CN108169383A - 一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先从血清中提取总甲状腺激素，对血清中的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)进行检测。与传统方法相比，本发明仅利用10μL血清样品，即可高效精准检测血清总甲状腺激素浓度，灵敏度极高、抗干扰能力强，可最大程度保证样品的有效回收与高重复性。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检测领域，涉及一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，尤其涉及少量血清精准检测甲状腺激素T4、T3、rT3的测定方法及试剂盒。
背景技术
甲状腺激素对人和动物的生长、发育、新陈代谢和神经发育等具有重要的作用。血清中甲状腺T3、T4、rT3的测定可提供甲状腺激素水平的重要信息，为甲状腺功能紊乱的病因诊断及毒性因子识别提供帮助。目前，免疫分析法被广泛应用在甲状腺激素T3、T4的测定，但该方法的特异性不强、方法灵敏性不高。此外，使用免疫分析方法检测怀孕女性血清的甲状腺激素T4和T3时，由于怀孕期间类固醇激素和甲状腺结合球蛋白的复杂变化，导致甲状腺激素水平检测错误。
目前，已有研究者通过HPLC-MS/MS直接测定血清的甲状腺激素水平，该方法与免疫分析法相比，对甲状腺激素的鉴定的可信度与重现性均有所提高，但仍存在检出限较高，导致测定所需的血清量达500μL的缺点。
发明内容
为达到少量血清精准快速检测甲状腺激素水平的目的，本发明提供了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先对从血清中提取的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)进行检测，采用少量(10μl)血清即可精准测定其中甲状腺激素T4、T3、rT3，该方法弥补了传统分析方法不稳定、重现性差的缺陷。该方法重现性好，血清使用量少，且用于测定微量血清中的总甲状腺激素含量时亦更加准确。
本发明采取的技术方案为：
一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP((5-N-succinimidoxy-5-oxopentyl)-triphenylphosphonium bromide)衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，完成对血清总甲状腺激素的测定。
进一步地，所述总甲状腺激素包括结合态甲状腺激素和游离态甲状腺激素，通过沉淀待测血清中的甲状腺激素结合蛋白，即可释放出结合态甲状腺激素。
进一步地，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。
通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10-50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1-5μl抗氧化剂，混匀置于-20-0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟，取上清液即得总甲状腺激素提取液。
优选地，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。
进一步地，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10-20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其(即前述衍生化反应的产物)置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。
优选地，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。
进一步地，上述方法还包括进行UPLC-MS/MS检测前，将SPTPP衍生化产物用乙酸乙酯萃取，收集的萃取液用氮气吹干再用甲醇定容，用于UPLC-MS/MS检测。
优选地，用1mL乙酸乙酯对SPTPP衍生化产物进行萃取1-3次，将上层乙酸乙酯收集后加入1mL水清洗乙酸乙酯萃取液，收集上层乙酸乙酯，微弱氮气吹至近干，加入500μl甲醇，涡旋混匀，用于UPLC-MS/MS检测。
进一步地，上述UPLC-MS/MS检测的具体步骤为：取SPTPP衍生化产物和不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液，通过UPLC-MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测血清总甲状腺激素的浓度。
优选地，通过以下方法配制不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液：
(1)分别称取10mg的不同甲状腺激素，用甲醇定容至10mL，制得浓度均为1000μg/mL的标准储备液；
(2)分别取步骤(1)中的各标准储备液，混合，配制不同甲状腺激素浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；
(3)取步骤(2)中的混合标准溶液，加入活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和150ng/mL的工作溶液，分别进行SPTPP衍生化反应，获得不同甲状腺激素(T4、T3、rT3)不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液。
优选的，上述UPLC-MS/MS检测条件为：色谱柱为T3柱，柱长50mm；流动相梯度采用甲醇(A)和超纯水(B)，其梯度变化为0-7min，10％A；7-12min，10％-90％A；12-13min，90％A；13-13.1min，90％-10％A；13.1-16min，10％A；流动相流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为2-10μl；质谱的离子源为：ESI源；数据扫描方式：正离子模式；测定方式：选择反应监测方式(MRM)；质谱的脱溶剂气温度为500℃；毛细管电压为3-3.2kV；脱溶剂气流量为900L/Hr；锥孔电压为34V；源温度为150℃。
本发明还提供了一种测定血清中总甲状腺激素的试剂盒，包括：
用于提取血清中总甲状腺激素的试剂，又包括：甲醇内标溶液和抗氧化剂，所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；
以及用于对总甲状腺激素进行SPTPP衍生化的试剂，又包括：衍生反应缓冲溶液、衍生试剂和衍生反应终止溶液，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液，所述衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)，所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。
本发明的有益效果：与传统方法相比，本发明的优势如下：
(1)本发明能够精确地检测微量血清中的总甲状腺激素的含量，由于甲状腺激素T4、T3结构均含有氨基基团，可通过对氨基进行特异性衍生化反应，获得离子化更强的衍生产物，从而极大提高检测灵敏度，实现微量血清(10μL)中甲状腺激素的精准快速测定，除了检测总T4、T3外，同时还可以检测总rT3的含量；
(2)本发明采用乙酸乙酯作为衍生产物的提取剂，可使目标物质被较好的提取；
(3)本发明提取剂只需最终经氮气吹干，后甲醇定容至500μl，可极大程度降低基质的干扰；
(4)本发明选用甲状腺激素T4作内标物质，可精准的对血清中总T4、T3、rT3进行定量，提高了方法的准确性，同时有效地降低前处理过程中引起的误差；
(5)本发明采用UPLC-MS/MS进行检测分析，其具有高效、快速、分离效果好、抗干扰能力强且具有非常好的重现性；
(6)与传统方法相比，本发明方法具有血清使用量低，灵敏度高、测定准确等优点。
附图说明
图1为甲状腺激素T4、T3、rT3标准品SPTPP衍生后的MRM图谱；
图2为空白血清添加甲状腺激素T4、T3、rT3标准品SPTPP衍生后的MRM图谱；
图3为空白血清样本SPTPP衍生后的MRM图谱；
图4为血清样本SPTPP衍生后的MRM图谱；
图5为SPTPP衍生试剂的核磁共振氢谱图；
图6为SPTPP衍生试剂的高效液相色谱图；
图7为SPTPP衍生试剂的质谱图。
具体实施方式
以下将以检测血清中总甲状腺激素T4、T3、rT3浓度为例对本发明的技术方案进行更为详细的说明。
实施例1：血清中总甲状腺激素浓度的检测
1、仪器与试剂：
超高效液相色谱串联质谱联用仪(Waters公司)，包括ACQUITY超高效液相系统，Xevo TQ-S四级杆质谱；高速冷冻离心机(德国HERMLE公司)；分析天平(美国Mettler公司)；氮吹仪；涡旋振荡器(Vortex-Genie 2)。
甲醇(LC/MS级)、乙腈(LC/MS级)、磷酸一氢钠(纯度大于99％)、磷酸二氢钠(纯度大于99％)、柠檬酸(纯度大于99％)、抗坏血酸(纯度大于99％)、二硫苏糖醇(纯度大于99％)、甲酸(HPLC级)、Milipore-Q水、衍生试剂(合成方法依据：Rapid Commun.MassSpectrom.2010；24:1358–1364；由宁波康贝生化有限公司进行合成；纯度大于98％；该物质的核磁共振氢谱见附图5、高效液相色谱图见附图6、质谱图见附图7)。
甲状腺激素标准品：T4、T3、rT3、T4(内标)，(纯度大于98％，Toronto ResearchChemicals，(Downsview，ON，Canada))。
标准储备液的配制：分别取10mg的甲状腺激素T4、T3、rT3，用40％氨水的甲醇溶液定容至10mL，制得1000μg/mL的标准储备液，于-80℃保存；
混合标准溶液的配制：取以上各标准储备液用甲醇进行稀释，混合，配制T4、T3、rT3浓度10μg/mL的混合标准溶液，于-20℃储存待用；
甲醇内标溶液的配制：准确称取0.3mg甲状腺激素T4-13C6将其溶解至100mL甲醇溶液，制得甲状腺激素T4-13C6浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液；
抗氧化剂的配制：分别准确称取5g柠檬酸、抗坏血酸、二硫苏糖醇，将其溶解至100mL的Milipore-Q水，制得浓度均为50g/L的柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液；
衍生试剂的配制：准确称取200mg衍生试剂SPTPP，将其溶解至43mL的甲醇溶液，制得衍生试剂，即10mM SPTPP甲醇溶液；
衍生反应缓冲溶液的配制：准确称取1.42g的磷酸一氢钠和1.2g的磷酸二氢钠，将其分别溶解至100mL的Milipore-Q水，将磷酸二氢钠的水溶液加入至磷酸一氢钠的水溶液，并调节pH至8.0，制得0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)；
衍生反应终止溶液的配制：量取30mL的Milipore-Q水、10mL的乙腈和40μL的甲酸，将其涡旋振荡混匀，制得含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。
2、血清处理(前处理)：
(1)血清总甲状腺激素的提取：取10μl待测血清样本(经北京大学伦理委员会批准，由北京大学医院提供)，加入1μl抗氧化剂，加入10μl甲醇内标溶液，混匀置于-20℃，30分钟后取出；4℃，12000g离心力，离心5分钟，取上清即得血清总甲状腺激素提取液。
(2)衍生化反应：取衍生反应缓冲溶液300μl于4mL棕色瓶，加入10μl步骤(1)提取的血清总甲状腺激素，加入50μl，10mM的衍生试剂，密封涡旋混匀，置于40℃烘箱中进行衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入700μl衍生反应终止溶液，终止反应后，用1mL乙酸乙酯对产物其进行萃取2次，将上层乙酸乙酯收集后加入1mL水对乙酸乙酯进行脱盐处理，收集上层乙酸乙酯，微弱氮气吹至近干，加入500μl甲醇，涡旋混匀，待UPLC-MS/MS检测。
3、超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行(UPLC-MS/MS)检测：
(1)UPLC液相条件：色谱柱为T3柱，柱长50mm；流动相梯度采用甲醇(A)和超纯水(B)，其梯度变化为0-7min，10％A；7-12min，10％-90％A；12-13min，90％A；13-13.1min，90％-10％A；13.1-16min，10％A；流动相流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为5μl。(2)质谱条件：离子源为：ESI源；数据扫描方式：正离子模式；脱溶剂气温度为500℃；毛细管电压为3kV；脱溶剂气流量为900L/Hr；锥孔电压为34V；源温度为150℃；测定方式：选择反应监测方式(MRM)，主要质谱参数见表1。
表1 主要质谱参数表
4、基质匹配标准曲线和最低检出限：
(1)取T4、T3、rT3浓度10μg/mL的混合标准溶液，加入10μl活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和150ng/mL的工作溶液(每种浓度的工作溶液中，均含有等浓度的T4、T3和rT3)，备用；
(2)分别取浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和15ng/mL的工作溶液各10μl，分别加入事先加好300μl衍生反应缓冲溶液的4mL棕色瓶中，再分别加入10μl甲状腺激素T4内标溶液和50μl衍生试剂，用盖子密封置于40℃烘箱中进行衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入700μl终止溶液，终止反应后，用1mL乙酸乙酯对产物进行萃取2次，将上层乙酸乙酯收集后加入1mL水对乙酸乙酯进行脱盐处理，收集上层乙酸乙酯，微弱氮气吹至近干，加入500μl甲醇，涡旋混匀，配成具有不同浓度梯度的基质-SPTPP衍生混合标准工作溶液，基质-SPTPP衍生混合标准工作溶液的浓度分别为：5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL和3pg/mL；
(3)基质-SPTPP衍生混合标准工作溶液，5μl进样量进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标峰面积的比值(Y)和其浓度(X)进行线性回归分析，获得标准曲线。结果表明，在～范围内物质的浓度与所测得相对内标的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数(γ)均大于0.99。依据信噪比(S/N)计算得各甲状腺激素的检出限(LOD)详见表2。
表2 各甲状腺激素标准曲线参数
| 序号 | 甲状腺激素 | 线性方程 | 相关系数(γ2) | 检出限(pg/mL) |
| 1 | T4 | Y＝32.785X+12.515 | 0.9998 | 4.8 |
| 2 | T3 | Y＝7.9503X+10.609 | 0.9999 | 3.7 |
| 3 | rT3 | Y＝45.897X+4.4974 | 0.9996 | 5.6 |
5、本发明方法的回收率和重复性
将T4、T3、rT3浓度均为10μg/mL的混合标准溶液，加入10μl活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制制得低、中、高三个浓度水平(1、5、25ng/mL)的甲状腺激素基质溶液，按上述方法进行前处理，和UPLC-MS/MS分析，并计算该方法的回收率，以每个浓度重复测定6次的结果计算方法的重复性。结果表明，甲状腺激素的回收率为80.6％-124.5％，相对标准偏差(RSD)为5.3％-10.9％。结果见表3。
表3 本发明方法的回收率和重复性计算结果
| 甲状腺激素 | 空白血清(pg/mL) | 回收率(％) | ％RSD | 回收率(％) | ％RSD | 回收率(％) | ％RSD |
| T4 | 0.00 | 124.5 | 6.4 | 80.6 | 5.3 | 79.1 | 5.3 |
| T3 | 0.00 | 112.3 | 8.2 | 80.6 | 8.1 | 84.1 | 6.6 |
| rT3 | 0.00 | 88.1 | 8.9 | 105.2 | 10.9 | 92.4 | 5.7 |
综上所述，仅为本发明具体实施方式，但本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，完成对血清中总甲状腺激素的测定。
2.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。
3.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10-50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1-5μl抗氧化剂，混匀置于-20-0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟，取上清液即得甲状腺激素提取液。
4.如权利要求3所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。
5.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10-20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。
6.如权利要求5所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为pH 8.0的0.1M的磷酸缓冲液；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。
7.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，还包括进行UPLC-MS/MS检测前，将SPTPP衍生化产物用乙酸乙酯萃取，收集的萃取液用氮气吹干再用甲醇定容，用于UPLC-MS/MS检测。
8.如权利要求1-7任一项所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测的具体步骤为：取SPTPP衍生化产物和不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质标准溶液，通过UPLC-MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测血清中总甲状腺激素的浓度。
9.如权利要求8所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，通过以下方法配制不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液：
(1)分别称取10mg的不同甲状腺激素，用甲醇定容至10mL，制得浓度均为1000μg/mL的标准储备液；
(2)分别取步骤(1)中的各标准储备液，混合，配制不同甲状腺激素浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；
(3)取步骤(2)中的混合标准溶液，加入活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和150ng/mL的工作溶液，分别进行SPTPP衍生化反应，获得不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液。
10.一种测定血清中总甲状腺激素的试剂盒，包括：
用于提取血清中甲状腺激素的试剂，又包括：甲醇内标溶液和抗氧化剂，所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；
以及用于对甲状腺激素进行SPTPP衍生化的试剂，又包括：衍生反应缓冲溶液、衍生试剂和衍生反应终止溶液，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液，所述衍生反应缓冲溶液为pH 8.0的0.1M的磷酸缓冲液，所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。
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