中将游离的睾酮和与结合蛋白的睾酮分离开再进行提取。有文献报道的游离化合物和蛋白结合的化合物的分离技术都是采用超滤法或是平衡透析法来达到分离得目的，然后再进行液液萃取来完成样品的制备，而最低定量下限为0.05ng/mL。

鉴于以上所述对游离睾酮微量提取、快速检测及检测精准和检测限更低的需求，需要一种所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、精密度强的游离睾酮检测方法。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术中游离睾酮检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高和检测下限难以突破的技术问题，本申请提供一种检测游离睾酮的方法，将检测样品超滤、固相萃取再进行高效液相色谱串联质谱分析，用检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归，计算游离睾酮含量，本方案所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低。本申请还提供了一种用于游离睾酮检测的试剂盒，使检测步骤简化。

2、技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：

本发明的一种检测游离睾酮的方法，包含以下步骤：

步骤1：制备检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液：

将检测样品、标准曲线样品和质控样品加入缓冲液后超滤，分别得到超滤液后加入内标，分别于固相萃取柱中萃取，得到萃取液后吹干再复溶，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液；

步骤2：对检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液进行高效液相色谱串联质谱分析，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液和内标的色谱峰面积；

步骤3：数据分析：

分析所述色谱峰面积，校正曲线以1/x²为加权系，用所述检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归；得游离睾酮含量。

进一步的，所述高效液相色谱条件为：

进样器温度：15℃；柱温：40℃；运行时间：1.6min；洗脱梯度：

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

进一步的，当5％的流动相B起始至1.2min时升至95％的流动相B进行梯度洗脱。

进一步的，多反应监测参数表格：

扫描模式：多反应离子监测正离子模式；离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；雾化气：50psi；辅助加热器：50psi；气帘气：40psi；碰撞气：10；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃。

进一步的，所述标准曲线样品包括0.01、0.02、0.1、1、10、50、90、100ng/mL八个浓度梯度；

所述质控样品包括0.03、40、80ng/mL三个浓度梯度。

进一步的，所述超滤条件中稳定剂为PBS缓冲液(pH7.2)；所述萃取柱为HLB小柱；所述萃取条件为：淋洗，用10％的甲醇溶液淋洗两次；洗脱，用90％的甲醇溶液洗脱两次。

一种检测游离睾酮的试剂盒，包括以下试剂：

标准品溶液：睾酮储备液；

内标：Testosterone-d3溶液；

稳定剂；

替代基质；

洗脱液：甲醇；

流动相；

所述流动相中包含甲酸溶液和乙酸铵溶液。

进一步的，所述流动相包括流动相A和流动相B；

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

进一步的，所述洗脱液包括强洗脱液和弱洗脱液；所述强洗脱液为90％的甲醇溶液所述弱洗脱液为10％的甲醇溶液。

进一步的，所述稳定剂为PBS缓冲液，pH7.2；所述替代基质为4％BSA溶液。

3、有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明的一种检测游离睾酮的方法，样品不需要衍生化处理，所需的样品体积仅200μL，使用超滤分离出游离的睾酮，接着再用固相萃取法提取睾酮进行检测，提取游离睾酮的操作时间更短，效率更好。固相萃取比文献报道常用的液液萃取的方法提取效率更高，一方面剔除杂质更完全质，减少干扰，并能富集分析物，来提高检测的灵敏度；另一方面能减少强挥发性有机试剂的使用，避免对实验人员的危害。前述步骤提取出的纯度高的微量游离睾酮，经超高效液相色谱串联质谱法分析，其特异性高，干扰低的特点可以来提高检测结果的灵敏度，从而使定量下限做的更低，检测方法的准确度和精密度都得到提高，本方案超高效液相色谱串联质谱法分析时间缩短了至1.6min，增加了分析的通量和线性范围，提高了分析的灵敏度和结果的准确度和精密度，定量下限可做到0.01ng/mL。

(2)本发明的一种检测游离睾酮的试剂盒，仅需200μL血清样本即可达到检测游离睾酮浓度的目的，现有文献报道的测游离睾酮的血清样品量至少为500μL。试剂盒中的流动相中含有甲酸和乙酸铵溶液，进行梯度洗脱时，能够得到很好的分离和保留且峰形良好，灵敏度高，所需分析时间更短，且样品前处理更加方便，提高了检测灵敏度。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

本实施例的一种检测游离睾酮的方法，具体方案如下。

1.实验材料

1.1对照品及试剂

对照品：睾酮(Sigma Aldrich)、Testosterone-d3(100μg/mL，Isosiences)；

试剂：Bovine Serum Albuminv(BSA，生物级，Sigma)、甲醇(HPLC级，Merck)、乙腈(HPLC级，Merck)、甲酸(HPLC级，Aladdin)、乙酸铵(HPLC级，Aladdin)、PBS缓冲液,pH7.2(ThermoFisher)。

1.2主要仪器设备和耗材

LC-MS/MS，AB Sciex Quad TRAP 5500TM质谱和Waters超高效液相色谱系统；

色谱柱，ACQUITY

BEH C18 2.1×50mm 1.7μm(Waters)；

漩涡混合器(美国SI Vortex Genie 2)；

台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司TGL-1)；

96通道正压装置(TECEN)；

超滤离心管(密理博0.5mL/10KD)；

96孔板；

分析天平(最小量程为0.000001g)；

Waters Oasis HLB固相萃取柱。

2.溶液及试剂的配置

2.1.储备液和工作液的配置：

(1)精确称取睾酮对照品10.0mg，于10mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释到刻度，得到1mg/mL的储备液。

(2)然后用甲醇溶液依次稀释到：0.5、1、5、50、500、2500、4500、5000ng/mL的标准曲线工作液和0.5、1.5、2000、4000ng/mL的质控样品的工作液。

(3)将100μg/mL的Testosterone-d3用甲醇稀释到2μg/mL，作为内标的工作液。

2.2.流动相和其它溶液的配置：

(1)强洗溶液(90％乙腈溶液)：将100mL水与900mL乙腈混合。

(2)弱洗溶液(10％乙腈溶液)：将900mL水与100mL乙腈混合。

(3)流动相A(含0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水：乙腈(v:v，95:5)溶液)：将1mL甲酸和100μL 20mol/L的乙酸铵溶液加入到950mL水和50mL乙腈中混合。

(4)流动相B(含0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水：乙腈(v:v，5:95)溶液)：将1mL甲酸和100μL 20mol/L的乙酸铵加入到50mL水和950mL乙腈中混合。

(5)10％的甲醇溶液：将100mL甲醇与900mL水混合。

(6)90％的甲醇溶液：将900mL甲醇与100mL水混合。

(7)4％BSA溶液：称取适量BSA粉末，使用超纯水溶解配置4％(w/v)BSA溶液，该溶液作为制备标准曲线和质控样品的替代基质。

(8)20mol/L乙酸铵溶液：称取适量的乙酸铵粉末，使用超纯水溶解到20mol/L的浓度。

2.3.校准曲线和质控样品的配置：

睾酮属于内源性物质，空白样本血清中存在内源性干扰，因此采用4％的BSA代替血清配置标准曲线和质控样品。

将上述所配置的工作液分别取10μL加入到490μL的基质中配置成0.01、0.02、0.1、1、10、50、90、100ng/mL的标准曲线样品和0.03、40、80ng/mL的质控样品。可用这些质控样品考察方法的精密度和精密度，提取回收率，及稳定性。

3.样品的制备：

分别取200μL血清样品及标准曲线和质控样品加入200μL PBS缓冲液混合后，平衡静置5min后，然后转移到超滤离心管中，在4℃，1800g的条件下离心大约1小时。同时将Supel^TM-Select HLB固相萃取柱先用依次用1mL甲醇和1mL纯水Supel^TM-Select HLB固相萃取柱进行活化，备用。上样，取200μL的超滤液和20μL的内标工作液于Supel^TM-Select HLB固相萃取柱，待水样完全流出后，然后用正压装置抽真空10min；淋洗，用300μL 10％的甲醇溶液淋洗两次；洗脱，用300μL 90％的甲醇溶液洗脱两次并收集洗脱液；用N₂吹干后加入100μL的甲醇溶液复溶，摇匀后直接上清进样。

本实施例使用的默克密理博超滤离心管0.5mL/10KD超滤管在1800g的转速离心下，分离出游离的睾酮，接着再用固相萃取法提取睾酮进行检测。提取游离睾酮的操作时间更短，效率更好。固相萃取比文献报道常用的液液萃取的方法提取效率更高，一方面剔除杂质更完全质，减少干扰，并能富集分析物，来提高检测的灵敏度；另一方面能减少强挥发性有机试剂的使用，避免对实验人员的危害。

4.仪器条件：

4.1.液相条件：

本实施例选用ACQUITY

BEH C18 2.1×50mm 1.7μm(Waters)色谱柱，分别使用甲醇和乙腈作为有机相对梯度和不同pH和缓冲盐流动相体系进行比较研究，结果发现同时在乙腈和水中加入0.1％甲酸和2mM乙酸铵溶液并在5％的有机相起始至1.2min时升至95％的有机相进行梯度洗脱时，能够得到很好的分离和保留且峰形良好，有较高灵敏度，本方法在UPLC液相系统下分析时间可以缩短到1.6min，能够快速高效的分析游离的睾酮达到很好的定量分析效果。具体液相条件如下：

进样器温度：15℃；

柱温：40℃；

运行时间：1.6min；

洗脱梯度：

4.2.质谱条件：

将储备液用甲醇稀释到1μg/mL，进行母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量进行逐一优化和确认使目标化合物具有最高灵敏度，优化结果如下：

扫描模式：多反应离子检测(正离子模式)；

离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；

雾化气：50psi；辅助加热器：50psi；

气帘气：40psi；碰撞气：10；

喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；

多反应监测参数表格：

本法首次使用的超高效夜相色谱系统和AB Sciex Quad TRAP 5500TM质谱，色谱柱为Waters ACQUITY

BEH C18 2.1×50mm 1.7μm,缩短了分析的时间至1.6min,增加了分析的通量和线性范围，提高了分析的灵敏度和结果的准确度和精密度，定量下限可做到0.01ng/mL。

5.数据处理：

分析物和内标的保留时间，色谱图采集和色谱图的积分由Analyst软件(版本号1.6.3)进行处理。数据统计由Analyst软件(版本号1.6.3)和Microsoft Office Excel2013进行处理。校正曲线以1/x²为加权系，用峰面积比值(分析物/内标)对校正标样中分析物的浓度进行线性回归。

本实施例的UF-SPE-LC-MS/MS测试血清中游离睾酮的含量，在200μL的样品用量上依次采用超滤法和固相萃取来提取分析物。该方法样品在0.01ng/mL的浓度下，信噪比(S/N)远远大于5，灵敏度比现有方法至少提高了5至10倍。样品在0.01～100ng/mL的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r＞0.99。该方法中定量下限的检测结果如下详见表1，结果显示定量下限的结果符合要求；该方法采用加标回收的方法来评估正确度测试，结果祥见表2，加标回收率均在可接受范围(±15％)内，该方法的正确度结果可以接受；该方法的批内和批间精密度和准确度均小于15％，符合要求，结果祥见表3；该方法考察了处理后样品在15℃进样盘的稳定性，室温放置24小时，冻融三次，在-80℃储存14天的稳定性，结果详见表4至表7，样品的稳定性得以验证。

表1 Testosterone定量下限检测结果

从表1可以看出：定量下限的准确度和精密度均在15％以内，符合要求。

表2 Testosterone方法正确度测试

从表2中可以看出：低浓度回收率均在80～120％，中、高浓度回收率均在85～115％符合要求。

表3 Testosterone方法精密度数据

从表3可以看出：批内、批间精密度CV值≤15％，符合要求。

表4 Testosterone在处理后样品的上清在15℃的2天再进样盘的稳定性

从表4可以看出：％偏差在±15％以内，％变异系数小于15.0％，结果符合要求；Testosterone在处理后样品的上清在15℃的2天再进样盘的稳定性得以验证。

表5 Testosterone样品在室温放置至少24小时的稳定性

从表5可以看出：％偏差在±15％以内，％变异系数小于15.0％，结果符合要求；Testosterone样品在室温放置至少24小时的稳定性得以验证。

表6 Testosterone样品经过三次冻融循环的稳定性

从表6可以看出：％偏差在±15％以内，％变异系数小于15.0％，结果符合要求；Testosterone样品经过三次冻融循环的稳定性性得以验证。

表7 Testosterone样品在-80℃储存14天的稳定性

从表7可以看出：％偏差在±15％以内，％变异系数小于15.0％，结果符合要求；Testosterone样品在在-80℃储存14天的稳定性得以验证。

实施例2

本实施例的一种检测游离睾酮的试剂盒，用于实现实施例1的方法，具体试剂如表8所示：

表8检测游离睾酮的试剂盒的组成

睾酮储备液用甲醇溶液依次稀释到：0.5、1、5、50、500、2500、4500、5000ng/mL即得标准曲线工作液和1.5、2000、4000ng/mL的质控样品的工作液。

工作液用4％的BSA稀释到：0.01、0.02、0.1、1、10、50、90、100ng/mL即得到标准曲线样品和0.3、40、80ng/mL的质控样品。

将甲醇用纯水稀释至体积分数10％，即得弱洗脱液；将甲醇用纯水稀释至体积分数90％，即得强洗脱溶液。

本实施例的试剂盒，仅需200μL血清样本即可达到检测游离睾酮浓度的目的。

Claims (10)

1.一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：包含以下步骤：

步骤1：制备检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液：

将检测样品、标准曲线样品和质控样品加入缓冲液后超滤，分别得到超滤液后加入内标，分别于固相萃取柱中萃取，得到萃取液后吹干再复溶，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液；

步骤2：对检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液进行高效液相色谱串联质谱分析，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液和内标的色谱峰面积；

步骤3：数据分析：

分析所述色谱峰面积，校正曲线以1/x²为加权系，用所述检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归；得游离睾酮含量。

2.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：所述高效液相色谱条件为：

进样器温度：15℃；柱温：40℃；运行时间：1.6min；洗脱梯度：

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵。

3.根据权利要求2所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：当5％的流动相B起始至1.2min时升至95％的流动相B进行梯度洗脱。

4.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：多反应监测参数表格：

扫描模式：多反应离子监测正离子模式；离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；雾化气：50psi；辅助加热器：50psi；气帘气：40psi；碰撞气：10；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃。

5.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：

所述标准曲线样品包括0.01、0.02、0.1、1、10、50、90、100ng/mL八个浓度梯度；

所述质控样品包括0.03、40、80ng/mL三个浓度梯度。

6.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：所述超滤条件中稳定剂为PBS缓冲液；所述萃取柱为HLB小柱；所述萃取条件为：淋洗，用10％的甲醇溶液淋洗两次；洗脱，用90％的甲醇溶液洗脱两次。

7.一种实现权利要求1-6任一项所述检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：

标准品溶液：睾酮储备液；

内标：Testosterone-d3溶液；

稳定剂；

替代基质；

洗脱液：甲醇；

流动相；

所述流动相中包含甲酸溶液和乙酸铵溶液。

8.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述流动相包括流动相A和流动相B；

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵。

9.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液包括强洗脱液和弱洗脱液；所述强洗脱液为体积分数90％的甲醇溶液，所述弱洗脱液为体积分数10％的甲醇溶液。

10.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为PBS缓冲液，pH7.2；所述替代基质为4％BSA溶液。