CN116183801A - 检测胰岛素和c肽的液相色谱-质谱方法、试剂盒和系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测胰岛素和C肽的液相色谱‑质谱方法。具体涉及用于检测胰岛素和C肽的方法、试剂盒和系统，本发明中涉及到的方法还可用于胰岛素类似物药物的检测。本发明的通过液相色谱‑质谱测定样品中待检测物质的量的方法中，所述待检测物质是胰岛素和C肽和/或胰岛素类似物，所述方法包括：(a)提供用于定量测定待检测物质的参照；(b)准备样品；(c)对所述样品进行前处理，所述前处理包括蛋白萃取和固相萃取；(d)使经过所述前处理的所述样品和参照通过液相色谱；(e)通过质谱检测所述待检测物质。

Description

检测胰岛素和C肽的液相色谱-质谱方法、试剂盒和系统

技术领域

本发明涉及生物医学检验领域，尤其涉及用于检测胰岛素和或C肽的方法、试剂盒和系统。

背景技术

胰岛素是一种由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，具有重要的生理功能，在葡萄糖调节以及能量、合成代谢中发挥重要作用。糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或对胰岛素的抵抗，以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病。糖尿病有I型和II型两种类型。I型糖尿病是由于身体自身防御系统的自身免疫反应而导致胰腺β细胞损伤，使其很少或根本不产生胰岛素。II型糖尿病是由于胰岛素抵抗，即自身产生的胰岛素不能有效降低血糖水平。

C肽(C-Peptide)又称连接肽，由胰岛β细胞分泌，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。C肽与胰岛素由前体胰岛素等摩尔地产生和释放，因此，C肽与胰岛素浓度密切相关。由于C肽在生理上基本上是惰性的，在循环中持续时间更长，含量更加稳定，而胰岛素的半衰期却只有几分钟，由此，C肽是内源性胰岛素分泌情况的最佳衡量指标。同时检测胰岛素和C肽，可用于区分糖尿病的类型，对于糖尿病前期临床诊断具有重要意义。除了在糖尿病中的应用外，同时检测胰岛素和C肽的测定法在低血糖病因的鉴别诊断中也具有临床实用性。

另一方面，长效和速效的人胰岛素类似物药物目前在临床上广泛用于控制糖尿病患者血糖水平，可治疗I型胰岛素依赖型，也可用于治疗II型糖尿病。目前国内厂家生产上市的胰岛素类似物药物有甘精胰岛素、赖脯胰岛素和天冬胰岛素。准确检测胰岛素类似物的方法不仅可应用于治疗药物浓度监测，还可应用于确认体育运动员是否存在滥用胰岛素。世界反兴奋剂机构禁止使用胰岛素，要求其认可的实验室对运动员的样品进行测试，以确定其是否使用胰岛素。此外，检测胰岛素类似物具有法医学意义，例如在某些死亡案件中，过量注射胰岛素药物是排查因素之一。因此，建立准确度高、特异性强的胰岛素类似物检测方法是非常必要的。

但是，目前对胰岛素、C肽和胰岛素类似物的检测尤其是定量检测还存在诸多问题。

首先，以往，对胰岛素和C肽的定量检测主要采用免疫法，但免疫法存在着诸多不足。根据Deng等人的报道，目前各厂家商业化的免疫试剂盒并未向国际标准物质进行溯源，导致各厂家检测的同一样品可能存在较大偏差(参见Yuhang Deng et al.,The potentialfor isotope dilution-LC-MS/MS to improve laboratory measurement of C-peptide:Reasons and critical determinants.Journal of Mass Spectrometry and Advancesin the Clinical Lab.Volume 21,August 2021,Pages 1-9)。而且，病人血清中自抗体和异嗜性抗体的存在也会干扰免疫法的定量结果。另外，由于胰岛素类似物和内源胰岛素的序列高度相似，不同厂家的免疫试剂盒对于胰岛素类似物的区分能力各不相同，极大的影响了血清中内源胰岛素和胰岛素治疗药物的定量检测。

出于上述原因，质谱检测方法已经被越来越多的医院检验科和临床实验室所认可。质谱法由于具有优良的灵敏度、特异性和稳定性而在一些临床应用领域例如新生儿代谢性疾病的筛查、维生素D的检测等中成为了首选的检测方法。

但是，质谱法仍然存在一些问题。首先，作为待检测物质的胰岛素等是分子量较大的多肽，其质谱检测离子化效率低，而人血样品中胰岛素和C肽的绝对浓度都在较低的pg/mL水平，因此检测的灵敏度很难达到要求；其次在样品中往往是低浓度的待检测物质与高丰度的蛋白质(白蛋白、IgG等)共存，这也给待检测物质的检测带来了挑战。

目前已经报道了一些针对胰岛素等的质谱检测方法，但都存在各种不足。

中国专利公开CN103392219A公开了一种通过串联质谱法测定生物样品中胰岛素的量的方法，其用还原剂打开胰岛素的二硫键，通过对胰岛素B链检测来代替对完整胰岛素的检测。这种间接测量方法很容易受到干扰物的影响，且不适于同时测量胰岛素类似物。

中国专利公开CN110914691A公开了一种评估糖尿病和糖尿病前期患者中胰岛素抵抗性的方法，其对胰岛素和C肽进行了基于免疫富集的一系列前处理，所述前处理包括采用免疫亲和抗体法和在线固相萃取。但为了进行这样的免疫富集，需要对抗体进行特殊定制，价格昂贵，且很难得到所有胰岛素类似物的抗体。

Thomas等人(参见Thomas et al.,Simpl ified quantification of insulin,its synthetic analogs and C-peptide in human plasma by means of LC-HRMS.DrugTest Anal.2020Mar；12(3):382-390.doi:10.1002/dta.2765.Epub 2020Feb 5)报道了一种通过高分辨质谱定量人血浆中胰岛素、胰岛素类似物和C肽方法，其中采用固相萃取加真空干燥后重溶的前处理方法，操作繁琐，并且其胰岛素及其类似物回收率仅为38–57％，很难满足临床检测需求。

发明内容

本发明人使用液相色谱-串联质谱仪，并对检测胰岛素和C肽的前处理方法和检测条件进行研究，其结果是，发现通过蛋白萃取结合SPE技术进行样品前处理，并使用超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-MS/MS)，能够建立可靠、稳定、灵敏度高的液相色谱-质谱定量方法，实现胰岛素和C肽的同时定量检测。

本发明的一个方面涉及一种通过液相色谱-串联质谱测定样品中待检测物质的量的方法，其中，所述待检测物质是胰岛素和C肽和/或胰岛素类似物，所述方法包括：

(a)提供用于定量测定待检测物质的参照；

(b)准备样品；

(c)对所述样品进行前处理，所述前处理包括蛋白萃取和固相萃取；

(d)使经过所述前处理的所述样品和参照通过液相色谱；

(e)通过质谱检测所述待检测物质。

本发明的另一个方面涉及一种液相色谱-质谱试剂盒，所述试剂盒包括参照、萃取剂、SPE试剂，其中，SPE试剂包括SPE稀释剂和SPE洗脱剂；

其中，所述SPE稀释剂为含有0-5％比例添加剂以及0-20％比例有机溶剂的水溶液；或者，所述有机试剂包含甲醇、乙腈、乙醇和异丙醇的一种或多种；或者，所述添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水的一种或多种。

本发明的又一方面涉及一种通过液相色谱-质谱测定样品中待检测物质的量的系统，所述系统包括：

如前所述的试剂盒；

用于准备可能含有一种或多种待检测物质的样品的模块；

用于对所述样品进行前处理的模块；

用于使经过所述前处理的所述样品和参照通过液相色谱的模块；和

用于通过质谱检测所述待检测物质的量的模块。

本方法的胰岛素和C肽的定量下限(LLOQ)分别低至0.1ng/mL和0.5ng/mL，灵敏度高，可满足临床检测的需求。本发明的方法仅需少量样品和常用检测设备，样品处理过程仅需2-3小时即可完成，且适用于自动化样品前处理。整个样品处理和分析定量过程不需额外特殊试剂和仪器，适用于大多数临床实验室和临床检测机构。

附图说明

图1示出了胰岛素和C肽检测总离子流(TIC)图和MRM检测图，其中，图1a胰岛素和C肽检测总离子流(TIC)图，图1b胰岛素和C肽MRM检测图(定量离子对)。

图2示出了胰岛素类似物的总离子流(TIC)图和MRM检测图，其中，图2a胰岛素类似物总离子流(TIC)图，图2b胰岛素类似物MRM图(定量离子对)。

图3示出了胰岛素和C肽的线性图，其中，图3a示出了胰岛素线性图，图3b示出了C肽线性图。

具体实施方式

以下，对本发明的具体实施方式进行说明。

在一个实施方式中，本发明的通过液相色谱-质谱测定样品中待检测物质的量的方法的待检测物质是选自胰岛素和C肽的至少一种，本发明的方法包括：

(a)提供用于定量测定待检测物质的参照；

(b)准备样品；

(c)对所述样品进行前处理，所述前处理包括蛋白萃取和固相萃取；

(d)使经过所述前处理的所述样品通过液相色谱；

(e)通过质谱检测所述待检测物质。

待检测物质

在本发明的一个实施方式中，本发明的方法的样品可以包含一种或多种待检测物质。

在本发明的一个实施方式中，待检测物质选自胰岛素和C肽。

在本发明的另一个实施方式中，待检测物质是选自胰岛素、C肽和胰岛素类似物的至少一种。

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质的刺激而分泌的一种激素，其是一种多肽。C肽又称连接肽，也由胰岛β细胞分泌，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原，连接胰岛素的2个肽链，并在处理期间从胰岛素原释放并且随后从胰岛β细胞共分泌。因此C肽与胰岛素以等摩尔量的方式被分泌。

但是由于半衰期和肝清除率的差异，C肽和胰岛素的在外周血内的水平不再是等摩尔量的，但是仍然具有高度相关性。在本实施方式中，可通过本发明的方法检测样品中的胰岛素和C肽。

在本发明的方法中，所述待检测物质还可包括胰岛素类似物。所述胰岛素类似物是指既可模拟正常胰岛素的分泌，同时在结构上与胰岛素也相似的物质，其是通过对胰岛素的肽链进行修饰，有可能改变胰岛素部分理化性质和生物学特征，从而研制获得的较传统人胰岛素更适合人体生理需要的具备胰岛素功能的蛋白质。

所述胰岛素类似物包括但不限于赖脯胰岛素(Lispro)、低特胰岛素(Detemir)、德谷胰岛素(Degludec)、甘精胰岛素(Glargine)、赖谷胰岛素(Glulisine)和门冬胰岛素(Aspart)等。

在本发明的一个实施方式中，待检测物质对于对象而言可以是外源性或是内源性的。同时检测的不同待检测物质可以都是外源性的，也可以都是内源性的，也可以各自独立的是外源性或内源性的。

根据被检测的样品和待检测物质，本发明的方法可适用于：判断低血糖的原因，区分1型糖尿病与2型糖尿病，判断治疗糖尿病药物的血药浓度和疗效，确认有检测需要的人群例如运动员是否存在胰岛素的滥用、法医学中胰岛素药物过量注射问题。

生物样品及其采集

用于本发明的方法的合适的样品包括可包含待检测的物质的任何样品。

在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；即，从任何生物来源比如动物、细胞培养物或器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物比如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选地，是人。

优选地，样品包括体液，比如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液或组织样品。更优选地，所述样品是血浆或血清。在一个实施方式中，所述样品是静脉血、足底血、或指尖血。

前处理

如前所述，在生物样品中，往往低浓度的待检测物质与高丰度的其他蛋白质(白蛋白、IgG等)共存。在该情况下，为了降低基质干扰、提高检测灵敏度和特异性，往往需要对样品进行沉淀、萃取、净化、富集等前处理。对样品进行前处理以富集待检测物质将有助于优化检测结果。可根据待检测物质的特性和样品的类型来选择合适的前处理方法。

在一些实施方式中，所述前处理包括蛋白萃取。在本文中，蛋白萃取也称为蛋白沉淀，其是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。通过蛋白萃取，可一定程度上去除样品中的高丰度的其他蛋白质，如白蛋白、IgG等。

通常，蛋白萃取所使用的萃取剂可以是甲醇、乙醇、乙腈或异丙醇，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择。

蛋白萃取所使用的萃取剂中有机试剂比例大于40％，有机溶剂可以是选自乙腈、甲醇、乙醇和异丙醇试剂中一种或将两种以上混合而得的有机溶剂。蛋白萃取所使用的萃取剂中可包含0-10％比例的添加剂。所述添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水、Tris-HCl和Tris碱的一种或两种以上。

优选地，蛋白萃取所使用的萃取剂可包含甲醇或乙醇，更优选地，可包含甲醇。用作蛋白萃取萃取剂的甲醇或乙醇的浓度为80％～100％。在一些实施方式中，也可以在萃取剂中加入一定量的有机酸(例如甲酸、乙酸或者三氯乙酸)来提高蛋白萃取效率。

为了提高萃取回收率，可进一步控制添加在生物样品中的萃取剂的比例。以体积比计，生物样品与萃取剂之比的下限可以为1：2，优选地，为1：3，更优选地，为1：4；其上限可以为1：8，优选地，为1：7，更优选地，为1：6，进一步优选地，为1：5。

萃取剂中有机溶剂占比大于40％。萃取剂中含有稳定同位素标记的人胰岛素和C肽，含量为0.1～10ng/mL。

在一些实施方式中，所述前处理包括固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)。SPE是由于溶解或悬浮于溶液(即流动相)的组分对溶液穿过或围绕的固体(即固相)的亲和力，化学混合物分离为组分的过程。在一些情况下，在流动相穿过或围绕固相时，固相可以保留流动相的非期望的组分，其导致纯化流动相中的待检测物质。在其它情况下，固相可以保留待检测物质，其允许流动相的非期望的组分穿过或围绕固相。在这些情况下，然后使用第二流动相将保留的待检测物质从固相洗脱下用于进一步的加工或分析。

通常，SPE柱填充材料对分析物的亲和力可能由于各种机制中的任一种，比如一种或多种化学相互作用或免疫亲和相互作用。在一些实施方式中，在不使用免疫亲和柱填充材料的情况下实施待检测物质的SPE。即，在一些实施方式中，通过不是免疫亲和柱的SPE柱从样品萃取待检测物质。

SPE固相萃取的填料可以是非极性保留型、极性保留型、离子交换型中的任一种。在一个实施方式中，优选极性保留型SPE固相萃取填料。在一个实施方式中，SPE固相萃取使用HLB(Hydrophile Lipophilic Balance)固相萃取柱。HLB固相萃取柱是聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮亲水亲脂平衡柱,由特殊的共聚合技术制备而成,含有特定比例的亲水基和疏水基。其中疏水性的二乙烯基苯结构保留非极性化合物,亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮结构保留极性化合物。

SPE的操作过程可包括活化、平衡、上样、清洗和洗脱5个步骤。针对不同的待检测物质和SPE类型，本领域技术人员知晓如何对活化、平衡、上样、清洗和洗脱步骤中所使用的试剂进行选择。

在本发明中也将SPE操作过程中所使用的试剂称为SPE试剂。SPE试剂至少包括SPE稀释剂和SPE洗脱剂。

在活化步骤中，可选择使用0.1-1mL甲醇或乙腈，优选地，使用0.2-0.5mL甲醇或乙腈。

在平衡步骤中，可使用0.1-1mL SPE稀释剂，优选地，使用0.2-0.5mL SPE稀释剂。

在清洗步骤中，可使用0.1-1mL SPE稀释剂，优选地，可使用0.2-0.5mL SPE稀释剂。

在洗脱步骤中，可使用0.02-0.5mL SPE洗脱剂，优选地，可使用0.02-0.1mL SPE洗脱剂。

在一些实施方式中，萃取剂为80％-100％甲醇或乙醇。优选地，在一些实施方式中，SPE稀释剂为10％-20％甲醇或乙醇溶液。优选地，在一些实施方式中，SPE洗脱剂为60-90％甲醇或乙腈溶液。

其中，SPE试剂至少包括SPE稀释剂和SPE洗脱剂。SPE稀释剂为含有0-10％比例添加剂以及0-30％比例有机溶剂的水溶液。其中，有机试剂包含选自甲醇、乙腈、乙醇和异丙醇的一种或多种；添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水、Tris-HCl、Tris碱的一种或多种。SPE洗脱剂中含有一种或多种有机试剂以及0-10％比例的添加剂。其中，有机试剂包含选自甲醇、乙腈、乙醇的一种或多种，有机试剂占比大于20％。其中，添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水、Tris-HCl和Tris碱的一种或多种。

在一些实施方式中，整个SPE过程在2h内完成，优选地，在1.5h内完成，更优选地，在1h内完成，进一步优选地，在30min内完成。

优选地，在一些实施方式中，所述前处理包括蛋白萃取和SPE。更优选地，所述前处理包括在SPE之前进行蛋白萃取。

在其他实施方式中，在样品前处理中，也可以使用基于反向色谱机理的C18SPE或基于离子交换机理的SPE柱。

内标和外标

在本发明的实施方式中，本发明的方法包括提供用于定量测定待检测物质的参照。在本发明中，所述参照可以是外标，也可以是内标。在优选的实施方式中，所述参照同时包括外标和内标。

在一些实施方式中，本发明的方法包括向样品添加内标。在一些实施方式中，可单独添加内标。在一些实施方式中，可通过将内标添加在样品制备或样品前处理中所使用的任意试剂中，来向样品中添加内标。优选地，通过在蛋白萃取所使用的萃取剂中添加内标，向样品中添加内标。

在一些实施方式中，根据待检测物质的种类添加相应的内标。

在待检测物质包括胰岛素或胰岛素类似物的实施方式中，胰岛素或胰岛素类似物的内标可以是牛胰岛素或胰岛素重内标(heavy internal standard)。在待检测物质包括C肽的实施方式中，C肽的内标是C肽重内标。在一些实施方式中，内标是被标记的。在一些实施方式中，内标是氘代(2H)、13C或15N同位素标记的。因此，在待检测物质包括胰岛素、C肽或胰岛素类似物的实施方式中，胰岛素或胰岛素类似物的内标可以是牛胰岛素或氘代(2H)或13C或15N稳定同位素标记的人胰岛素。在待检测物质包括C肽的实施方式中，C肽的内标可以是氘代、13C或15N稳定同位素标记的C肽。在本文中，当通过质谱技术进行分析时，相对于未标记的分子，“同位素标记”在标记的分子中产生质量偏移。合适的标记的实例包括氘(2H)、13C和15N。可以在分子中的一个或多个位置处并入一个或多个同位素标记，并且可以在相同同位素标记的分子上使用一种或多种同位素标记。

在本发明的方法中，可以在样品中提供可单独检测的内标，其量在样品中也是确定的。在利用可单独检测的内标的实施方式中，样品中存在的全部或部分待检测物质和内标都被电离，从而产生在质谱仪中可检测的多种离子，并且通过质谱法检测由每个产生的一种或多种离子。在这些实施方式中，通过与检测的内标离子的量进行比较，可以使由待检测物质产生的离子的量与样品中待检测物质的量的存在相关联。在一些实施方式中，例如，在优选的实施方式中，一种或多种形式的同位素标记的胰岛素可以被用作内标使离子的量与原始待检测物质分子的量相关的众多其它方法将是本领域普通技术人员熟知的。

在一些实施方式中，内标被用于生成计算待检测物质的量的标准曲线。生成和使用这样的标准曲线的方法是本领域熟知的。在一些实施方式中，当对通过将已知量的校准品添加到样品中产生的内标的校准曲线进行内部标准化时，每个样品中每种分析物的反算量可以通过比较样品响应或响应比来测定。通过计算峰面积比并建立内标的标准曲线，然后该内标的标准曲线可以被用于测定样品中待检测物质的量。

在一些实施方式中，本发明的方法包括向样品添加外标。在一些实施方式中，可单独添加外标作为校准品。在一些实施方式中，可在样品之外配制待检测物质的一系列不同浓度的标准溶液并由此制作外标的标准曲线。在一些实施方式中，对生物样品中待检测物质的浓度进行预估，并由此设置所述一系列不同浓度的标准溶液，因此，所述不同浓度的标准溶液的浓度是已知的。将该一系列不同浓度的标准溶液与样品一起进行平行检测，得到外标的标准曲线。在一些实施方式中，在每一次实施本发明的方法时，均使用校准品制作一次外标的标准曲线。

在一些实施方式中，本发明的方法也可使用预先制作的标准曲线。例如，在本发明的试剂盒中所有试剂已经确定的情况下，预先制作标准曲线，并将其作为试剂盒的说明书的一部分，与试剂盒一起使用。

优选地，本发明的方法在每一次实施本发明的方法时，使用校准品制作一次外标的标准曲线。

液相色谱

液相色谱(LC)是指当流体均匀地渗透通过细碎物质柱或通过毛细管通道时选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的方法。阻滞是当流体相对于固定相移动时由一种或多种固定相与大量流体(即流动相)之间的混合物组分的分布引起。“液相色谱”包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)、高湍流液相色谱法(HTLC)、超高效液相色谱(UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography)。

在本发明的方法中，将液相色谱与质谱联用，以检测待检测物质的量。在一些实施方式中，本发明的方法将超高效液相色谱与质谱联用。在优选的实施方式中，本发明的方法将液相色谱与四极杆质谱仪联用。在更优选的实施方式中，本发明的方法将超高效液相色谱与四极杆质谱仪连用。在更优选的实施方式中，本发明的方法将超高效液相色谱与串联质谱连用。在进一步优选的实施方式中，本发明的方法将超高效液相色谱与串联四极杆质谱连用。在进一步优选的实施方式中，采用常规C18色谱柱。流速0.2-0.6mL/min。流动相A为水相试剂，流动相B为有机相试剂。其中，有机相试剂包含50-100％的甲醇、乙腈、异丙醇或乙腈水溶液或者它们的混合溶剂。流动相A和B中添加0-1％的添加剂，添加剂包括甲酸、乙酸、甲酸铵或乙酸铵等。

质谱

在本发明中，质谱或MS通常是指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。在质谱技术中，一种或多种待检测物质的分子被电离，然后这些离子被导入质谱仪，其中，由于电场的组合，离子在空间中遵循依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。

在某些实施方式中，质谱使用四极杆质谱仪。在四极杆或“极杆离子阱质谱仪中，振荡射频(RF)场中的离子经受与电极之间施加的直流(DC)电位、RF信号的振幅和m/z成正比的力。可以选择电压和振幅，以便只有具有特定m/z的离子穿过四极杆的长度，而所有其他离子都被偏转。因此，四极杆仪器可以作为注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”起作用。

在一些实施方式中，使用“串联质谱”(MS/MS)。串联质谱(MS/MS)是给予一组质谱方法的名称，其中从样品中产生的“母体或前体”离子被裂解以产生一种或多种“碎片或产物”离子，随后通过第二个质谱程序进行质量分析。MS/MS方法可用于分析复杂的混合物，尤其是生物样品，部分原因是MS/MS的选择性可以最大限度地减少分析前对样品进行广泛净化的需要。在MS/MS方法的实例中，前体离子从样品中产生并通过第一个质量过滤器(四极杆1，也称Q1)以选择那些具有特定质荷比的离子。然后，这些离子典型地通过与第二个四极杆(也称Q2)中的中性气体分子碰撞而碎裂，以产生在第三个四极杆(也称Q3)中选择的产物(碎片)离子，其质谱由电子倍增器检测器记录。如此产生的产物离子光谱表明前体离子的结构，而质量过滤的两个阶段可以从复杂混合物的常规质谱中存在的干扰种类中去除离子。

在一些实施方式中，使用串联四极杆质谱。

可以使用以下任何离子源进行电离：大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)、电子碰撞电离(EI)、电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸(MALDI)、表面增强激光解吸电离(SELDI)、热喷雾电离、电感耦合等离子体(ICP)和快速原子轰击(FAB)。本领域技术人员能够基于待检测物质的类型、样品的类型、检测器的类型、正对负模式的选择等确定电离方法的选择，可以以正或负模式电离待检测物质。在进一步优选的实施方式中，采电喷雾电离(ESI)电离源，正离子模式。

在某些实施方式中，可以测量来自单一先驱离子的单一碎片离子的相对丰度。在一些实施方式中，可以测量自单一先驱离子的两种或更多种碎片离子的相对丰度。在这些实施方式中，每种碎片离子的相对丰度可以经受任何已知的数学处理以定量地评估样品中最初的待检测物质。在其它实施方式中，来自两种或更多种先驱离子的一种或多种碎片离子可以如上面被测量和用于定量地评估样品中最初的待检测物质。在进一步优选的实施方式中，在所述待检测物质是胰岛素的情况下，质谱通过测定质荷比(m/z)为968.8±0.5或1162.3±0.5的母离子和选自m/z为136.0±0.5、651.8±0.5或226.1±0.5的一种或多种碎片离子来检测胰岛素，通过测定质荷比(m/z)为979.3±0.5的母离子和选自m/z为137.0±0.5和229.3±0.5的碎片离子来检测与胰岛素相应的内标；在所述待检测物质是C肽的情况下，质谱通过测定质荷比(m/z)为1007.7±0.5的母离子和选自m/z为147.1±0.5、785.2±0.5和927.1±0.5的碎片离子来检测C肽，通过测定质荷比(m/z)为1011.7±0.5的母离子和选自m/z为147.0±0.5、338.6±0.5和939.0±0.5的碎片离子来检测与C肽相应的内标；在所述待检测物质是胰岛素类似物的情况下，质谱通过测定质荷比为1162.3±0.5、1011.3±0.5、971.8±0.5和758.7±0.5的一种或多种母离子和选自136.1±0.5、1139.4±0.5、143.0±0.5和217.1±0.5的一种或多种碎片离子来检测胰岛素类似物，质谱通过测定质荷比为979.3±0.5的母离子和选自质荷比为137.0±0.5和229.3±0.5的一种或多种碎片离子来检测与胰岛素类似物相应的内标。

试剂盒

本发明还提供用于本发明的方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括包括参照、萃取剂、SPE试剂。所述试剂盒中的参照包括多个校准品和内标。本发明的试剂盒还可包括质控品。所述质控品可包括LQC和HQC。所述萃取剂是蛋白萃取中所使用的萃取剂。所述SPE试剂包括SPE中所使用的一系列试剂，包括但不限于活化试剂、稀释剂、洗脱剂。

在所有试剂中均不包含内标的情况下，本发明的试剂盒还可包括与待检测物质相应的内标。

系统

在一些实施方式中，本发明的液相色谱-质谱方法可以在线进行。在线(online)或者线上(inline)是指在不需要操作者介入的情况下进行的过程。相反，离线或线下指的是需要操作者手动介入的过程。

例如，如本文所公开的，本发明的方法的任一步骤均可以由计算机控制，即在线进行。但是，虽然本发明的方法中的一些或所有步骤和包括所述系统的模块可以是在线的，但是在某些实施方式中，一些或所有步骤也可以离线进行。

在一些实施方式中，计算机包含一个或多个数据处理器和/或包含指令(例如软件程序)的非暂时性计算机可读存储介质。因此，本文还公开了一种包含指令的非暂时性计算机可读存储介质，当在一种或多种计算机上执行该指令时，使一种或多种计算机执行包含本文公开的方法的至少一个步骤的操作。

由此，本发明还提供通过液相色谱-质谱测定样品中待检测物质的量的系统，所述系统包括：

用于本发明的方法的试剂盒；

用于提供可能含有一种或多种待检测物质的样品的模块；

用于对所述样品进行前处理的模块；

用于使经过所述前处理的所述样品通过液相色谱的模块；和

用于通过质谱检测所述待检测物质的模块。

下面结合实施例进一步说明本发明。

实施例

根据本发明和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解以下实施例仅是示例性的，并且在不脱离本公开主题范围的情况下可以采用多种改变、变型和变更。

实施例1胰岛素和C肽检测准备

人胰岛素(中国计量科学研究院，批号：P2078283)在0.1％甲酸中溶解和稀释，配置0.25mg/mL的储备液。人C肽(中国计量科学研究院，批号：P2078282)在0.1％甲酸中溶解和稀释，配置0.125mg/mL的储备液。人胰岛素储备溶液使用0.1％甲酸以1∶250进行进一步稀释，人C肽溶液使用0.1％甲酸以1∶25进行进一步稀释，配置成胰岛素和C肽的混合次级储备液。

使用人血清空白基质将含有胰岛素和C肽的混合次级储备液按照1：100的比例进行稀释，得到线性最高点样品C8。其他线性浓度点样品及质控品则由人血清空白基质按照设定的比例稀释C8得到。稀释后，混匀，得到不同浓度的标准品溶液。标准品溶液现配现用。其他配置好的样品则在-60至-90℃下储存直到使用。

实施例2胰岛素和C肽的萃取剂优化

采用含有不同种类及比例的有机溶剂做萃取剂，与理论浓度及溶剂组成均一致的标准品纯溶液进行对比，计算萃取回收率，结果如表1所示。

表1a胰岛素蛋白萃取回收率

表1b C肽蛋白萃取回收率

可接受的萃取剂回收率在85％-115％以内。因此，根据表1的结果，在使用80-100％异丙醇、甲醇或乙醇溶液作为蛋白萃取的萃取剂、人血清样品与蛋白萃取剂的体积比为1：3～1：5的情况下，可获得较好的蛋白萃取回收率。

实施例3胰岛素和C肽的SPE稀释剂优化

对SPE稀释剂进行优化时加入一定比例有机相的水溶液做稀释剂，样品经SPE处理后，与理论浓度及溶剂浓度均一致的标准品纯溶液进行对比，计算胰岛素和C肽的绝对回收率，结果如表2所示。

表2胰岛素和C肽SPE绝对回收率

根据表2的结果，在使用体积比为10％-20％的甲醇、乙腈或乙醇溶液作为SPE稀释剂的情况下，胰岛素和C肽的绝对回收率均大于80％。

实施例4胰岛素和C肽的样品前处理

1)蛋白萃取：向100μL人血清样品中添加500μL甲醇作为萃取剂，振荡摇匀，离心10min。在蛋白萃取的萃取剂中已经预先添加了0.5ng/mL同位素标记的人胰岛素和5ng/mL同位素标记的C肽作为内标，所以在整个分析过程中，不需额外添加内标。

2)HLB SPE处理：取出300μL上清液，加入500μL SPE稀释剂进行稀释，混匀。将稀释后溶液用于上样。固相萃取操作过程可在96孔板正压萃取仪器或负压萃取仪器上进行。以下为具体SPE操作过程：

a、活化：采用300μL纯甲醇活化SPE小柱，重复操作两次；

b、平衡：采用300μL SPE稀释剂平衡SPE小柱，重复操作两次，其中，SPE稀释剂为10％甲醇水溶液；

c、上样：将蛋白萃取后离心得到的上清液经稀释后，取500μL进行上样；

d、清洗：用300μL SPE稀释剂清洗SPE柱，重复操作两次。

e、洗脱：用50μL SPE洗脱剂洗脱色谱柱，重复操作两次，其中SPE洗脱剂为70％乙腈溶液。

整个SPE过程可在30min内完成。

3)将经SPE处理后收集到的洗脱液振荡摇匀后，即可上机检测。

实施例5胰岛素和C肽的液相色谱和质谱参数

采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18Column(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱进行检测，柱温40℃，进样量10μL，流动相A相和B相分别采用0.1％ FA水和0.1％ FA乙腈溶液，每个样品的检测时间为4分钟。

质谱采用Waters Xevo TQ-S，使用电喷雾离子源的正离子模式进行检测。通过UPLC-MS/MS，获得了图1的结果。图1示出了胰岛素和C肽检测总离子流(TIC)图和MRM检测图，其中，图1a胰岛素和C肽检测总离子流(TIC)图，图1b胰岛素和C肽MRM检测图(定量离子对)。

实施例6胰岛素和C肽的线性验证

使用高、低浓度的人血清样品按照不同比例稀释成8个不同浓度点，三天三个批次检测，验证线性范围。实验数据如下：

表3a线性实验结果表

/>

表3b线性拟合常数统计表

批次	胰岛素标准曲线拟合常数R2	C肽标准曲线拟合常数R2
			Lot-1	0.997	0.997
Lot-2	0.995	0.996
			Lot-3	0.995	0.992

图2显示了胰岛素和C肽的线性图，其中，图2a示出了胰岛素线性图，图2b示出了C肽线性图。数据表明，胰岛素在0.1-10ng/mL线性范围内，C肽在0.5-50ng/mL范围内，线性标准曲线拟合常数R²均大于0.98，符合临床检测要求。

实施例7胰岛素和C肽的正确度验证

将高浓度标准溶液加入到血清样品中，所加入标准溶液的体积不超过混合样品总体积10％。配制高、低2个浓度回收样品，一个分析批内检测，每个样品检测3次，计算其平均值和回收率。

表4正确度实验结果表

检测结果显示，高、低浓度加标样品的回收率在85％-115％，各平行样CV值≤15.0％，符合临床检测要求。

实施例8胰岛素和C肽的精密度验证

批内精密度：检测一个分析批高、中、低浓度水平的样品，每个浓度检测6次，使用变异系数进行评价。

批间精密度：检测一个分析批高、中、低浓度样品，每个浓度重复检验6次，三天三批，使用相对极差R进行评价。

实验数据如下：

表5a批内精密度实验结果

表5b批间精密度实验结果

/>

批内精密度评价显示，批内精密度系数≤15％；批间精密度评价显示，批间变异系数均≤15％；极差R值均≤15％，精密度评价符合临床检测要求。

实施例9胰岛素和C肽的定量下限(LLOQ)验证

对线性最低点样品(胰岛素0.1ng/mL以及C肽0.5ng/mL)平行检测5次，三天三个批次检测，计算测量值与理论值偏差，以及变异系数(CV值)。

表6a定量下限(LLOQ)验证实验结果

/>

表6b定量下限(LLOQ)验证批间变异系数(CV值)

实验结果显示，3个批次样品测量偏差≤20.0％，变异系数≤15.0％，符合临床检测要求。

实施例10胰岛素和C肽的基质效应验证

在基于液相-质谱(LC-MS)的方法分析生物样品的药物时，样品的一些共同提取物可能对目标化合物的离子化效率产生影响，这个影响可以从仪器响应上观察到，化合物的信号会增强或更常见的是被抑制，这种现象被称为基质效应。使用6批空白基质(混合人血清)提取后加标，与纯溶剂提取后加标的检测结果进行对比。计算两者检测均值的比值和平行测量样CV值。

表7基质效应实验结果

基质效应实验结果显示，基质效应在85％-115％，各平行样CV值≤15.0％，符合临床检测要求。

实施例11胰岛素和C肽的提取回收率验证

将高、低浓度的人血清样品提取前和提取后加标的检测结果进行对比。计算两者检测均值的比值和平行样CV值。

表8提取回收率实验结果

提取回收率实验结果显示，提取回收率在85％-115％，各平行样CV值≤15.0％，符合临床检测要求。

实施例12胰岛素类似物的检测样品准备

将甘精胰岛素、门冬胰岛素和赖脯胰岛素(中国食品药品检定研究院)分别在0.1％甲酸中溶解和稀释，配置0.25mg/mL的储备液。这三种胰岛素类似物以及实施例1中的人胰岛素储备溶液使用0.1％甲酸以1∶250进行进一步稀释，实施例1中人C肽溶液使用0.1％甲酸以1∶25进行进一步稀释，配置成3种胰岛素类似物、胰岛素和C肽的混合次级储备液。使用空白人血清基质以不同比例进行稀释，混匀，得到不同浓度的检测溶液。配制好的样品在-60至-90℃下储存直到使用。

使用人血清空白基质将含有3种胰岛素类似物、胰岛素和C肽的混合次级储备液按照1：100的比例进行稀释，得到线性最高点样品C8。其他线性浓度点样品及质控品则由人血清空白基质按照设定的比例稀释C8得到。稀释后，混匀，得到不同浓度的标准品溶液。标准品溶液现配现用。其他配置好的样品则在-60至-90℃下储存直到使用。

样品前处理

1)蛋白萃取：向100μL人血清样品中添加500μL甲醇的作为萃取剂，振荡摇匀，离心10min。在蛋白萃取的萃取剂中已经预先添加了0.5ng/mL同位素标记的人胰岛素和5ng/mL同位素标记的C肽作为内标，所以在整个分析过程中，不需额外添加内标。

2)HLB SPE处理：取出300μL上清液，加入500μL SPE稀释剂进行稀释，混匀。将稀释后溶液用于上样。固相萃取操作过程可在96孔板正压萃取仪器或负压萃取仪器上进行。以下为具体SPE操作过程：

a、活化：采用300μL纯甲醇活化SPE小柱，重复操作两次；

b、平衡：采用300μL SPE稀释剂平衡SPE小柱，重复操作两次，其中，SPE稀释剂为10％甲醇水溶液；

c、上样：将蛋白萃取后离心得到的上清液经稀释后，取500μL进行上样；

d、清洗：用300μL SPE稀释剂清洗SPE柱，重复操作两次。

e、洗脱：用50μL SPE洗脱剂洗脱色谱柱，重复操作两次，其中SPE洗脱剂为70％乙腈溶液。

整个SPE过程可在30min内完成。

3)将经SPE处理后收集到的洗脱液振荡摇匀后，即可上机检测。

3、色谱参数和质谱检测参数

采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18Column(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱进行检测，柱温40℃，进样量8μL，流动相A相和B相分别采用0.1％ FA水和0.1％ FA乙腈溶液，每个样品的检测时间为7分钟。

质谱采用Waters Xevo TQ-S，使用电喷雾离子源的正离子模式进行检测。

通过UPLC-MS/MS，获得了图3的结果。图3示出了胰岛素类似物检测总离子流(TIC)图和MRM检测图，其中，图3a为胰岛素类似物总离子流(TIC)图，图3b为胰岛素类似物MRM检测图(定量离子对)。

Claims (10)

1.一种通过液相色谱-质谱测定样品中待检测物质的量的方法，其中，所述待检测物质是胰岛素和C肽和/或胰岛素类似物，所述方法包括：

(a)提供用于定量测定待检测物质的参照；

(b)准备样品；

(c)对所述样品进行前处理，所述前处理包括蛋白萃取和固相萃取；

(d)使经过所述前处理的所述样品和参照通过液相色谱；

(e)通过质谱检测所述待检测物质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱是超高效液相色谱法。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述质谱是串联四极杆质谱。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括血浆样品或血清样品。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述胰岛素类似物选自天冬胰岛素、赖脯胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素和甘精胰岛素。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，

在所述待检测物质是胰岛素的情况下，质谱通过测定质荷比为968.8±0.5或1162.3±0.5的母离子和选自质荷比为136.0±0.5、651.8±0.5或226.1±0.5的一种或多种碎片离子来检测胰岛素；质谱通过测定质荷比为979.3±0.5的母离子和选自质荷比为137.0±0.5和229.3±0.5的一种或多种碎片离子来检测与胰岛素相应的内标；

在所述待检测物质是C肽的情况下，质谱通过测定测定质荷比为1007.7±0.5的母离子和选自质荷比为147.1±0.5、785.2±0.5和927.1±0.5的一种或多种碎片离子来检测C肽，通过测定质荷比为1011.7±0.5的母离子和选自质荷比为147.0±0.5、338.6±0.5和939.0±0.5的一种或多种碎片离子来检测与C肽相应的内标；

在所述待检测物质是胰岛素类似物的情况下，通过测定质荷比为1162.3±0.5、1011.3±0.5、971.8±0.5和758.7±0.5的母离子和选自质荷比为136.1±0.5、1139.4±0.5、143.0±0.5和217.1±0.5的一种或多种碎片离子来检测胰岛素类似物，质谱通过测定质荷比为979.3±0.5的母离子和选自质荷比为137.0±0.5和229.3±0.5的一种或多种碎片离子来检测与胰岛素类似物相应的内标。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，蛋白萃取所使用的萃取剂中有机试剂比例在60％～100％；或者

有机溶剂可以是选自乙腈、甲醇、乙醇和异丙醇试剂中一种或两种以上混合而得的有机溶剂；或者

蛋白萃取所使用的萃取剂中可包含0-5％比例的添加剂；或者

所述添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水中的一种或以上；或者以体积比计，所述样品与萃取剂之比为1：2～1：8；

优选地，使用80-100％异丙醇、甲醇或乙醇溶液作为蛋白萃取的萃取剂，且样品与蛋白萃取剂的体积比为1：3～1：5。

8.一种液相色谱-质谱试剂盒，所述试剂盒包括参照、萃取剂、SPE试剂，其中，SPE试剂包括SPE稀释剂和SPE洗脱剂；

所述SPE稀释剂为含有0-5％比例添加剂以及0-20％比例有机溶剂的水溶液；或者

所述有机试剂包含甲醇、乙腈、乙醇和异丙醇的一种或多种；或者

所述添加剂包含选自甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水的一种或多种；

优选地，将10体积％-20体积％的甲醇、乙腈或乙醇溶液作为SPE稀释剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，所述参照是多个校准品和/或待检测物质的内标。

10.通过液相色谱-质谱测定样品中待检测物质的量的系统，所述系统包括：

如权利要求8所述的试剂盒；

用于准备可能含有一种或多种待检测物质的样品的模块；

用于对所述样品进行前处理的模块；

用于使经过所述前处理的所述样品和参照通过液相色谱的模块；和

用于通过质谱检测所述待检测物质的量的模块。

Images