CN109633014B - 一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草成分检测技术领域，涉及一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤：将冻干的烟叶与内标、二氯甲烷混合后提取，固液分离，液体去除溶剂得提取物；在提取物中加入衍生化试剂进行反应，得待测溶液；将待测溶液进行GC‑MS/MS分析，测定21种萜类化合物的含量，然后计算得到烟叶粉末中该21种萜类化合物的含量。该测定方法检测到的萜类化合物覆盖面较广，本发明采用GC‑MS/MS法，灵敏度高，选择性好，干扰小，效率高，可应用于倍半萜、二萜、甾醇等多种类型萜类物质。

Description

一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法及其应用

技术领域

本发明属于烟草成分检测技术领域，具体涉及一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法及其应用。

背景技术

萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，对植物的生长发育以及抵御外界侵害等具有重要的作用。烟草中的萜类化合物除了调节烟草生长、增强抗逆性等生理功能外，还与烟草的香气品质密切相关，是衡量烟草品质的重要指标。因此，准确检测萜类化合物在烟草中的含量，是研究萜类代谢途径、提高萜类成分含量、解析烟草香气品质的重要前提。

国内外用于萜类成分的检测方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用色谱法及气质联用色谱法等。其中紫外分光光度法主要用于测定萜类物质总量，对于快速分离并检测多种萜类物质，色谱法有显著优势。高效液相色谱法分离效果好且分析速度快，适用于分析极性及难挥发性物质。气相色谱法简便、灵敏、准确、准确性好，适用于分析非极性、弱极性或易挥发性物质，在萜类物质含量测定方面应用广泛。近几年来，气质联用色谱(GC-MS)和液质联用色谱(LC-MS)在烟草萜类化合物分析中扮演了越来越重要的角色。LC-MS方法不需要衍生化，但是离子抑制(基质效应)明显，对灵敏度有一定的影响；GC-MS/MS的主要优势在于其高选择性和高灵敏度，以及对复杂基质的抗干扰能力，在一些微/痕量萜类物质分析中应用广泛。

目前，烟草萜类物质的含量研究主要应用GC-MS技术，且研究对象主要集中在烤后烟、烟气等，对新鲜烟叶研究较少，并往往局限于甾醇、西柏烷二萜等很少的几种萜类物质，忽视了其他一些对烟草品质相关的重要二萜，如赖百当二萜类物质的研究，分析覆盖面窄。而研究新鲜烟叶中的萜类含量变化，可以更准确的分析气候、海拔等对烟叶生长发育的影响，明确各个萜类物质在生育期的累计规律，为下一步关键调控机理和有效调控手段的研究奠定基础。

公布号为CN104101662A的中国专利申请公开了一种检测新鲜烟叶中萜类化合物代谢组学的方法，该方法将采集后的鲜烟叶进行冷冻干燥、磨碎，然后依次采用溶剂萃取法、碱裂解法分别提取游离的萜类及结合型的萜类，然后合并两次提取物进行衍生化，然后利用GC-MS全扫描方法同SD全扫描方法进行分析。利用该方法检测到烟草中15种萜类物质，前处理复杂且其检测到的萜类化合物覆盖面仍较窄。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，前处理简单并且能同时检测新鲜烟叶中21种萜类物质，覆盖面较广。

本发明的目的还在于提供一种上述测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法在分析不同品种烟叶及烟草制品中萜类物质含量方面的应用。本发明的测定方法可用于检测不同产地不同品种的烟叶样品及烟草制品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，包括以下步骤：

样品的前处理：

1)将冻干的烟叶粉末与内标、二氯甲烷混合，然后提取，固液分离，液体去除溶剂得到提取物；

2)在提取物中加入衍生化试剂进行衍生化反应，得待测溶液；

样品的分析检测：

对待测溶液进行GC-MS/MS分析，测定21种萜类化合物的含量，所述21种萜类化合物分别为：反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、菜籽甾醇、胆固醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸。

本发明建立了一种新鲜烟叶中21种萜类物质的GC-MS/MS检测方法，GC-MS/MS法灵敏度高，选择性好，干扰小，效率高，可应用于倍半萜、二萜、甾醇等多种类型萜类物质，非常适合植物中萜类物质的分析，覆盖面广。

为了使冻干烟叶粉末中的目标分析物溶解到萃取液中，步骤1)中所述冻干的烟叶粉末与内标、二氯甲烷混合为先将内标与二氯甲烷混合，得萃取液，然后与冻干的烟叶粉末混合；每20mg冻干的粉末对应加入1～2mL萃取液。

为了进一步提高目标分析物在萃取液中的溶解率，步骤1)中所述提取为超声提取或震荡提取。

为尽量减少提取物的损失，步骤1)中所述液体去除溶剂的方法为真空浓缩去除或氮吹去除。

为保证目标分析物可以被检出，步骤2)所述衍生化试剂为硅烷衍生化试剂。

所述GC-MS/MS分析时色谱的条件为：色谱柱为DB-5MS；进样方式为恒流模式，分流比(10～50)：1；进样量：1.0μL；进样口温度：280℃；载气及流速：氦气，1.0～1.2mL/min；升温程序：初始温度80℃，以20℃/min升至215℃，再以0.5℃/min升至220℃，最后以15℃/min升至310℃并保持15min。本发明的方法在分析过程中所设置的仪器参数，有利于将各目标分析物分开，提高检测灵敏度。

为进一步提高仪器的灵敏度，所述GC-MS/MS分析时质谱的条件为：离子源为EI源；电离能量为70eV；溶剂延迟时间为4～7min；传输线温度为280℃；离子源温度为250℃；扫描方式为选择反应监测模式。

所述测定21种萜类化合物的含量包括以下步骤：配制含内标及21种萜类化合物的系列标准工作溶液，将系列标准工作溶液进行GC-MS/MS分析，然后将每种萜类化合物定量离子色谱峰的面积和内标的定量离子色谱峰的面积的比值与每种萜类化合物浓度和内标浓度的比值进行线性回归分析。通过线性回归分析可得出标准曲线，从而确定待测样品中各目标反应物的量。

一种上述测定烟叶中21种萜类化合物的方法在分析不同品种烟叶及烟草制品中萜类物质含量方法的应用。

本发明的测定方法可用于测定不同产区不同烟叶品种及烟草制品中21种萜类化合物，从而分析不同产区及不同品种的烟叶及烟草制品中萜类物质的差异。

附图说明

图1为本发明的测定烟叶中21种萜类化合物的方法的流程图；

图2为测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法的实施例1中萜类物质的总离子流TIC图；

图3为云南、贵州及河南三个产地的烟叶中萜类物质的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图。

具体实施方式

本发明的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法中所用内标为烟叶中不含有的物质，如十三烷酸等。

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法的实施例1

如图1所示，本实施例的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法包括以下步骤：

一、标准曲线的确定：

准确称取本发明测定的21种萜类化合物标准品，用含有十三烷酸的二氯甲烷溶液(十三烷酸的浓度为2.5mg/L)溶解，配制成各萜类化合物的质量浓度均为1mg/L的标准储备液，于-80℃下保存备用。

然后准确吸取上述标准储备液，用含有十三烷酸的二氯甲烷溶液(十三烷酸的浓度为2.5mg/L)稀释配制系列标准工作溶液，然后用GC-MS/MS分析。其中GC-MS/MS的分析条件为：色谱柱为Agilent公司DB-5MS气相色谱柱，规格30m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f.；进样方式：恒流模式，分流比20：1；进样量：1.0μL；进样口温度：280℃；载气及流速：氦气(纯度为99.999％)，1.0mL/min；升温程序：初始温度80℃，以20℃/min升至215℃，再以0.5℃/mi，升至220℃，最后以15℃/min升至310℃并保持15min；电离方式：电子轰击(EI)；电离能量：70eV；溶剂延迟：7min；传输线温度：280℃；离子源温度：250℃；扫描方式：选择反应监测模式。内标及21种萜类化合物的相关参数如表1所示。

表1内标及萜类化合物的GC-MS/MS分析的保留时间、特征离子及碰撞能量

将每种萜类化合物定量离子色谱峰的面积和内标的定量离子色谱峰的面积的比值与每种萜类化合物浓度和内标浓度的比值进行线性回归分析，各萜类化合物的线性回归方程及相关系数如表2所示。

表2 21种萜类化合物的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限(LOD)、定量限(LOQ)

二、样品的前处理与分析检测：

1)取不同产区成熟期的新鲜烟叶液氮速冻，在干冰包埋下运输至实验室中进行真空冷冻干燥，研磨成粉末并过100目筛后于-80℃保存备用；

2)精确称取上述烟叶冻干粉末20mg于离心管中，加入1.5mL含十三烷酸的二氯甲烷溶液(十三烷酸的浓度为2.5mg/L)，涡旋6s后然后超声提取60min，然后在室温下静置30s；

3)将静置后的样品在离心机中以12000rpm的速度离心15min，然后取800μL上清液用氮气吹干，加入200μL衍生化试剂(BSTFA：DMF为1：1，v/v)，在70℃反应1h后，放置至室温后上样，用GC-MS/MS检测分析(GC-MS/MS检测参数同确定标准曲线所用参数相同)，测试结果如图2所示。根据所测得的每种萜类化合物的定量离子色谱峰面积和内标色谱峰面积的比值确定每种萜类化合物的含量，再计算得到新鲜烟叶中21种萜类化合物的含量。

测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法的实施例2

根据实施例1的测定方法对云南地区的烟草品种云87中的萜类成分进行了检测，测定的结果如表3所示。

表3云南地区云87的烟叶中21种萜类化合物的含量

*正常烟叶中不可检出。

在本发明的其他实施例中，对云南地区的其他烟叶品种(如昆明红大、曲靖云105等)、河南地区的烟叶品种(许昌豫烟10号、平顶山中烟100、南阳中烟100和驻马店中烟100)和贵州地区的烟叶品种(遵义南江3号、毕节毕纳1号、黔南贵烟201和铜仁K326)中的萜类化合物含量进行了检测分析。

在本发明其他实施例中，每20mg新鲜烟叶冻干粉末可对应加入1.0～2.0mL的提取液。提取液为含内标的二氯甲烷溶液。提取后的清液与衍生化试剂的体积比为(3.5～4.5)：1。衍生化试剂为体积比(0.9～1.1)：(0.9～1.1)的BSTFA和DMF溶液。除BSTFA外，还可采用MSTFA硅烷化试剂。使用GC-MS/MS检测分析时，色谱及质谱的一些测试参数可作调整，色谱中的分流比可为(10～50)：1，载气流速可为1.0～1.2mL/min；质谱中的溶剂延迟时间可为4～7min。

试验例1

为确定本发明的测定方法的重复性，取6份新鲜烟叶样品的冻干粉末(烟叶品种为云87)参照实施例1中样品的前处理与分析检测部分进行检测。然后选择其中1份试样连续进样8针检测仪器的日间精密度，将该份试样每天连续进样8针并重复4d检测仪器的日间精密度；另取1份试样分别在衍生化反应后的0h、12h、24h、48h、72h进样，检测样品在常温条件下的72h内的稳定性，测试结果如表4所示。

表4GC-MS/MS检测新鲜烟叶中21种萜类成分的方法重复性、日内、日间精密度和样品稳定性

*正常烟叶中不可检出。

试验例2

用新鲜烟叶的冻干粉末(烟叶品质为云87)作为基质，将21种萜类化合物标准品的标准储备液分别配制成高中低3个浓度水平(其中低浓度为15.6～18.8μg/mL，中浓度为31.3～37.5μg/mL，高浓度为62.5～75.0μg/mL)的进行加标回收率实验，每个水平重复3次(具体测试过程参照测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法的实施例1)，结果见表5。可以看出，21种萜类物质的加标回收率在88.0％～118.7％之间，RSD在0.19％～3.15％之间，说明本方法重复性好，准确度高。

表5 21种萜类成分的加标回收率和相对标准偏差

测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法的应用的实施例

对云南、贵州及河南三个产地的不同品种的烟叶中21种萜类化合物的含量进行分析，得云南、贵州及河南三个产地萜类物质的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图，如图3所示。由图3可见，3个主产地间能明显区分，云南和河南较接近，与贵州差异较大，且贵州组内差异明显。说明3个产地间的某些萜类物质含量有明显差异，且贵州的萜类物质含量较云南和河南差异更大，遵义产区的南江3号与其他3个品种差异明显。

Claims (6)

1.一种测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

样品的前处理：

1）将冻干的烟叶粉末与内标、二氯甲烷混合，然后提取，固液分离，液体去除溶剂得到提取物；所述内标为十三烷酸；所述冻干的烟叶粉末与内标、二氯甲烷混合为先将内标与二氯甲烷混合为萃取液，然后与冻干的烟叶粉末混合；每20mg冻干的粉末对应加入1~2mL萃取液；所述萃取液中十三烷酸的浓度为2.5mg/L；

2）在提取物中加入衍生化试剂进行衍生化反应，得待测溶液；

样品的分析检测：

对待测溶液进行GC-MS/MS分析，测定21种萜类化合物的含量，所述21种萜类化合物分别为：反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S, 2E, 4S, 6R, 7E, 11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、(1S, 2E, 4R, 6R, 7E, 11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、菜籽甾醇、胆固醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸；

所述GC-MS/MS分析时色谱的条件为：色谱柱为DB-5MS；进样方式为恒流模式，分流比（10~50）：1；进样量：1.0μL；进样口温度：280℃；载气及流速：氦气，1.0~1.2mL/min；升温程序：初始温度80℃，以20℃/min升至215℃，再以0.5℃/min升至220℃，最后以15℃/min升至310℃并保持15min；

所述GC-MS/MS分析时质谱的条件为：离子源为EI源；电离能量为70eV；溶剂延迟时间为4~7min；传输线温度为280℃；离子源温度为250℃；扫描方式为选择反应监测模式。

2.根据权利要求1所述的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，其特征在于，步骤1）中所述提取为超声提取或震荡提取。

3.根据权利要求1所述的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，其特征在于，步骤1）中所述液体去除溶剂的方法为真空浓缩去除或氮吹去除。

4.根据权利要求1所述的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，其特征在于，步骤2）所述衍生化试剂为硅烷衍生化试剂。

5.根据权利要求1所述的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法，其特征在于，所述测定21种萜类化合物的含量包括以下步骤：配制含内标及21种萜类化合物的系列标准工作溶液，将系列标准工作溶液进行GC-MS/MS分析，然后将每种萜类化合物定量离子色谱峰的面积和内标的定量离子色谱峰的面积的比值与每种萜类化合物浓度和内标浓度的比值进行线性回归分析，得到每种萜类化合物的线性回归方程；将待测溶液中各萜类化合物的分析结果分别代入线性回归方程中，计算得到21种萜类化合物的含量。

6.一种如权利要求1所述的测定烟叶中21种萜类化合物含量的方法在分析不同品种烟叶及烟草制品中萜类物质含量方面的应用。

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