CN114414696B - 一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法。针对现有技术中雌激素在生物样本和人体内以痕量水平存在，在干血片样本中含量极低，雌激素化合物极性较小，在质谱中ESI和APCI源中离子化效率不高，直接检测灵敏度不高的技术问题，本申请提供一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，包括衍生化试剂、第一萃取剂和第二萃取剂，萃取和衍生化前处理结合超高效液相色谱串联质谱能快速简便准确的检测出干血片中痕量的雌激素。本申请还提供了一种测定干血片中多种雌激素的方法，用第一萃取剂将雌激素从干血片中萃取，再衍生化，用第二萃取剂将衍生后的雌激素再次萃取，增大了通量，提高了分析效率。

Description

一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法。

背景技术

雌激素是女性体内重要的性激素，具有重要而广泛的生理作用，研究表明雌激素不仅有维持女性生殖功能和第二性征的生理作用，而且对人体的新陈代谢的调节、神经系统的发育、骨骼的生长等有一定程度的影响，雌激素其主要包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）及雌三醇（E3）3种。雌酮在人体中的水平是评估性早熟，老人骨骼风险评估的重要指标，雌二醇是妇女体内生物活性最强的雌激素，雌三醇是雌二醇和雌酮的代谢产物，前体来源于胎儿肾上腺和肝，由胎盘合成分泌，是妊娠期的主要雌激素，雌三醇水平的高低与胎盘和胎儿有效的代谢功能有密切关系，直接影响胎儿的生长发育。测定孕妇体中雌激素，是判断胎盘功能、预测胎儿状态及监护胎儿安全较可信的方法。是高危妊娠监测，过期妊娠胎盘功能评估，预测早产的可靠指标。雌激素水平异常还是骨质疏松症、神经性厌食症、心血管疾病、乳腺癌，唐氏综合征，女性性发育不全，多囊卵巢综合征，男性乳房发育等的主要原因之一。因此，对人体中的雌激素定性定量分析，能够更早发现疾病的异常变化，有助于研究疾病产生机制、临床诊断以及开发医疗药物。

临床生物样品中内源性激素的测定方法主要采用放射免疫分析法和化学发光免疫法等免疫分析法，但由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应，容易受相关内源性类固醇、脂质和基质效应的干扰，其对于雌激素测定的特异性和可靠性仍然存在疑问导致其灵敏度与准确度都不足以及放射性危害等缺陷，再加之各测定方法学间的可比性差等原因。超高效液相色谱串联质谱法分析法的特异性高，干扰低的特点可以来提高检测结果的灵敏度，可同时检测三种激素的浓度，通量大，检测方法的准确度和精密度更高。如中国专利申请公布号CN109470791A，发明名称为“一种高效液相色谱-串联质谱检测血清雌激素的方法及试剂盒”，公开的试剂盒包括洗脱液、稀释液、萃取剂、质控品和色谱柱，萃取剂为乙酸乙酯/正己烷；检测血清中雌激素的方法，包括如下步骤：样本预处理；色谱分离；质谱检测；利用系列浓度的雌激素标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中雌激素的含量。但是，干血片样本中雌激素含量极低，化合物极性都较小，在质谱中ESI和APCI源中离子化效率不高，直接检测的灵敏度不高，因此需要在前处理过程中进行衍生化来提高分析的响应。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术中雌激素在生物样本和人体内以痕量水平存在，在干血片样本中含量极低，雌激素化合物极性较小，在质谱中ESI和APCI源中离子化效率不高，直接检测灵敏度不高的技术问题，本申请提供一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，萃取和衍生化前处理结合超高效液相色谱串联质谱能快速简便准确的检测出干血片中痕量的雌激素。本申请还提供了一种测定干血片中多种雌激素的方法，用第一萃取剂将雌激素从干血片中萃取，再衍生化，用第二萃取剂将衍生后的雌激素再次萃取，增大了通量，提高了分析效率。

2、技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：

本发明的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：校准品、质控品、内标准品、衍生化试剂、缓冲液、第一萃取剂、第二萃取剂。

进一步的，所述衍生化试剂为N-三甲基硅烷基咪唑、五氟苯甲酰氯、五氟苄基羟胺或丹磺酰氯。

进一步的，第一萃取剂为甲醇、乙腈中的一种或两种；第二萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种或几种。

优选的，第一萃取剂为体积比为50:50的甲醇和乙腈的混合溶液。

进一步的，所述缓冲液为碳酸钠、磷酸钠或硼酸钠缓冲液。

进一步的，所述校准品为雌酮、雌二醇、雌三醇；所述内标准品为雌酮-d4、雌二醇-d3、雌三醇-d3。

进一步的，还包括甲醇、乙腈、甲酸、牛血清白蛋白。

一种测定干血片中多种雌激素的方法，使用所述的试剂盒，包括如下步骤：

用第一萃取剂将雌激素从干血片中萃取出的步骤，得第一萃取样品；

用衍生化试剂将所述第一萃取样品衍生化处理的步骤，得衍生化样品；

用第二萃取剂将雌激素从衍生化样品中萃取出的步骤，得第二萃取样品；

将第二萃取样品离心后取上清液，用高效液相色谱串联质谱检测的步骤。

进一步的，

所述高效液相色谱条件为：进样器温度：4 ℃；柱温：40 ℃；运行时间：3.5 min；

所述流动相A：0.1%甲酸水溶液；

所述流动相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。

进一步的，所述质谱条件为：

毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂温度：650 ℃；脱溶剂气：800 L/hr；锥孔气：150 L/hr；扫描模式：多反应离子检测，正离子模式。

3、有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

（1）本发明的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，采用超高效液相色谱串联质谱法同时检测干血片样本中雌酮、雌二醇和雌三醇三种雌激素含量，所需采血量少，样品容易采集，相对于血清等液体样本更易于保存和运输。可以用来检测病人的雌酮、雌二醇、雌三醇三种雌激素的浓度来筛查雌激素过多以及雌激素缺乏等引起的相关疾病，有更准确的临床参考和诊断价值。

（2）本发明的一种测定干血片中多种雌激素的方法，使用的超高效夜相色谱和串联质谱系统UPLC I-Class/TQ-S同时对雌酮、雌二醇和雌三醇三种雌激素进行分析检测，增大了通量，提高了分析效率，分析的灵敏度和结果的准确度、精密度都得到极大的提高。运用有机试剂萃取和衍生化前处理方法结合超高效液相色谱串联质谱法能快速简便准确的检测出干血片中痕量的雌酮、雌二醇、雌三醇三种雌激素的浓度，将雌酮、雌二醇和雌三醇测定的定量下限降至5 pg/mL，比现有文献的报道的低了4到20倍。

4、具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：

表1 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

本实施例中，其中，组份1的校准品包括雌酮、雌二醇、雌三醇；内标准品包括雌酮-d4、雌二醇-d3、雌三醇-d3。

组份4的丹磺酰氯的浓度为100 μL 2 mg/mL。

组份5的Na2CO3缓冲液的浓度为100 mmol，pH为10.5。

组份6的第一萃取剂为30 mL。

组份7的第二萃取剂为150 mL。

本实施例的试剂盒，所需采血量少，样品容易采集，相对于血清等液体样本更易于保存和运输。可以用来检测病人的雌酮、雌二醇、雌三醇三种雌激素的浓度来筛查雌激素过多以及雌激素缺乏等引起的相关疾病，有更准确的临床参考和诊断价值。

实施例2

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，衍生化试剂为N-三甲基硅烷基咪唑。

表2测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

实施例3

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，衍生化试剂为五氟苯甲酰氯。

表3 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

实施例4

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，衍生化试剂为五氟苄基羟胺。

表4 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

通过实施例1~4的衍生化试剂，均可以衍生第一萃取液萃取后的雌激素，在第二萃取剂萃取后，进行LC-MS/MS分析，通过比较雌酮、雌二醇、雌三醇的峰面积，均可以满足检测要求，其中丹磺酰氯的峰面积最大。

实施例5

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，第一萃取液为甲醇。

表5 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

实施例6

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，第一萃取液为乙腈。

表6 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

通过实施例1、5、6的第一萃取液，均可以萃取干血片中雌激素，在衍生化后，在第二萃取剂萃取后，进行LC-MS/MS分析，通过比较雌酮、雌二醇、雌三醇的峰面积，均可以满足检测要求，其中甲醇：乙腈（体积比50:50）的峰面积最大。

实施例7

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，第二萃取液为乙酸乙酯。

表7 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

实施例8

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，第二萃取液为二氯甲烷。

表8 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

通过实施例1、7、8的第二萃取液，均可以在第一萃取液萃取干血片中雌激素，在衍生化后，萃取出衍生化的雌激素，进行LC-MS/MS分析，通过比较雌酮、雌二醇、雌三醇的峰面积，均可以满足检测要求，其中甲基叔丁基醚的峰面积最大。

实施例9

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，缓冲液为磷酸钠缓冲液。

表9 测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

实施例10

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒，基本同实施例1，不同的是，缓冲液为硼酸钠缓冲液。

表10测定干血片中多种雌激素的试剂盒的组份

通过实施例1、9、10的缓冲液，均可以在第一萃取液萃取干血片中雌激素，在衍生化中发挥缓冲作用，在第二萃取液萃取出衍生化的雌激素，进行LC-MS/MS分析，通过比较雌酮、雌二醇、雌三醇的峰面积，均可以满足检测要求，其中碳酸钠缓冲液的峰面积最大。

实施例11

本实施例的一种测定干血片中多种雌激素的方法，使用实施例1的试剂盒，包括如下步骤：

1. 实验材料

1.1. 对照品及试剂

对照品：雌酮、雌二醇、雌三醇（中检院）；内标准品：雌酮-d4、雌二醇-d3、雌三醇-d3（TRC）

试剂：丹磺酰氯（HPLC级，Sigma)、甲醇（HPLC级，Merck）、乙腈（HPLC级，Merck）、甲酸（HPLC级，Aladdin）、Bovine Serum Albuminv（BSA，生物级，Sigma）

1.2 主要仪器设备和耗材

LC-MS/MS：Waters UPLC-I Class超高效液相色谱和Xevo TQ-S质谱系统

色谱柱，ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50 mm 1.7μm)（Waters）

漩涡混合器（美国SI Vortex Genie 2）、台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司TGL-1）、十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo）

2. 溶液及试剂的配置

2.1. 储备液和工作液的配置

精确称取雌酮、雌二醇、雌三醇对照品各10.0 mg，于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释到刻度，得到1 mg/mL的储备液。并用50 % MeOH溶液稀释成雌酮和雌二醇的浓度为50、100、250、500、1000、2500、5000、10000 pg/mL，雌三醇的浓度为100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000 ng/mL浓度的标准曲线工作液，雌酮和雌二醇的浓度为10、250、500 pg/mL，雌三醇浓度为20、500、1000 pg/mL的质控样品工作液。

将雌酮-d4、雌二醇-d3、雌三醇-d3用甲醇溶液溶解，并用甲醇稀释雌酮-d4和雌二醇-d3为100 pg/mL，雌三醇为400 pg/mL的混合内标工作液。

2.2. 流动相和其它溶液的配制

强洗溶液：90 %乙腈溶液

弱洗溶液：10 %乙腈溶液

流动相A：含0.1 %甲酸水溶液

流动相B：含0.1 %甲酸的甲醇溶液

3. 空白全血的制备：收集全血，在1500 g离心5 min，分离血细胞及血浆。血细胞用生理盐水洗涤3次，离心后去除上清液得到干净的红细胞；将洗净后的红细胞与4%的牛血清白蛋白溶液（4%BSA）按55∶45比例混合，混合后作为空白的全血基质。

4. 校准曲线和质控样品的配制

将上述所配制的工作液分别取10 μL加入到90 μL的空白全血基质中配制成雌酮和雌二醇的浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000 pg/mL，雌三醇的浓度为10、20、50、100、200、500、1000、2000 pg/mL浓度的标准曲线工作液的标准曲线样品，雌酮和雌二醇的浓度为10、250、500 pg/mL，雌三醇浓度为20、500、1000 pg/mL的质控样品。将含标准品和质控品的全血滴至滤纸片上，制成一系列DBS标准曲线样品和质控样品，晾干，-20 ℃保存，可用这些样品考察方法的线性、灵敏度、精密度、提取回收率等。

5. 样品的制备

待测样本用打孔钳打4个直径3 mm干血斑（相当于12 μL全血）于96孔聚丙烯板中；每孔加入200 μL甲醇：乙腈（50：50）溶液，20 μL内标工作液，室温涡旋混合50分钟；将每孔样本转移到新的96孔板中，50℃氮气吹干。加入100 μL Na2CO3 缓冲液（100 mmol，pH=10.5）涡旋震荡1 min，再加入100 μL 2 mg/mL 丹磺酰氯溶液涡旋震荡1 min，60℃水浴5min。取出，加入1 mL甲基叔丁基醚溶液涡旋振荡５min，在4000 g 4℃的条件下离心15 min，取上清液800 μＬ到新的96孔板中，氮气吹干，用100 μL 40% MeOH复溶，在4000 g 4℃的条件下离心15 min，取上清液30 μL进样分析。

6. 仪器条件

6.1. 液相条件的优化

本实验选用 ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm 1.7μm)（Waters）色谱柱，分别使用甲醇和乙腈作为有机相对梯度和不同pH和缓冲盐流动相体系进行比较研究，结果发现同时在甲醇和水中加入0.1％甲酸并在55％的有机相起始至2.5 min时升至95%的有机相以0.4 mL/min的流速进行梯度洗脱时，能够得到很好的分离和保留且峰形良好，有较高灵敏度，本方法在超高效液相系统下分析时间可以缩短到3.5 min，能够快速、高效的分析雌酮、雌二醇、雌三醇三种雌激素，并达到很好的定量分析效果。具体液相条件如下：

进样器温度：4℃

柱温：40℃

运行时间：3.5 min

洗脱梯度：

表11 洗脱梯度

6.2. 质谱条件

扫描模式：多反应离子检测（正离子模式）

毛细管电压：3.0 kV 脱溶剂温度：650 ℃；脱溶剂气：800 L/hr；锥孔气：150 L/hr

多反应监测参数表格

表12 多反应监测参数表格

7. 数据处理

分析物和内标的保留时间，色谱图采集和色谱图的积分和数据统计由Masslynx软件和Microsoft Office Excel 2013进行处理。校正曲线以1/x2为加权系，用峰面积比值（分析物/内标）对校正标样中分析物的浓度进行线性回归。

8. 方法验证

本方法在衍生化结合液液萃取的前处理条件下，在定量下限5 pg/mL和10 pg/mL的浓度样本中，雌酮、雌二醇和雌三醇的信噪比S/N均大于10，平时测定6个定量下限浓度的样品，检测结果如下详见表13，定量下限的准确度和精密度均在20%以内，结果符合要求；雌酮、雌二醇和雌三醇三种分析物样品在5-1000 pg/mL和10-2000 pg/mL的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r≥0.99；该方法采用加标回收的方法来评估正确度测试，该方法的正确度通过加标回收试验来评估，收集人体全血样本混合后，通过分别加入一定量低中高浓度质控工作液，制备成加标后干血片样本再处理分析，要求加标回收率均在可接受范围（85%-115%）内，该方法的正确度结果可以接受，结果详见表14；选取低中高溶度的三个干血片质控样品，每个浓度样品平行处理六次计算其批内的精密度和准确度，连续三天测三个分析批次来计算该方法的批间精密度，结果详见表15，该方法的批内和批间的准确度和精密度均在15%以内，结果符合要求。

表13 雌酮、雌二醇、雌三醇定量下限5 pg/mL和10 pg/mL浓度的检测结果（n=6）

表14 雌酮、雌二醇、雌三醇方法正确度测试(n=6)

表15 雌酮、雌二醇、雌三醇方法精密度和准确度（n=6）

综上所述，该方法分析速度通量大，能同时检测三个雌激素的浓度，分辨率高、分析时间较短、在干血片样品中灵敏度高、稳定性好，专属性强，准确度和精密度更好，线性范围能完全覆盖临床检验样本的区间，可以适用于人体的干血片样品中的雌酮、雌二醇、雌三醇三种雌激素的痕量分析。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种测定干血片中多种雌激素的方法，其特征在于：使用试剂盒，包括如下步骤：

用第一萃取剂将雌激素从干血片中萃取出的步骤，得第一萃取样品；

用衍生化试剂将所述第一萃取样品衍生化处理的步骤，得衍生化样品；

用第二萃取剂将雌激素从衍生化样品中萃取出的步骤，得第二萃取样品；

将第二萃取样品离心后取上清液，用高效液相色谱串联质谱检测的步骤；

所述试剂盒包括以下组分：校准品、质控品、内标 标准品、衍生化试剂、缓冲液、第一萃取剂、第二萃取剂；

所述第一萃取剂为甲醇和乙腈的混合溶液，所述甲醇和乙腈的体积比为50:50；所述第二萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种或几种；

所述衍生化试剂为丹磺酰氯；

所述校准品为雌酮、雌二醇、雌三醇；所述内标标准品为雌酮-d4、雌二醇-d3、雌三醇-d3；

所述高效液相色谱条件为：进样器温度：4 ℃；柱温：40 ℃；运行时间：3.5 min；

所述流动相A：0.1%甲酸水溶液；

所述流动相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。

2.根据权利要求1所述的一种测定干血片中多种雌激素的方法，其特征在于：所述缓冲液为碳酸钠、磷酸钠或硼酸钠缓冲液。

3.根据权利要求1或2任一项所述的一种测定干血片中多种雌激素的方法，其特征在于：试剂盒还包括甲醇、乙腈、甲酸、牛血清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种测定干血片中多种雌激素的方法，其特征在于：所述质谱条件为：

毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂温度：650 ℃；脱溶剂气：800 L/hr；锥孔气：150 L/hr；扫描模式：多反应离子检测，正离子模式。