CN115015460B - 一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法 - Google Patents

一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别冬虫夏草产地的方法，该方法包括：(1)对不同产地的冬虫夏草样品进行定性定量分析；(2)对不同产地冬虫夏草进行代谢组学比较，筛选出差异显著性代谢成分；(3)对差异显著代谢成分进行可视化分析。该发明的方法对于冬虫夏草的产地研究具有重要理论参考意义，也为其他物种的产地鉴别及溯源提供了技术支持。

Description

一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法
技术领域
本申请涉及食品检测领域，特别是涉及一种鉴别冬虫夏草产地的方法。
背景技术
冬虫夏草是指冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座与幼虫尸体的干燥复合体，其性甘、平，归肺、肾经，具有益肺补肾和化痰止血的功效，用于治肾阳不足、久咳虚喘、劳嗽痰血，是平补肺肾之佳品。作为传统名贵中药材，冬虫夏草与人参、鹿茸并称“中药三大宝”，在中国和其他欧亚国家已有悠久的药用历史。
现代研究明确表明，冬虫夏草具有多种药理作用，如抗肿瘤、保肝、保肾、抗炎、抗氧化、抗凋亡和增强免疫力作用。这些药理作用主要归因于从冬虫夏草中提取的大量生物活性成分，包括冬虫夏草素、多糖、氨基酚、麦角甾醇、甘露醇、腺苷、脂肪酸及维生素B1、B2等。此外，它在中国也被广泛用作民间滋补食品或补药。冬虫夏草作为一种具有丰富生物活性的天然产物，在医药、滋补、食品等领域受到越来越多的关注。
冬虫夏草的生长分布范围非常有限，从全球范围来看，其主要分布在中国、尼泊尔、不丹和印度。在中国，主要分布于青海、西藏、四川、云南和甘肃等3000-5000m的高海拔地区，青海和西藏是中国冬虫夏草的主要产地。冬虫夏草的质量与多种因素有关，如地理条件、气候条件、共生微生物等，这些因素的差异会导致化学成分的差异。来自青海玉树和西藏那曲的冬虫夏草质量被广泛认为是优良的，而来自甘肃、云南和四川的冬虫夏草质量则相对较差。
目前，已有相当多的科技文献揭示了冬虫夏草的化学成分、药理功能和保健作用，也有研究利用非靶向代谢组学技术结合化学统计学分析鉴定冬虫夏草的真实性，虽然非靶向代谢组学方法可以同时对数百种甚至数千种已知和未知代谢物进行定性和定量分析，但灵敏度和准确性较差，且实际应用较困难。
广泛靶向代谢组学是一种结合靶向代谢组学和非靶向代谢组学优势的新方法，它提供了一种有效的定性和定量方法，具有高灵敏度、定性准确、高通量等优点。前期检索发现，目前尚未见关于广泛靶向代谢组学技术作为冬虫夏草研究工具的相关报道。因此，为了克服现有方法存在的缺陷，建立一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别冬虫夏草产地的方法，该方法利用广泛靶向代谢组学分析技术，基于高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱采集质谱数据，并对代谢产物进行定性定量分析；同时通过多元统计分析，筛选出不同产地冬虫夏草差异显著代谢成分，并对其代谢通路等进行了分析。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法，包括如下步骤：
(1)冬虫夏草样品及QC样品的制备：收集不同产地冬虫夏草样品，经有机溶剂提取后得到待测液；QC样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品；
(2)冬虫夏草样品的检测分析：采用超高效液相色谱和串联质谱仪在多反应监测模式下采集质谱数据，在获得不同样本的代谢物质谱数据后，通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行积分和校正，以保证定性和定量的准确性；
(3)冬虫夏草样品的定性定量分析：将质谱数据与迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB进行比对，鉴定样品中的代谢成分，基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析；
(4)代谢组学数据的处理与分析：采用多元统计分析法进行数据分析，首先采用无监督模式的主成分(PCA)分析对检测到的代谢成分进行分析，初步了解组间的整体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，然后通过有监督模式的正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析法预测所建立模型的预测能力和可靠性；
(5)基于OPLS-DA结果，根据获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)值，初步筛选出不同产地间差异的代谢成分；并利用提高VIP阈值和P值进一步筛选出差异显著的代谢成分；
(6)通过小提琴图对代谢产物进行可视化分析。
优选的，所述步骤(1)中收集青海、西藏、云南、四川和尼泊尔5个产地的冬虫夏草样品，冻干后用研磨仪在研磨至粉末状；准确称取不同产地粉末，用20％甲醇水溶液提取；提取液离心，合并上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后稀释；取等体积的水和上清液加入离心管中，离心，收集上清液于进样瓶中，待分析。
优选的，步骤(1)中收集青海、西藏、云南、四川和尼泊尔5个产地的冬虫夏草样品，冻干后用研磨仪在30Hz下研磨30s至粉末状；准确称取不同产地粉末20mg，用20％甲醇水溶液提取90min，共提取两次；提取液在1200r/min离心10min，合并上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后并稀释4倍；取500μL水和500μL上清液加入1.5mL离心管中，12000r/min离心10min，收集上清液于进样瓶中，待分析。
优选的，步骤(2)中所述的超高效液相色谱和串联质谱仪为超高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱。
优选的，步骤(2)中UPLC-Q TRAP的液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITYUPLC HSS T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：A相为0.1％甲酸/水，B相为0.1％甲酸/乙腈；梯度洗脱：0-11min，5％-90％B；11-12min，90％B；12-12.1min，90％-5％B；12.1-14min，5％B；柱温40℃；流速0.35mL/min；进样量2μL。
优选的，步骤(2)中UPLC-Q TRAP的质谱条件：电喷雾离子源温500℃，正负离子模式下的质谱电压分别为5500V和-4500V，离子源气体I 50psi，气体II 50psi，气帘气25psi，碰撞诱导电离参数设置为高；在三重四极杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
优选的，步骤(3)中冬虫夏草代谢成分的定性定量分析是通过以下策略完成的：基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB，根据保留时间、子母离子对信息和二级谱信息对冬虫夏草代谢产物进行定性分析；基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析；在MRM模式中，第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子，排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰；前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片，然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选，使定量更加准确，提高重复性；在获得不同样本的代谢物质谱数据后，通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合，以保证定性和定量的准确性。
优选的，步骤(5)中根据OPLS-DA分析提供的VIP值，选择VIP值≥1，P＜0.05的代谢物作为差异代谢成分，获得164种不同产地冬虫夏草的差异代谢成分。
更优选的，步骤(5)中根据OPLS-DA分析提供的VIP值，选择VIP值≥2，P＜0.01的代谢物作为差异显著代谢成分，获得22种不同产地冬虫夏草的差异显著代谢成分。
进一步优选的，所述22种不同产地冬虫夏草的差异显著代谢成分为β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸和亚叶酸。
更优选的，步骤(5)中根据OPLS-DA分析提供的VIP值，选择VIP值≥2.2，P＜0.01的代谢物作为差异显著代谢成分，获得12种不同产地冬虫夏草的差异显著代谢成分(见表1)。
更优选的，步骤(5)中根据OPLS-DA分析提供的VIP值，选择VIP值≥2.4，P＜0.01的代谢物作为差异显著代谢成分，获得7种不同产地冬虫夏草的差异显著代谢成分(见表1)。
本发明第二方面提供一种用于鉴别不同产地冬虫夏草的特征代谢物组合物，所述特征代谢物组合物选自β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸、亚叶酸中的至少两种。
更优选的，所述特征代谢物组合物选自β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸、亚叶酸中的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种或二十二种。
进一步优选的，所述特征代谢物组合物为β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸和亚叶酸。
优选的，所述不同产地为青海、西藏、云南、四川和尼泊尔5个产地。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的方法采用广泛靶向代谢组学技术结合化学统计学分析，对不同产地冬虫夏草的代谢概况进行了分析，鉴定并筛选出了164种差异代谢成分，显示了这种方法的高效性，并对差异代谢成分的代谢通路进行了分析。
(2)本发明首次将广泛靶向代谢组学技术应用于冬虫夏草产地的鉴别，该技术整合了非靶向和靶向代谢技术的优点，可以同时定性定量上百乃至上千种化合物，且高灵敏度、定性准确、重复性好。
(3)本发明所得到的质谱数据依靠超高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱获得，尤其是三重四极杆离子阱质谱可以提供更高的数据质量、分辨率、灵敏度和更快的采集速度，使得结果更加稳定可靠。
(4)本发明提供的代谢组学方法，除了可以应用于冬虫夏草产地的鉴定，也为其他物种的产地鉴别及溯源研究提供技术支持。
附图说明
图1为五种不同产地冬虫夏草中646种代谢成分的分类图；
图2为五种不同产地冬虫夏草的PCA图；
图3为五种不同产地冬虫夏草的OPLS-DA图；
图4为五种不同产地冬虫夏草显著差异代谢成分的小提琴图。
具体实施方式
通过试验例方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下试验例。
实施例1、运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地
(1)冬虫夏草样品的制备：收集青海、西藏、云南、四川和尼泊尔5个产地的冬虫夏草样品，冻干后用研磨仪研磨(30Hz，30s)至粉末状。准确称取不同产地粉末20mg，用20％甲醇水溶液提取90min，共提取两次。提取液在1200r/min离心10min，合并上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后并稀释4倍。取500μL水和500μL上清液加入1.5mL离心管中，12000r/min离心10min，收集上清液于进样瓶中，待分析。
(2)冬虫夏草样品的检测与分析：本研究中数据的采集在超高效液相色谱(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)-三重四极杆离子阱质谱仪(AB Sciex,Foster City，CA，USA)上进行，采集所使用的仪器条件如下：
液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITYUPLC HSS T3 C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：A相为0.1％甲酸/水，B相为0.1％甲酸/乙腈；梯度洗脱：0-11min，5％-90％B；11-12min，90％B；12-12.1min，90％-5％B；12.1-14min，5％B；柱温40℃，流速0.35mL/min；进样量2μL。
质谱条件：电喷雾离子源温500℃，正负离子模式下的质谱电压分别为5500V和-4500V，离子源气体I 50psi，气体II 50psi，气帘气25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四极杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
(3)冬虫夏草样品的定性定量分析：基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB，根据保留时间、子母离子对信息和二级谱信息对冬虫夏草代谢产物进行定性分析。基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析。在MRM模式中，第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子，排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰。前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片，然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选，使定量更加准确，提高重复性。在获得不同样本的代谢物质谱数据后，通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合，以保证定性和定量的准确性。
在青海、西藏、云南、四川、尼泊尔5种产地的冬虫夏草中，共鉴定出15类646种代谢物(图1)，其中包括氨基酸及其代谢物、有机酸及其衍生物、杂环化合物、碳水化合物及其代谢物、核苷酸及其代谢物、辅酶和维生素、脂质、醇胺类、辅酶和维生素、醛酮酯类、苯及其衍生物、激素及激素相关物质、色胺，胆碱，色素、胆汁酸及其他类。
(4)代谢组学数据的处理与分析：采用多元统计分析法进行数据分析，首先采用无监督模式的主成分(PCA)分析对检测到的代谢物进行分析，初步了解组间的整体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，然后通过有监督模式的正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析法预测所建立模型的预测能力和可靠性。
通过对样本进行PCA，5个不同产地冬虫夏草之间分离趋势不明显(如图2所示)。PCA法虽然能够有效的提取主要信息，但对相关性较小的变量不敏感，而有监督模式的OPLS-DA结合了正交信号矫正，可以使组间区分最大化，利于寻找差异标志物。
图3中OPLS-DA得到两个主成分，五组样本呈现出明显的分离趋势，RX2＝0.558，RY2＝0.988、Q2＝0.902，其中Q2>0.9为出色的模型，相比于PCA模型效果更好。说明OPLS-DA模型构建良好，预测性可靠且有意义，可根据VIP值分析筛选差异代谢成分。
(5)基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的VIP值，初步筛选出不同产地间差异的代谢成分，并通过提高VIP阈值和P值来进一步筛选出差异显著代谢成分。
对5种不同产地冬虫夏草的代谢物按照上述筛选条件进行筛选，选择VIP值≥1，P＜0.05时共得到差异代谢物164种，进一步选择VIP值≥2，P＜0.01时共得到差异显著代谢成分22种，这些差异显著代谢物分为7类(参见表1)。整体而言，差异代谢成分(164种)占总体代谢成分(646种)的25.39％，说明不同产地冬虫夏草的代谢物差异较大。
表15个不同产地冬虫夏草中22个差异显著代谢成分
(6)通过小提琴图对代谢产物进行可视化分析。对数据进行了归一化处理，并使用聚类热图对所有样本进行分析，观察这些差异代谢物的相对变化。为了揭示五种不同产地冬虫夏草的主要代谢物，选取164种差异代谢物进行分析，用小提琴图显示五种不同产地样品间代谢物的含量差异。图4为22种显著差异代谢物的小提琴图(从左至右的标记依次为西藏、青海、云南、四川和尼泊尔)，从图中可直观地看出同一代谢物在不同产地的冬虫夏草中含量存在显著差异，22种差异代谢物中2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸和亚叶酸在尼泊尔的冬虫夏草中含量低于其他产地，而其余代谢物在尼泊尔的冬虫夏草的含量明显高于其他产地。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims (6)

1.一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）冬虫夏草样品及QC样品的制备：收集不同产地冬虫夏草样品，经有机溶剂提取后得到待测液；QC样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品；
（2）冬虫夏草样品的检测分析：采用超高效液相色谱和串联质谱仪在多反应监测模式下采集质谱数据，在获得不同样本的代谢物质谱数据后，通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行积分和校正，以保证定性和定量的准确性；
（3）冬虫夏草样品的定性定量分析：将质谱数据与迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB进行比对，鉴定样品中的代谢成分，基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析；
（4）代谢组学数据的处理与分析：采用多元统计分析法进行数据分析，首先采用无监督模式的主成分（PCA）分析对检测到的代谢成分进行分析，初步了解组间的整体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，然后通过有监督模式的正交偏最小二乘判别（OPLS-DA）分析法预测所建立模型的预测能力和可靠性；
（5）基于OPLS-DA结果，根据获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影（VIP）值，初步筛选出不同产地间差异的代谢成分；并利用提高VIP阈值和P值进一步筛选出差异显著的代谢成分；
（6）通过小提琴图对代谢产物进行可视化分析；
所述步骤（1）中收集青海、西藏、云南、四川和尼泊尔5个产地的冬虫夏草样品，冻干后用研磨仪在研磨至粉末状；准确称取不同产地粉末，用20%甲醇水溶液提取；提取液离心，合并上清液，经0.22µm微孔滤膜过滤后稀释；取等体积的水和上清液加入离心管中，离心，收集上清液于进样瓶中，待分析；
所述步骤（2）中UPLC-Q TRAP的液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSST3 C18；流动相：A相为0.1%甲酸/水，B相为0.1%甲酸/乙腈；梯度洗脱：0-11min，5%-90%B；11-12min，90%B；12-12.1min，90%-5%B；12.1-14min，5%B；柱温40℃；流速0.35mL/min；进样量2µL；
所述步骤（2）中UPLC-Q TRAP的液相色谱条件为：步骤（2）中UPLC-Q TRAP的质谱条件：电喷雾离子源温500℃，正负离子模式下的质谱电压分别为5500V和-4500V，离子源气体I50psi，气体II 50psi，气帘气25psi，碰撞诱导电离参数设置为高；在三重四极杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
2.根据权利要求1所述的鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，所述步骤（3）中冬虫夏草代谢成分的定性定量分析是通过以下策略完成的：基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB，根据保留时间、子母离子对信息和二级谱信息对冬虫夏草代谢产物进行定性分析；基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析；在MRM模式中，第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子，排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰；前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片，然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选，使定量更加准确，提高重复性；在获得不同样本的代谢物质谱数据后，通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合，以保证定性和定量的准确性。
3.根据权利要求1所述的鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，所述步骤（5）中根据OPLS-DA分析提供的VIP值，选择VIP值≥1，P<0.05的代谢物作为差异代谢成分，获得164种不同产地冬虫夏草的差异代谢成分。
4.根据权利要求3所述的鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，选择VIP值≥2，P<0.01的代谢物作为差异显著代谢成分，获得22种不同产地冬虫夏草的差异显著代谢成分。
5.根据权利要求1所述的鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，所述步骤（5）中差异显著的代谢成分选自β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸、亚叶酸中的至少两种。
6.根据权利要求5所述的鉴定冬虫夏草产地的方法，其特征在于，所述步骤（5）中差异显著的代谢成分选自β-氨基丙酸、肌氨酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、棕榈油酸、N8-乙酰基亚精胺、D-景天庚酮糖-7-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、8,15-二羟基二十碳四烯酸、丁二酸酐、木糖醇、2-异丙基苹果酸、3-(吡唑-1-基)-L-丙氨酸、高精氨酸、2'-脱氧胞苷、2-氨基己二酸、甲酰四氢叶酸、异喹啉、N-甲基-L-谷氨酸、吲哚-5-羧酸、亚叶酸中的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种或二十二种。
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