CN110927287A - 一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物中脂质的色谱‑质谱检测方法，包括：(1)样品前处理；(2)液相分离：向所得的脂质粗提物中加入混合内标，然后上UPLC色谱仪进行液相色谱分离，所述UPLC色谱仪的色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18柱，流动相A为水：甲醇：乙腈：300mM乙酸铵＝20：20：20：1；流动相B为异丙醇：甲醇：300mM乙酸铵＝180：20：3，采用梯度洗脱(3)质谱检测分析。该方法实现了植物甘油酯的全脂质组分析，可以全面地、快速地检测植物中的甘油脂。

Description

一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法。
背景技术
脂质是细胞膜的主要组成成分，脂质含量及组分的变化导致细胞膜的流动性、渗透性和极性发生改变。这些改变影响植物细胞中物质的运输、交换及信号转导，从而触发细胞对环境刺激如干旱，盐，寒冷，营养和病原菌等的响应。植物脂质主要由甘油脂构成，包括单半乳糖二酰基甘油(MGDG)，双半乳糖二酰基甘油(DGDG)，三酰基甘油(TAG)，二酰基甘油(DAG)和不同类型的磷脂。磷脂是生物膜的重要组成部分，参与植物信号转导过程。TAG不仅为人类提供能量和必需脂肪酸，为植物种子发芽提供能量，还可以维持细胞能量平衡。MGDG和DGDG是叶绿体膜系统的主要成分，而DAG作为第二信使和TAG的前体在细胞信号传导中起着关键作用。因此，定量测定甘油脂对于了解植物中脂质代谢及其功能至关重要。然而，由于其结构复杂和含量差异大，如何全面准确地定量并鉴别不同种类的脂质仍是一项具有挑战性的工作。
随着质谱平台的发展，脂质组学分析方法被逐步开发出来。电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)是脂质组学分析领域最流行最经典的平台，该技术灵敏度高，准确性强。目前，该仪器有两种进样模式，直接进样和串联液相色谱(LC)进样模式。Welti等人利用直接进样的方式，开发了一种shot gun的脂质分析方法。该方法采用母离子和子离子中性丢失相结合的扫描模式，已被广泛用于植物脂质分析。2006年，Devaiah等利用该方式成功分析了植株中的磷脂和半乳糖脂。然而，该方法却不适合非极性脂质DAG和TAG的分析。
近年基于三重四极杆ESI-MS/MS平台开发的多反应监测(MRM)数据分析方式成为目标脂质分析的另一种有效的方法，其缺点是只能靶向检测目标脂质。传统的基于ESI-MS/MS的分析方法需要预选特征离子，并且特征离子具有高度的针对性。此外，在对脂质的定量方案中需采用了去卷积的计算方法，因为检测到的离子强度包括同分异构体的信号，在特需情况下，还有带双电荷脂质的信号。这些都使得脂质的鉴定和定量变得更加复杂。
近几年将Obitrap和TOF(Time of Flight)质谱分析仪器应用于脂质分析，其优点在于质量准确度高、离子获取速度快、分辨率和灵敏度高。但是，前人的研究中，定量分析是相对的，并且分析结果中有许多脂质缺失。
综上，现有技术中的方法通常无法全面鉴定各类脂质中不同的脂质种类。这些因素造成了脂质数据分析困难，难以实现脂质样品的全脂质组鉴定及定量分析。如何开发一种全面、快速的检测植物中磷脂的方法成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法，该方法可以全面地、快速地检测植物中的甘油脂。
本发明是这样实现的：
本发明目的在于提供一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、样品前处理：收集植物组织或植物种子并提取其脂质得到脂质粗提物；
步骤2、液相分离：向所得的脂质粗提物中加入混合内标，然后上UPLC色谱仪进行液相色谱分离，所述UPLC色谱仪的色谱柱为Acquity UPLCTMBEH C18柱，流动相A为水：甲醇：乙腈：300mM乙酸铵＝20：20：20：1；流动相B为异丙醇：甲醇：300mM乙酸铵＝180：20：3，所述比值均为体积比，采用梯度洗脱；柱温设定为35～45℃；洗脱液的流速为0.1～0.5ml/min；进样体积为5～10μl；
步骤3、将步骤2所得的洗脱液进行质谱检测分析：采用TripleTOF质谱仪，配以ESI离子源，正离子模式检测。
优选地，所述步骤1中脂质提取步骤具体为：
S1、向植物组织中加入有机溶剂A于70～80℃下浸泡；
S2、分别加入有机溶剂B和C进行萃取，合并萃取液；
S3、向萃取液中加入KCl，离心，弃上清，随后加入ddH2O，离心，弃上清，氮气吹干后用溶剂D复溶，
所述有机溶剂A为含0.01～0.1％(重量)BHT的异丙醇；所述有机溶剂B为体积比为3～8：1～5的氯仿和水；所述有机溶剂C为体积比为1～5：1的含0.01～0.05％(重量)BHT的氯仿与甲醇的混合物；所述溶剂D为氯仿。
优选地，所述S2中先加入有机溶剂B萃取30～60min，后加入有机溶剂C萃取30～60min，所述步骤重复4～6次，直到样品的颜色变为白色，合并萃取液。
优选地，所述梯度洗脱中，各时间段流动相B所占体积比分别为：0～2min，25％流动相B；2～4min，25％～40％流动相B；4～22min，40％～95％流动相B；随后用95％流动相B保持5min；再用25％流动相B保持5min。
优选地，所述混合内标包含0.06nmol/μl的PA，PE，PG，LPE和LPG，0.12nmol/μl的PC和LPC，0.04nmol/μl的PS，0.0574nmol/μl的PI，0.4nmol/μl的TAG，0.2nmol/μl的DAG，0.281nmol/μl的MGDG和0.296nmol/μl的DGDG。
优选地，所述步骤3中ESI离子源温度设置为550℃，离子喷雾电压和去簇电位分别为5.5kV和100V，雾化气体和辅助空气的压力均为50psi，氮气气帘压力为35psi；扫描条件设置为：m/zm/z为400～1000Da且聚集时间为250毫秒。
优选地，采用信息依赖性获取的数据收集模式扫描碎片离子，所述碎片离子扫描条件设置为：m/z为80-1000Da，累积时间为100ms，碰撞能量为35±15eV；采用信息依赖性获取的数据收集模式进行数据收集时母离子流筛选标准为：设置动态背景消除，m/z为400-1000Da且离子强度高于100cps的前10个最强的母离子。
根据本发明的实施例，所述植物为油菜。
所述步骤3中数据采集采用仪器自带的软件AnalystR TF 1.6和MultiQuantTM，数据分析采用PeakView 2.0软件，使用LipidView 2.0获取准确脂质分子量，质荷比和碎片离子信息并将其制作成数据库进行数据分析。
具体地，根据物质的保留时间、准确的质荷比和碎片离子图谱鉴定甘油脂种类和类别；通过各脂类物质与内标的峰面积比对其进行定量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明提供的一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法。我们开发了一种基于UPLC-TripleTOF平台和MS/MSALL扫描模式的植物甘油脂脂质组学分析方法，实现了植物甘油酯的全脂质组分析。该方法在提取样品时加入不同种类甘油脂的内标，通过与内标比较，对不同类别脂质进行定量。这种基于MS/MSALL扫描模式的甘油脂分析方法具有分辨率高，灵敏度高，效率高和m/z准确的优势。此外，它易于操作且数据分析简单，可以实现短时间内大规模样品的脂质分析。
2、本发明提供的一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法，一共鉴定出218种甘油脂在内的13类脂质，包括46种TAG，15种DAG，20种PC，24种PE，13种PG，14种PI，26种PS，12种PA，16种MGDG，16种DGDG，6种LysoPC，5种LysoPE和5种LysoPG。综上，基于UPLC-TripleTOF平台的脂质分析方法简化了样品分析和数据处理过程，为批量分析植物组织甘油脂提供更快捷的方法。
附图说明
图1为实验例1提供的脂质样品色谱分离图。
图2为实验例1提供的三种不同浓度梯度脂质样品色谱图。
图3为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中PC、PE、PG及PI的含量。
图4为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中PS及PA的含量。
图5为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中DAG及TAG的含量。
图6为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中LPC、LPE及LPG的含量。
图7为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中MGDG及DGDG的含量。
图8为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型PA、PC、PG及PI的含量。
图9为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型TAG的含量。
图10为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型PE和DAG的含量。
图11为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型PS、LysoPC和LysoPE的含量。
图12为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型LysoPG的含量。
图13为实施例1的质谱分析鉴定油菜叶、根、叶柄及茎中不同类型MGDG和DGDG的含量。
图14为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中TAG、MGDG、DGDG、DAG、PC、PE、PG、PI、PS、PA、LysoPC、LysoPE及LysoPG含量变化。
图15为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中不同类型TAG含量变化。
图16为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中不同类型DAG及PC含量变化。
图17为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中PA、PE、PG、PI和LysoPE含量变化。
图18为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中PS、LysoPC和LysoPG含量变化。
图19为实施例2的质谱分析鉴定油菜开花后21、26、31、36、41、46、51和56天种子中MGDG和DGDG含量变化。
图20为实验例1提供的脂质样品的母离子及子离子的m/z实测值的比较，其中，图20a是PA-36:2分子母离子及子离子的m/z；图20b是PE-34:1分子母离子及子离子的m/z；图20c是PC-34:1分子母离子及子离子的m/z；图20d是PG-34:4分子母离子及子离子的m/z。
具体实施方式
下面将结合实例(以油菜各组织为例)对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
实施例1油菜的根，茎，叶和叶柄中的脂质的检测
1、仪器和试剂
LC-30AD UPLC色谱系统(日本岛津)和TripleTOF 5600(SCIEX，美国)用于样品的分离和检测。AnalystRTF 1.6和MultiQuantTM(AB SCIEX)软件用于数据采集。PeakView2.0(AB SCIEX)和LipidView 2.0(AB SCIEX)软件用于数据分析。
流动相A和B溶液配制：
流动相A，水：甲醇：乙腈：300mM乙酸铵＝20：20：20：1(v/v/v/v)。流动相B，异丙醇：甲醇：300mM乙酸铵＝180：20：3(v/v/v)。使用前，用超声仪将流动相A和B超声处理30分钟。所有试剂均为HPLC级，水为Milli-Q仪器出的超纯水(美国密理博)。
2、标准品
内标用的磷脂和糖脂混合内标由美国堪萨斯州立大学Ruth Welti博士提供。该标准品由Ruth Welti博士从Avanti Polar Lipids(美国)和Matreya(美国)购买，包括磷脂PC-12：0/12：0，PA-14：0/14：0，PE-12：0/12：0，PG-20：0/20：0，PI-16：0/18：0，PS-20：0/20：0，LPC-19：0，LPG-18：0，LPE-18：0，MGDG-18：0/18：0，DGDG-18：0/18：0。TAG-17：0/17：0/17：0购自Sigma-Aldrich(美国)，DAG-17：0/17：0-d5购自Avanti Polar Lipids(美国)。样品提取时，每个样品添加5μl混合内标，其中包含0.06nmol/μl的PA，PE，PG，LPE和LPG，0.12nmol/μl的PC和LPC，0.04nmol/μl的PS，0.0574nmol/μl的PI，0.4nmol/μl的TAG，0.2nmol/μl的DAG，0.281nmol/μl的MGDG和0.296nmol/μl的DGDG。
3、植物生长条件，样品收集和脂质提取
在田间自然条件下种植油菜。油菜生长60天后，迅速从植物上切取根、茎、叶和叶柄组织并立即浸入装有75℃异丙醇(含0.01％BHT)的玻璃管A中，维持75℃15分钟，然后将其在室温下放置10分钟。将1.5ml氯仿和0.6ml水加入试管A中振荡60分钟，将萃取液转移到新的玻璃试管B中。再向试管A中加入含0.01％BHT的氯仿：甲醇＝2：1(v/v)的混合物4ml，振荡30分钟，将提取物再次转移到试管B中。重复上述步骤4-5次，直到样品的颜色变为白色。向B管中加入1ml 1M KCl并混合，1,000g离心5min，弃上清。随后，加入2ml ddH2O并混合，1,000g离心5min，并弃上清。最后，用氮气将管B中的提取物吹干，并将其转移至2ml进样瓶中。烘干管A中的组织称重。将干燥的脂质样品用氯仿稀释至2mg/ml(基于样品组织干重)用于脂质分析。
4、UPLC条件设置
将提取的脂质按照标准稀释到合适浓度并加入内标混合，取10μl样品进样。UPLC条件经过优化后，在32分钟内可以将不同种类的脂质分离出(图1)。
用内置Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱(2.1mm x 100mm，i.d.，2μm)的LC-30ADUPLC在流动相A和B溶液的作用下将脂质样品进行分离。进样体积为10μl。色谱柱柱温设定为45℃。洗脱液的流速为0.3ml/min。用线性浓度梯度的流动相B进行柱洗脱，具体流程为：25％B洗脱2分钟，2-4分钟内用25％-40％B、4-22分钟内40％-95％B的线性浓度梯度洗脱，随后95％B保持5分钟，最后再用25％B平衡色谱柱5分钟进入下一个样品分析。每分析五个样品加入50μl校正液(SCIEX，A7011)以校准质谱仪。
5、TripleTOF-MS/MS条件设置
质谱分析时，将TripleTOF质谱仪(TripleTOF-MS/MS)的电喷雾电离(ESI)源设置为正离子模式。具体参数设置如下：ESI源温度设置为550℃。离子喷雾电压和去簇电位分别为5.5kV和100V。雾化气体和辅助空气的压力均为50psi，氮气气帘压力为35psi。采用信息依赖性获取(IDA)的数据收集模式扫描碎片离子。IDA数据采集时，母离子流筛选标准为：设置动态背景消除，m/z为400-1000Da且离子强度高于100cps的前10个最强的母离子。TOF-MS扫描条件设置为：m/z为400-1000Da且聚集时间为250毫秒。碎片离子扫描条件设置为：m/z为80-1000Da，累积时间为100ms，碰撞能量为35±15eV。
6、数据收集与分析
(1)使用仪器自带的软件AnalystR TF 1.6和MultiQuantTM采集数据。使用LipidView 2.0获取准确脂质分子量，质荷比(m/z)和碎片离子信息并将其制作成数据库用于数据分析。根据物质的保留时间、准确的m/z和碎片离子图谱鉴定甘油脂种类和类别。本实施例的结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002321433880000091
表1中，利用LipidView 2.0软件，在正离子模式下预测包括TAG，DAG，PC，PA，PE，PG，PI，PS，LysoPC，LysoPE，LysoPG，MGDG和DGDG在内的13种甘油脂形成母离子m/z。TAG，DAG，PA，PG，PI，MDGD和DGDG容易形成加合物[M+NH4]+，其余的脂质则容易形成加合物[M+H]+。此外，LipidView还可以预测特征碎片离子的m/z。除TAG和DAG，其它所有脂质均能丢掉头部基团(中性丧失，NL)，NL可以用于鉴定脂质的类别。而能被仪器检测到的碎片离子则为[M+H-NL]+或[M+NH4-NL]+的模式，但TAG和DAG为[M+NH4-R]+的模式(R表示任一脂肪酸链)。PC的头部基团丢失后变为磷酸胆碱(PRC)，形成[PRC+H]+加合物被检测到。
(2)用PeakView 2.0软件对采集数据进行分析：将如表1的预测到的母离子及碎片离子的m/z整理到excel表生产内部数据库上传到PeakView 2.0，从MS/MSALL收集数据中搜索符合内部数据库的甘油脂母离子准确的m/z，通过各脂类物质与内标的峰面积比对其进行定量，从而实现各种脂质种类的鉴定和定量。对于m/z值过于接近的脂质，再根据其保留时间和碎片离子进行手动校正。
7、按上述实验方法对根、茎、叶和叶柄组织的脂质检测。根据洗脱顺序检测到如PE，PS和PC的保留时间分别为14.3-17.5，12.1-16.6和13.2-15.6分钟(图1)。
以标准品浓度范围0.5-200μg/mL进行梯度稀释进样，标准品含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，以y＝a+bx线性拟合，得到如PE、PS、PC、PA、PG、TAG、DAG、MGDG及DGDG等的标准曲线分别为y＝99876x+15015，y＝94592x+11034，y＝146433x+27039，y＝55679x，y＝57637x+10360，y＝90406x+66582，y＝67535x+139655，y＝40581x+144358和y＝72474x+27280，根据峰面积(x)，经标准曲线计算得出各种脂质的总含量。
对磷脂中各个分子种进行质谱分析鉴定，结果如图3-7，并归纳主要甘油脂含量如表2所示。
表2
组别 叶(nmol/mg) 根(nmol/mg) 叶柄(nmol/mg) 茎(nmol/mg)
PC 5.70 7.55 0.92 1.21
PE 2.07 3.15 0.77 1.12
PS 0.37 0.025 0.27 0.016
TAG 11.36 3.34 4.40 3.88
MGDG 248.07 275.23 294.38 272.56
DGDG 116.48 114.92 120.53 117.31
DAG 3.13 1.70 1.35 1.37
PG 1.92 5.01 0.62 0.84
由图3-7和表2结果表明，不同组织中不同脂质种类含量不同。一共鉴定出218种甘油脂在内的13类脂质，包括46种TAG，15种DAG，20种PC，24种PE，13种PG，14种PI，26种PS，12种PA，16种MGDG，16种DGDG，6种LysoPC，5种LysoPE和5种LysoPG。其中，MGDG，DGDG，DAG，TAG，PS，LysoPC和LysoPG在叶片中的含量最高，而PC，PE，PG，PI和PA的含量在根中最高(图3-7)。叶和根中主要的磷脂，包括PC，PE，PG，PI和PA的含量显着高于叶柄和茎。例如，叶，根，叶柄和茎中PC含量分别为5.70、7.55、0.92和1.21nmol/mg，PE为2.07、3.15、0.77和1.12nmol/mg(图3)。不同组织中PS的含量差异不大，约为0.3nmol/mg(图4)。TAG在叶中含量最高，为11.36nmol/mg。在根，叶柄和茎中分别为3.34、4.40和3.88nmol/mg。叶，根，叶柄和茎中DAG的含量分别为3.13、1.70、1.35和1.37nmol/mg(图5)。
所有组织中，溶血磷脂的含量极低，但此方法成功地检测出主要类型的溶血磷脂(图6，图11，12)。MGDG和DGDG是叶绿体膜的主要脂质，MGDG和DGDG的含量分别为266.82和131.22nmol/mg，远高于其他三种组织的含量(图7)。
主要脂质类型在不同组织中具有不同的含量(图8-13)。例如，叶片中TAG的主要类型是C-50：3，C-52：6，C-52：2至C-52：4，C-54：3至C-54：9和C54：0，其中TAG-52：6含量最高(图9)。TAG-52：6和TAG-54：0是茎和叶柄中含量最高的TAG类型。而TAG-54：0则是根中含量最高的TAG(图9)。此外，TAG-54：0的含量在四个组织中没有太大差异(图9)。比较不同组织中其他脂质种类的含量，如图8-13所示。结果表明，基于TripleTOF的脂质组学方法适用于不同植物组织中脂质含量和种类分析。
实施例2油菜发育中种子脂质的检测
采用实施例1所建立的UPLC-TripleTOF分析方法，我们提取了开花后21、26、31、36、41、46、51、56天(DAF)油菜种子的总脂质(采用上述实施例1的方法提取脂质，每个阶段5-6次重复)。根据要求将样品稀释为工作浓度并加入内标，10μl自动进样，采用基于数据独立采集方法的MS/MSALL扫描模式对母离子进行全扫描。通过内源脂质数据搜索MS/MSALL扫描到的母离子以鉴定和定量目标脂质。
表3
Figure BDA0002321433880000121
结果表明：TAG的含量从21DAF到51DAF迅速积累，然后在51DAF之后略有下降(图14)。TAG-54：2-TAG-54：7和TAG-52：2-TAG-52：4是种子发育阶段主要的TAG类型，它们从26DAF开始迅速积累(图15)。MGDG和DGDG的含量变化趋势一致，它们在36DAF之前均增加，在36DAF之后均降低。MGDG和DGDG的含量在36DAF分别为7.32和4.76nmol/mg(图14，图19)。DAG含量变化呈钟形趋势，在46DAF含量达到最高(图14)。DAG-36：2，-36：3和-36：4是主要的DAG(图16)。
PC，PE，PG和PI等磷脂含量变化趋势显示出与MGDG相似的模式(图14)。PC在31DAF时含量最高，达到24.91nmol/mg，其中PC-34：2，-36：2，-36：3，-36：4和-36：5是主要PC类型(图16)。PA含量在26DAF时达到最高水平，然后逐渐下降(图14，图17)。此外，溶血磷脂在种子发育阶段也有少量变化(图14，图17，图18)。总体来说，不同甘油脂含量在油菜种子发育过程中显示出不同的动态变化。
实验例1方法学验证
1、线性范围确定
为了确定仪器响应不同脂质的线性范围，制备了七个不同浓度梯度的内标混合样品，每种内标的浓度为其工作浓度的0.001、0.01、0.1、0.2、1、5和10倍(方法中所述)。将不同浓度的内标混合物注入仪器，每种浓度重复三次。分析同一内标不同浓度间的线性关系。
结果表明：TAG在0.04-20nmol/ml之间线性相关强(表4)，PC在0.012-12nmol/ml之间(表5)，PA的线性相关在0.006-3nmol/ml(表5)。其他脂质在一定浓度下也具有良好的线性关系。例如，DAG为0.02-2nmol/ml，PE为0.06-6nmol/ml，PG为0.06-3nmol/ml，PI为0.0057-0.574nmol/ml，PS为0.04-2nmol/ml，MGDG浓度为0.033-3.33nmol/ml的DGDG和浓度为0.0088-0.88nmol/ml的DGDG(表5-表10)。
尽管所有脂质七个浓度条件下曲线拟合的R2也接近1，但是当浓度过高或过低时其相关性不为线性(表4-表10)。这些数据表明，TripleTOF对于大多数脂质均具有较宽线性范围，其线性范围对样品的稀释及仪器检测极限具有指导作用。
表4
Figure BDA0002321433880000131
表5
Figure BDA0002321433880000132
表6
Figure BDA0002321433880000141
表7
Figure BDA0002321433880000142
表8
标样浓度(nmol/ml) 0.0004 0.004 0.04 0.08 0.4 2 4
PS-28:0离子强度 2128.2 1794.0 7919.7 14789.6 64482.0 230354.4 372929.8
表9
Figure BDA0002321433880000143
表10
Figure BDA0002321433880000144
2、重复性，稳定性和灵敏性测定
脂质合成代谢是一个复杂的生物学过程，主要是由脂肪酸和甘油-3-磷酸酯化而成，酯化的产物在一系列酶的作用下又发生去饱和或脂肪酸链移位等过程，最好生成各种不同类型的甘油酯。实施例1中提取出的脂质配制成溶液后经过UPLC分离，大部分不同类型的脂质可以被有效分离(图1)。其中，半乳糖脂和磷脂主要在11至17.5分钟之间从色谱柱上洗脱下来。PC在13.17至15.71分钟，PA在12.13至14.18分钟，MGDG在12.09至16.56分钟，依此类推(图1)。DAG在15.52至18.45分钟之间洗脱，TAG则在最后被洗脱(22.32至25.95分钟之间)(图1)。
为验证仪器的重复性及稳定性，对同一样品进行3次进样，结果表明三个重复的总离子流色谱图可以很好地重叠(图1)。同时，为了测试仪器对不同浓度脂质响应的灵敏度，将同一样品配制成三种不同浓度梯度(基于干重配置为0.5、1和2mg/ml溶液)并进样。色谱图显示这三个不同浓度的峰高响应良好，且不同样品之间同一峰的保留时间一致(图2)。
这些结果表明，用UPLC偶联的TripleTOF检测植物脂质具有良好的重复性，稳定性和灵敏性。
3、本发明的方法所用质谱仪的准确性评估
质谱仪的准确性是评估仪器质量的主要参数。LipidView 2.0预测的脂质加合物及其特征碎片离子的m/z，其保留了小数点后4个有效数字(附件，excel)。对比内源数据库和仪器实测结果，至少在小数点后2位有效数字的水平上，仪器检测到的所有内部脂质标准品的m/z几乎与预测值保持一致性。同样地，碎片离子的m/z也达到了类似的精准度。精确的母离子m/z可以将所有的目标甘油脂类区分开，从而对脂质定性。例如，PC-34：1加合物的m/z预测值为760.5851，被检测值为760.5849。PG-34：4加合物的m/z预测值为760.5123，检测值为760.5101(图20c，图20d)。根据PC-34：1和PG-34：4母离子的m/z可以准确将它们鉴定出。在极少数情况下，如果两种不同脂质的m/z非常接近，则可以通过查看它们的特征产物离子将它们区分开。例如，PA-36：2加合物的检测的m/z为718.5361，而PE-34：1加合物的检测的m/z为718.5352(图20a，图20b)。通过判断母离子加合物的m/z很难区分这两个物质。然而，追踪它们的特征性碎片离子，根据其NL的m/z的差异将它们区分开(图20a，图20b)。此外，这两个物质的保留时间也不同。这些结果表明，首先可以通过母离子加合物的m/z鉴定脂质的种类。对于母离子加合物m/z值比较接近的脂类，可以追踪其特征碎片离子m/z值将其区分开。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、样品前处理：收集植物组织或植物种子并提取其脂质得到脂质粗提物；
步骤2、液相分离：向所得的脂质粗提物中加入混合内标，然后上UPLC色谱仪进行液相色谱分离，所述UPLC色谱仪的色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18柱，流动相A为水：甲醇：乙腈：300mM乙酸铵＝20：20：20：1；流动相B为异丙醇：甲醇：300mM乙酸铵＝180：20：3，所述比值均为体积比，采用梯度洗脱；柱温设定为35～45℃；洗脱液的流速为0.1～0.5ml/min；进样体积为5～10μl；
步骤3、将步骤2所得的洗脱液进行质谱检测分析：采用TripleTOF质谱仪，配以ESI离子源，正离子模式检测。
2.如权利要求1所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1中脂质提取步骤为：
S1、向植物组织中加入有机溶剂A于70～80℃下浸泡；
S2、分别加入有机溶剂B和C进行萃取，合并萃取液；
S3、向萃取液中加入KCl，离心，弃上清，随后加入ddH2O，离心，弃上清，氮气吹干后用溶剂D复溶，
所述有机溶剂A为含0.01～0.1％BHT的异丙醇；所述有机溶剂B为体积比为3～8：1～5的氯仿和水；所述有机溶剂C为体积比为1～5：1的含0.01～0.05％BHT的氯仿与甲醇的混合物；所述溶剂D为氯仿。
3.如权利要求2所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述S2中先加入有机溶剂B萃取30～60min，后加入有机溶剂C萃取30～60min，所述步骤重复4～6次，直到样品的颜色变为白色，合并萃取液。
4.如权利要求1所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，各时间段流动相B所占体积比分别为：0～2min，25％流动相B；2～4min，25％～40％流动相B；4～22min，40％～95％流动相B；随后用95％流动相B保持5min；再用25％流动相B保持5min。
5.如权利要求1所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述混合内标包含0.06nmol/μl的PA，PE，PG，LPE和LPG，0.12nmol/μl的PC和LPC，0.04nmol/μl的PS，0.0574nmol/μl的PI，0.4nmol/μl的TAG，0.2nmol/μl的DAG，0.281nmol/μl的MGDG和0.296nmol/μl的DGDG。
6.如权利要求1所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤3中ESI离子源温度设置为550℃，离子喷雾电压和去簇电位分别为5.5kV和100V，雾化气体和辅助空气的压力均为50psi，氮气气帘压力为35psi；扫描条件设置为：m/z为400～1000Da且聚集时间为250毫秒。
7.如权利要求1所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，采用信息依赖性获取的数据收集模式扫描碎片离子，所述碎片离子扫描条件设置为：m/z为80-1000Da，累积时间为100ms，碰撞能量为35±15eV；采用信息依赖性获取的数据收集模式进行数据收集时母离子流筛选标准为：设置动态背景消除，m/z为400-1000Da且离子强度高于100cps的前10个最强的母离子。
8.如权利要求1-7任一项所述的植物中脂质的色谱-质谱检测方法，其特征在于，所述植物为油菜。
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