CN113189242A - 一种检测血清中游离雌三醇含量的方法及试剂盒 - Google Patents

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CN113189242A CN202110508473.2A CN202110508473A CN113189242A CN 113189242 A CN113189242 A CN 113189242A CN 202110508473 A CN202110508473 A CN 202110508473A CN 113189242 A CN113189242 A CN 113189242A
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Abstract

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种检测血清中游离雌三醇含量的方法及试剂盒。针对现有技术血清中游离雌三醇检测时难以电离，衍生化处理后易挥发，不适用于临床检测，以及空白基质不易获得，BSA溶液、PBS缓冲溶液或活性炭吸附后的血清作为替代的空白基质时，影响检测准确度和回收率计算高于理论值的技术问题，本申请采用雌三醇的同位素化合物作为替代分析物配置血清中的标准曲线，研究确定了雌三醇的同位素化合物和雌三醇测定响应的平行关系，无需衍生化处理，样品使用量少，特异性高，无干扰，准确度和精密度提高。本申请还提供了一种用于检测血清中游离雌三醇含量检测的试剂盒，使检测步骤简化，检测结果灵敏度能低至0.02ng/mL。

Description

一种检测血清中游离雌三醇含量的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种检测血清中游离雌三醇含量的方法及试剂盒。
背景技术
雌三醇是雌二醇的代谢产物，血清雌三醇是一种甾体类激素，前体来源于胎儿肾上腺和肝，由胎盘合成分泌，是妊娠期的主要雌激素。血清雌三醇水平的高低与胎盘－胎儿单位及胎儿有效的代谢功能有密切关系，直接影响胎儿的生长发育。母体血清中游离的雌三醇水平能准确反映胎儿胎盘功能的变化。测定孕妇血清雌三醇，是判断胎盘功能、预测胎儿状态及监护胎儿安全较可信的方法。血清游离雌三醇是高危妊娠监测，过期妊娠胎盘功能评估，预测早产的可靠指标。血清游离雌三醇与甲胎蛋白(AFP)、人绒毛促性腺激素(β-HCG)联合检测，可进行中期唐氏筛查。也常用于非孕妇女肿瘤流行病学筛查、乳腺癌及宫颈癌的风险评估等。
临床生物样品中内源性激素的测定方法主要采用放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELSIA)、荧光免疫分析法(TRFIA)等免疫分析法，但由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应，缺乏抗体的特异性，对于存在低浓度或结构类似的物质，其灵敏度与准确度都不足，准确度与精密度很差。现有技术中虽有高效液相色谱串联质谱检测雌三醇的报道，但雌三醇在ESI源中难以电离，为提高分析物在质谱电离中的离子化效率，提高检测的灵敏度，一般都需在样品前处理过程中进行衍生化的操作，如中国专利申请公布号CN112611827A，发明名称为“同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法”，公开了一种新型衍生化试剂3-甲基-8-喹啉磺酰氯对目标雌激素分析物进行化学衍生后，用于超高效液相色谱-串联质谱检测，该方案所提供的方法采用3-甲基-8-喹晽磺酰氯对雌激素的酚羟基特异性衍生化，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入目标雌激素分析物中，雌激素衍生物的pKa值增加，增强了离子化效率，提高了雌激素质谱检测的灵敏度。但该法需要进行衍生化的操作，使分析物变成易挥发的成分，步骤繁琐，不适用于临床的检测。
除了衍生化操作带来的问题，目前人血清中游离雌三醇浓度的检测一般都采用BSA溶液或PBS缓冲溶液作为替代的空白基质，在方法验证之前，首先需考察替代标准曲线与真实基质真实分析物之间的响应差异，确保分析方法的准确度，步骤较为繁琐。检测结果准确度之外，还需考虑回收率计算的问题。血清中的游离雌三醇属于内源性物质，进行内源性物质的检测与分析时，如何准确的计算回收率是一个必须解决的问题。若采用常规的对照品法进行回收率计算，样品中自身存在的内源性目标分析物会干扰回收率的结果，无法计算得到真实的样品回收率。尤其当样品中本底浓度高，增量浓度低时，干扰更大，其回收率计算值往往会高于理论的100％。也有研究采用替代基质或者是活性炭吸附后的内源性基质作为空白基质，如上述专利说明书第0125段公开了“空白血清基质溶液为活性炭吸附人血清”，但是替代基质在提取回收率，基质效应方面也无法完全确保与真实基质保持一致，用活性炭吸附内源性物质的基质，也无法剔除与蛋白结合的分析物，且容易引入的活性炭成分对分析物是否存在干扰都需进一步的考察。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有技术血清中游离雌三醇检测时雌三醇在ESI源中难以电离，需进行衍生化处理，分析物变成易挥发的成分，步骤繁琐，不适用于临床检测，以及空白基质不易获得，BSA溶液、PBS缓冲溶液或活性炭吸附后的血清作为替代的空白基质时，影响检测准确度和回收率计算高于理论值的技术问题，本申请提供一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，采用雌三醇的同位素化合物作为替代化合物对照品配置血清中的标准曲线，研究确定了雌三醇的同位素化合物和雌三醇测定响应的平行关系，无需经过衍生化处理，且样品使用量少，该方法的特异性高，无干扰，检测方法的准确度和精密度都得到提高。本申请还提供了一种用于检测血清中游离雌三醇含量的试剂盒，检测步骤简化，可使的检测结果灵敏度能低至0.02ng/mL。
2、技术方案
为达到上述目的，提供的技术方案为：
本发明的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，包含以下步骤：
步骤1：制备检测样品上清液、替代分析物标准曲线样品和质控样品上清液：
将检测样品、替代分析物标准曲线样品和替代分析物质控样品分别加入缓冲液和内标，混匀，分别用萃取剂萃取，得到萃取液后吹干再复溶，得检测样品上清液、替代分析物标准曲线样品上清液和替代分析物质控样品上清液；
步骤2：对检测样品上清液、替代分析物标准曲线样品上清液和替代分析物质控样品上清液进行超高效液相色谱串联质谱分析，得检测样品上清液中分析物及其内标的色谱峰面积、替代分析物标准曲线样品上清液中替代分析物及其内标的色谱峰面积、以及替代分析物质控样品上清液中替代分析物及其内标的色谱峰面积；
步骤3：数据分析：
分析所述色谱峰面积，替代校正曲线以1/x2为加权系，用所述替代分析物标准曲线样品上清液中替代分析物及其内标的色谱峰面积的比值对替代分析物标准曲线样品中替代分析物的浓度进行线性回归得到检测样品上清液中游离雌三醇浓度计算公式y＝ax+b，其中，
x为检测样品上清液中雌三醇浓度，y为检测样品上清液中分析物的色谱峰面积和内标的色谱峰面积的比值，a为校正曲线的斜率，b为校正曲线y轴的截距；
所述替代分析物为雌三醇的同位素化合物。
进一步的，所述同位素化合物为雌三醇-2,3,4-13C3。
进一步的，所述步骤1中包括使用萃取剂萃取的步骤，所述萃取剂为甲基叔丁基谜和乙酸乙酯的混合溶液，所述甲基叔丁基谜和乙酸乙酯的体积比为1:2。本方案的萃取剂，萃取率更高，去除的杂质干扰更完全，提高了液液萃取效率，一方面，剔除杂质更完全质，减少干扰，并能富集分析物，提高检测的灵敏度；另一方面，避免使用相关文献报道的为提高萃取效率而使用二氯甲烷或乙醚等毒性较大的强萃取剂，减少了对实验人员的危害。
进一步的，所述萃取的具体步骤为：分别取检测样品、替代分析物标准曲线样品和替代分析物质控样品加入缓冲液和内标混合，加入萃取剂；使用复溶剂复溶，所述复溶剂为体积分数50％的甲醇溶液，所述复溶剂和萃取液的体积比为1:9。优选地，分别取200μL检测样品、替代分析物标准曲线样品和替代分析物质控样品加入80μL缓冲液和20μL内标混合，加入1mL萃取剂；使用复溶剂复溶，所述复溶剂为体积分数50％的甲醇溶液，所述复溶剂和萃取液的体积比为1:9。
进一步的，步骤1中，所述缓冲液为pH值9.2的乙酸铵缓冲液；所述内标为200ng/mL的雌三醇-d6溶液。
进一步的，所述方法还包括替代分析物标准曲线的绘制，以替代分析物浓度为横坐标，以替代分析物与相应内标物峰面积比值为纵坐标，绘制替代分析物标准曲线。
进一步的，所述替代分析物标准曲线包括0.02、0.2、1、5、10、50、90和100ng/mL八个浓度梯度；所述替代分析物质控样品包括0.06、2和80ng/mL三个浓度梯度。
进一步的，所述超高效液相色谱的条件为：
进样器温度：15℃；柱温：40℃；运行时间：2min；洗脱梯度：
Figure BDA0003059324520000031
所述流动相A：含体积分数0.05％氨水和0.1mM氟化铵的水溶液；优选地，将50μL氨水和100μL 1mol/L的氟化铵溶液加入到1000mL水混合。
所述流动相B：甲醇和乙腈体积比为1:1的溶液。优选的，使用Waters ACQUITY
Figure BDA0003059324520000032
BEH C18 2.1×50mm 1.7μm；将1000mL甲醇和1000mL乙腈混合，配成甲醇和乙腈体积比为1:1的溶液。本方案首次采用碱性流动相，促进目标的离子化，在流动相中添加了适量的体积分数为0.05％的氨水和0.1mM的氟化铵缓冲盐试剂，提高了分析物在质谱中的离子化效率，改善了峰形，分析的灵敏度得以提高，在200μL的样品消耗量下，定量下限首次可做到低至0.02ng/mL，能满足血清中的游离雌三醇的分析要求。采用梯度洗脱的方式，提高了样品的分离度，减少了干扰，增加了分析的通量和线性范围，使得检测结果的准确度和精密度都得以进一步的提升。
进一步的，所述质谱的条件中多反应监测参数为：
Figure BDA0003059324520000041
扫描模式：多反应离子检测负离子模式；离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；雾化气：60psi；辅助加热器：60psi；气帘气：40psi；碰撞气：10；喷雾电压：-5000V；离子源温度：500℃。本方案优化了超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析法的检测和前处理条件。
一种检测血清中游离雌三醇含量的试剂盒，包括以下试剂：
替代分析物，所述替代分析物为雌三醇的同位素化合物，优选的，所述同位素化合物为雌三醇-2,3,4-13C3；
内标，优选的，所述内标为200ng/mL的雌三醇-d6溶液，溶剂为甲醇；
萃取剂，优选的，所述萃取剂为体积比为1:2的甲基叔丁基谜和乙酸乙酯的混合溶液；
缓冲液，优选的，所述缓冲液为pH值9.2的乙酸铵缓冲液。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，采用替代分析物法结合超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测人体血清中游离的雌三醇的含量，采用雌三醇的同位素化合物作为替代化合物对照品配置标准曲线，研究确定了雌三醇的同位素化合物和Estriol测定的响应的平行关系，本方案无需经过衍生化处理，样品使用量少，特异性高，无干扰，检测方法的准确度和精密度提高。采用同位素对照品替代实际对照品，进行回收率的考察，有效解决了干扰问题。同位素对照品的优势在于其在样品中不存在，不受样品中本底干扰，其化学结构、性质以及质谱裂解方式均与实际对照品相似，可用来代替对照品计算回收率。同时采用替代分析物法可使用真实的基质配置校准曲线，可以使得检测结果更准确，避免了一般用替代基质和真实基质之间在提取回收率，基质效应等之间的差异，还可以有效地消除基质的于扰，降低基质效应的影响，简化试验过程。为临床血清样品中游离雌三醇定量分析提供了分析结果更准确和操作简单分析快速的方法，也为内源性物质代谢组学的方法学研究提供了一个新的思路。
(2)本发明的一种检测血清中游离雌三醇含量的试剂盒，仅需200μL血清样本即可达到检测血清中游离雌三醇含量的目的，样品前处理更加简单，仅需要一步液液萃取过程，就能有效提取样本中的雌激素，时间缩短，通过色谱条件优化，提高了定量的特异性和准确性。本实施例的萃取剂，萃取率更高，去除的杂质干扰更完全，提高了液液萃取效率，一方面剔除杂质更完全质，减少干扰，并能富集分析物，提高检测的灵敏度；另一方面避免使用文献报道的，为提高萃取效率而使用二氯甲烷或乙醚等毒性较大的强萃取剂，减少了对实验人员的危害。采用同位素对照品替代实际对照品，进行回收率的考察，有效解决了干扰问题。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
本实施例的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，具体方案如下。
1.实验材料
1.1.对照品及试剂
对照品：雌三醇(TRC)、雌三醇-d6(IsoSciences)、雌三醇-2,3,4-13C3(IsoSciences)。
试剂：甲醇(HPLC级，Merck)、乙腈(HPLC级，Merck)、异丙醇(HPLC级，Merck)、氨水(AR级，上海凌峰)、三氟乙酸(HPLC级，Fluka)、氟化铵(HPLC级，Sigma)、乙酸铵(HPLC级，Aladdin)、甲基叔丁基醚(HPLC级，Sigma)、乙酸乙酯(HPLC级，Sigma)，蒸馏水(二次蒸馏水，屈臣氏)。
1.2.主要仪器设备和耗材
LC-MS/MS，AB Sciex Quad TRAP 5500TM质谱和Waters超高效液相色谱系统；
色谱柱，
Figure BDA0003059324520000051
BEH C18 2.1×50mm 1.7μm(Waters)；
漩涡混合器(美国SI Vortex Genie 2)、台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司TGL-1)、96通道正压装置(TECEN)、96孔板、分析天平(最小量程为0.000001g)。
2.溶液及试剂的配置
2.1.储备液和工作液的配置
精确称取雌三醇-2,3,4-13C3作为替代分析物对照品10.0mg，于10mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释到刻度，得到1mg/mL的雌三醇-2,3,4-13C3储备液。然后用甲醇溶液依次稀释到：1.00、10、50、250、500、2500、4500、5000ng/mL作为替代标准曲线工作液和3.00、100、4000ng/mL的替代质控样品的工作液。
精确称取一定质量的雌三醇用甲醇稀释到1mg/mL。
精确称取一定质量的雌三醇-d6用甲醇稀释到200ng/mL，作为内标的工作液。
2.2.流动相和其它溶液的配置
强洗溶液(90％乙腈溶液)：将1000mL水、1000mL乙腈、1000mL甲醇、1000mL异丙醇和800μL三氟乙酸混合；
弱洗溶液(10％乙腈溶液)：将900mL水与100mL乙腈混合。
流动相A(含0.05％氨水和0.1mM氟化铵的水溶液)：将50μL氨水和100μL 1mol/L的氟化铵溶液加入到1000mL水混合；
流动相B(甲醇:乙腈(v:v，50:50)溶液)：将500mL甲醇和500mL乙腈混合。
萃取剂，甲基叔丁基谜：乙酸乙酯(v:v，1:2)：将100mL甲基叔丁基谜和200mL乙酸乙酯混合。
复溶液，50％甲醇：将100mL甲醇和100mL纯水混合。
其它试剂，1mol/L的氟化铵溶液：称取一定量的氟化铵粉末加入适量的水溶成1mol/L的溶液。
乙酸铵缓冲液(pH 9.2)：称取一定量的乙酸铵粉末加入适量的水溶成10mM的溶液,并用氨水调节道pH为9.2。
3.替代校准曲线和质控样品的配置
雌三醇属于内源性物质，空白样本血清中存在内源性干扰，因此用同位素化合物雌三醇-2,3,4-13C3作为替代分析物将上述所配置的替代标准曲线工作液分别取10μL加入到490μL的基质中配置成0.02、0.2、1、5、10、50、90、100ng/mL的替代标准曲线样品和0.06、2、80ng/mL的替代质控样品。可用这些质控样品考察方法的精密度和精密度，提取回收率，及稳定性。
4.样品的制备
分别取200μL血清样品及替代标准曲线和质控样品加入80μL乙酸铵缓冲液(pH9.2)和20μL 200ng/mL的雌三醇-d2的内标工液混合后，加入1mL的甲基叔丁基谜：乙酸乙酯(v:v，1:2)萃取剂，涡旋5min，在4℃，12000g的条件下离心15min。取上清液900μL用N2吹干后加入100μL的50％甲醇/水溶液复溶，摇匀后直接上清进样。
5.仪器条件
5.1.液相条件
进样器温度：15℃；
色谱柱：
Figure BDA0003059324520000071
BEH C18 2.1×50mm 1.7μm(Waters)；
柱温：40℃；
运行时间：2min；
洗脱梯度：
Figure BDA0003059324520000072
5.2.质谱条件
扫描模式：多反应离子检测(负离子模式)
离子源：涡轮喷雾 电离模式：电喷雾离子化
雾化气：60psi 辅助加热器：60psi
气帘气：40psi 碰撞气：10
喷雾电压：-5000V 离子源温度：500℃
6.多反应监测参数表格
Figure BDA0003059324520000073
7.数据处理
替代分析物、分析物和内标的保留时间，色谱图采集和色谱图的积分由Analyst软件(版本号1.6.3)进行处理。数据统计由Analyst软件(版本号1.6.3)和Microsoft OfficeExcel 2013进行处理。替代校正曲线以1/x2为加权系，用峰面积比值(替代分析物/内标)对替代校正标样中分析物的浓度进行线性回归得到血清中游离雌三醇的浓度计算公式如下：y＝ax+b,x＝Estriol的浓度(ng/mL)，y＝Estriol/Estriol-d6峰面积比值，a＝替代校正曲线的斜率，b＝替代校正曲线y轴的截距。
8.响应因子的考察
分别将1mg/mL的替代分析物雌三醇-2,3,4-13C3和分析物雌三醇用甲醇稀释到10.0ng/mL的浓度各平行交叉进样6针，考察两者之间的响应关系，响应因子为两者的峰面积之比，两者之间的响应因子的平均值偏差应该在±5％之内，％CV应该在5％以内。结果详见下表1，可说明替代分析物雌三醇-2,3,4-13C3和雌三醇在质谱中的响应无差异，可用雌三醇-2,3,4-13C3作为替代分析物来分析血清中雌三醇的浓度。
9.选择性干扰的考察
应该使用至少6个受试者的适宜的空白血清基质来证明选择性，它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20％,并低于内标响应的5％时,通常即可以接受。该方法的干扰考察结果如下表2，可见使用替代分析物法干扰结果远低于接受标准，符合接受要求，可证明采用该方法的干扰更低
10.结果与讨论
本法首次建立了一种替代分析物法结合超高效液相色谱串联质谱测试血清中游离雌三醇的含量,结果表明在200μL的样品用量采用液液萃取来提取游离的雌三醇。该方法样品在0.02g/mL的浓度下，信噪比远远大于10。样品在0.02～100ng/mL的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r＞0.99。该方法中定量下限的检测结果如下详见表3，结果显示定量下限的结果符合要求。该方法采用加标回收的方法来评估正确度测试，结果祥见表4，加标回收率均在可接受范围(±15％)内，该方法的正确度结果可以接受。该方法的批内和批间精密度和准确度均小于15％,符合要求，结果祥见表5；
综上所述，该替代分析物法测游离雌三醇的浓度样品制备操作比较简单，分析方法灵敏度高、检测限低，精密度和准确度高，重复性好，专属性强，线性范围广，检测时间较短，可以适用于检测人体血清中游离雌三醇的含量用于临床的医疗诊断。
表1 Estriol-2,3,4-13C3和Estriol的响应因子检测结果
Figure BDA0003059324520000081
表2 6个受试者的适宜的空白血清基质中Estriol-2,3,4-13C3的干扰评价
Figure BDA0003059324520000091
表3替代Estriol-2,3,4-13C3定量下限检测结果
Figure BDA0003059324520000092
表4替代Estriol-2,3,4-13C3方法正确度测试
Figure BDA0003059324520000093
表5替代Estriol-2,3,4-13C3方法精密度数据
Figure BDA0003059324520000094
Figure BDA0003059324520000101
实施例2
本实施例的一种检测血清中游离雌三醇含量的试剂盒，用于实现实施例1的方法，具体试剂如表6所示：
表6检测血清中游离雌三醇含量的试剂盒的组成
组成 成分 规格
替代分析物 雌三醇-2,3,4-<sup>13</sup>C<sub>3</sub> 1mg/mL
内标 雌三醇-d<sub>6</sub> 200ng/mL
萃取剂 甲基叔丁基谜和乙酸乙酯 甲基叔丁基谜:乙酸乙酯(v:v，1:2)
缓冲液 乙酸铵缓冲液 10mM；pH 9.2
本实施例的试剂盒，还包括复溶剂和氟化铵溶液。所述复溶剂为体积分数50％的甲醇溶液。所述氟化铵溶液的浓度为1mol/L。
1mg/mL的雌三醇-2,3,4-13C3还可当做储备液，用甲醇溶液依次稀释到1.00、10、50、250、500、2500、4500和5000ng/mL即为替代标准曲线工作液。用甲醇溶液依次稀释到3.00、100和4000ng/mL即为替代质控样品的工作液。
本实施例的试剂盒，仅需200μL血清样本即可达到检测血清中游离雌三醇含量的目的，样品前处理更加简单，仅需要一步液液萃取过程，就能有效提取样本中的雌激素，时间缩短，通过色谱条件优化，提高了定量的特异性和准确性。本实施例的萃取剂，萃取率更高，去除的杂质干扰更完全，提高了液液萃取效率，一方面剔除杂质更完全质，减少干扰，并能富集分析物，提高检测的灵敏度；另一方面，避免使用为提高萃取效率而选择的二氯甲烷或乙醚等毒性较大的强萃取剂，减少了对实验人员的危害。采用同位素对照品替代实际对照品，进行回收率的考察，有效解决了干扰问题。同位素对照品的优势在于其在样品中不存在，不受样品中本底干扰，其化学结构、性质以及质谱裂解方式均与实际对照品相似，可用来代替对照品计算回收率。同时还可以有效地消除基质的于扰，降低基质效应的影响，简化试验过程。

Claims (10)

1.一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：制备检测样品上清液、替代分析物标准曲线样品上清液和质控样品上清液；
步骤2：对检测样品上清液、替代分析物标准曲线样品上清液和替代分析物质控样品上清液进行超高效液相色谱串联质谱分析，得相应色谱峰面积；
步骤3：数据分析：
分析色谱峰面积，替代校正曲线以1/x2为加权系，用所述替代分析物标准曲线样品上清液中替代分析物及其内标的色谱峰面积的比值对替代分析物标准曲线样品中替代分析物的浓度进行线性回归得到检测样品上清液中游离雌三醇含量计算公式y＝ax+b，其中，
x为检测样品上清液中雌三醇浓度，y为检测样品上清液中分析物的色谱峰面积和内标的色谱峰面积的比值，a为校正曲线的斜率，b为校正曲线y轴的截距；
所述替代分析物为雌三醇的同位素化合物。
2.根据权利要求1所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述同位素化合物为雌三醇-2,3,4-13C3。
3.根据权利要求1所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述步骤1中包括使用萃取剂萃取的步骤，所述萃取剂为甲基叔丁基谜和乙酸乙酯的混合溶液，所述甲基叔丁基谜和乙酸乙酯的体积比为1:2。
4.根据权利要求3所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：
所述萃取的具体步骤为：分别取检测样品、替代分析物标准曲线样品和替代分析物质控样品加入缓冲液和内标混合，加入萃取剂；使用复溶剂复溶，所述复溶剂为体积分数50％的甲醇溶液，所述复溶剂和萃取液的体积比为1:9。
5.根据权利要求4所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH值9.2的乙酸铵缓冲液；所述内标为200ng/mL的雌三醇-d6溶液。
6.根据权利要求4所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述方法还包括替代分析物标准曲线的绘制，以替代分析物浓度为横坐标，以替代分析物与相应内标物峰面积比值为纵坐标，绘制替代分析物标准曲线。
7.根据权利要求6所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：
所述替代分析物标准曲线包括0.02、0.2、1、5、10、50、90和100ng/mL八个浓度梯度；所述替代分析物质控样品包括0.06、2和80ng/mL三个浓度梯度。
8.根据权利要求1所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱的条件为：
进样器温度：15℃；柱温：40℃；运行时间：2min；洗脱梯度：
Figure FDA0003059324510000021
所述流动相A：含体积分数0.05％氨水和0.1mM氟化铵的水溶液；
所述流动相B：甲醇和乙腈体积比为1:1的溶液。
9.根据权利要求1所述的一种检测血清中游离雌三醇含量的方法，其特征在于：所述质谱的条件中多反应监测参数为：
Figure FDA0003059324510000022
扫描模式：多反应离子检测负离子模式；离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；雾化气：60psi；辅助加热器：60psi；气帘气：40psi；碰撞气：10；喷雾电压：-5000V；离子源温度：500℃。
10.一种实现权利要求1-9任一项所述检测血清中游离雌三醇含量方法的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：
替代分析物，所述替代分析物为雌三醇的同位素化合物；
内标；
萃取剂；
缓冲液。
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