CN115407010B - 一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分的方法,该方法具体包括:(1)食用槟榔样品及质控样品的制备;(2)食用槟榔样品的检测分析;(3)食用槟榔样品的定性定量分析;(4)代谢组学数据的处理与分析。本发明的方法系统全面地分析了食用槟榔中的活性成分,极大地丰富了对其活性成分的认识,为槟榔进一步开发和利用提供了参考依据。
Description
技术领域
本申请涉及食品检测领域,特别是涉及一种鉴别食用槟榔中活性成分的方法。
背景技术
槟榔为棕榈科槟榔属常绿乔木,原产于马来西亚,在我国主产于海南、广西、云南等地。药用槟榔是槟榔的干燥成熟种子,与益智仁、砂仁、巴戟天并称为“四大南药”。槟榔富含天然活性物质,主要含有生物碱、脂肪酸、鞣质、氨基酸等。目前研究较多的为生物碱类,其中槟榔碱又是含量最高、研究最广泛的物质。槟榔在我国有一千多年的药用历史,具有杀虫、消积、行气、利水、截疟的功效。相关研究表明,这些功能主要源于槟榔中的多种缩合鞣质和生物碱。槟榔中的缩合鞣质具有抗氧化、抗菌杀菌等作用。现代医学研究表明,槟榔中的活性化合物也可以干预消化系统、神经系统和心血管系统的疾病,具有抗过敏,调节血糖,降低血脂的功效。
食用槟榔与药用槟榔的主要成分均为槟榔碱,现代毒理学研究报道,槟榔碱具有口腔黏膜下纤维性变毒性、生殖毒性、肝肾毒性、免疫抑制毒性与神经毒性。流行病学调查显示,常嚼食槟榔可致口腔癌病变。2003年槟榔被世界卫生组织属下的国际癌症研究中心(IARC)认定为一级致癌物。
食用槟榔经过一系列复杂的加工工序制成,其成分与槟榔鲜果有很大的差异。熟石灰、烟草、蒌叶等各类辅料的添加以及各成分之间经化学反应产生的新物质是导致食用槟榔致癌的关键因素。因此,对食用槟榔中的活性成分进行全面、系统地研究是十分必要的。而目前国内外对于食用槟榔的活性成分研究主要集中一种或一类化合物上。目前亟需对食用槟榔中的活性成分进行了全面、深入的结构鉴定,为食用槟榔的安全性研究提供科学的理论依据。
发明内容
为了更深入全面地了解食用槟榔中的代谢成分,本发明提供一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分的方法,该方法基于高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱采集质谱数据,并对代谢产物进行定性定量分析,其不仅极大地丰富了对其活性成分的认识,也为食用槟榔的安全性研究提供科学的理论依据。
为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分的方法,包括如下步骤:
(1)食用槟榔样品及质控样品的制备:向食用槟榔的粉末中加入溶剂,经涡旋、静置、离心后吸取上清,用微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中;所有样品溶液均精确移取100μL充分混合,制成质量控制样本溶液,用于超高效液相色谱和串联质谱(UPLC-QTRAPMS/MS)分析;
(2)食用槟榔样品的检测分析:采用超高效液相色谱和串联质谱仪,在多反应监测模式下采集质谱数据,在获得不同样本的代谢物质谱数据后,通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行积分和校正,以保证定性和定量的准确性;
(3)食用槟榔样品的定性定量分析:将质谱数据与迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB进行比对,鉴定样品中的代谢成分,基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析;
(4)代谢组学数据的处理与分析:按照代谢物类别对检测到的代谢物进行划分,得到食用槟榔中主要类型的代谢物,根据各化合物的色谱峰相对面积判断化合物的相对含量水平。
优选的,步骤(1)中食用槟榔放置于冻干机中真空冷冻干燥,利用研磨仪研磨在30Hz条件下研磨1.5min至粉末状。
优选的,步骤(1)中加入溶剂为甲醇,食用槟榔粉末与甲醇的质量体积比为0.5g:12mL,所述甲醇的体积分数为70%。
优选的,步骤(1)中涡旋的频率和次数分别为:每30分钟涡旋一次,每次持续30秒,共涡旋6次。
优选的,步骤(1)中离心的转速为12000rpm,离心时间为3min。
优选的,步骤(1)微孔滤膜的孔径为0.22μm。
优选的,步骤(2)中所述的超高效液相色谱和串联质谱仪为超高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱。
优选的,步骤(2)中的液相色谱条件为:色谱柱为Agilent SB-C18柱,2.1mm×100mm,1.8μm;流动相为含0.1%的甲酸水溶液A和含0.1%甲酸的乙腈B;流速0.35mL/min;柱温40℃,进样体积为4μL;洗脱条件为:0-9min,5%-95%;9-10min,95%,10-11.1min,95%-5%,11.1-14min,5%。
优选的,步骤(2)中的质谱条件为:电喷雾离子源温度550℃;离子喷雾电压正离子模式5500V/负离子模式-4500V;离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60和25psi,碰撞诱导电离参数设置为高。
优选的,步骤(2)中的质谱在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准;QQQ扫描使用MRM模式,并将作为碰撞气体的氮气设置为中等;通过进一步的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)优化,完成各个MRM离子对的DP和CE;根据每个时期内洗脱的代谢物,在每个时期监测一组特定的MRM离子对。
优选的,步骤(3)中槟榔代谢成分的定性定量分析是通过以下策略完成的:基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB,根据保留时间、子母离子对信息和二级质谱信息与采集的质谱数据进行比对,对食用槟榔样品代谢产物进行定性分析;分析时去除了同位素信号,含K+、Na+、NH4 +的重复信号,以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号;基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析;在MRM模式中,第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子,排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰;前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片,然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选,使定量更加准确,提高重复性;在获得不同样本的代谢物质谱数据后,通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合,以保证定性和定量的准确性。
优选的,步骤(4)中将检测到的代谢物按照类别进行划分,统计每类化合物占总化合物的比重,得到食用槟榔中最主要代谢物类型:黄酮类、酚酸类、脂质类和生物碱类。
优选的,步骤(4)中根据各化合物的色谱峰相对面积判断化合物的相对含量水平,选择色谱峰相对面积≥1.00×107的认为其相对含量较高,获得40种主要类型相对含量较高的代谢成分。
优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述黄酮类化合物中的至少2种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素。
更优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述黄酮类化合物:川陈皮素、苜蓿素和桔皮素。
进一步优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述12种黄酮类化合物:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素。
优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述酚酸类化合物中的至少2种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛。
更优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述酚酸类化合物:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯。
进一步优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述8种酚酸类化合物:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛。
优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述脂质类化合物中的至少2种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构)。
更优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述脂质类化合物:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3和溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)。
进一步优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述15种脂质类化合物:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构)。
优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述生物碱类化合物中的至少2种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
更优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述生物碱类化合物:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和葫芦巴碱。
进一步优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述5种生物碱类化合物:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
进一步优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分包括下述11种化合物:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和葫芦巴碱。
最优选的,获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分如下:(1)黄酮类化合物12种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素;(2)酚酸类化合物8种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛;(3)脂质类化合物15种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构);以及(4)生物碱类化合物5种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
本发明第二方面提供一种用于鉴别食用槟榔中活性成分的特征代谢物组合物,所述特征代谢组合物选自下述40种化合物中的至少4种:(1)黄酮类化合物12种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素;(2)酚酸类化合物8种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛;(3)脂质类化合物15种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构);以及(4)生物碱类化合物5种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
优选的,所述特征代谢组合物选自下述11种化合物中的至少4种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和葫芦巴碱。
优选的,所述特征代谢组合物选自下述11种化合物中的5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和葫芦巴碱。
最优选的,所述特征代谢组合物包括下述40种化合物:(1)黄酮类化合物12种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素;(2)酚酸类化合物8种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛;(3)脂质类化合物15种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构);以及(4)生物碱类化合物5种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
本发明的第三方面还提供上述特征代谢物组合物在鉴别食用槟榔中活性成分方面的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明首次将广泛靶向代谢组学技术应用于食用槟榔中活性成分的鉴定,对其代谢成分种类和相对含量差异进行了研究。
(2)本发明采用广泛靶向代谢组学技术系统、全面地分析了食用槟榔中的活性成分,鉴定出了许多之前研究未报道的物质,极大地丰富了对其代谢物的认识。
(3)本发明所采用的方法为槟榔进一步开发和利用提供了参考依据,并为其他物种的成分研究提供了新的思路。
附图说明
图1为基于UPLC-QTRAP MS/MS的广泛靶向分析方法在正离子模式(图1A)和负离子模式(图1B)下的总离子流图;
图2为食用槟榔中检测到的1063种代谢物的分类图;
图3为食用槟榔中主要类型相对含量较高化合物的积累图:(A)相对含量较高的黄酮类化合物的强度图;(B)相对含量较高的酚酸类化合物的强度图;(C)相对含量较高的脂质化合物的强度图;(D)相对含量较高的生物碱类化合物的强度图。
具体实施方式
通过实施例方式对本发明作进一步的说明,但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1、利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分
(1)食用槟榔样品及QC样品的制备:食用槟榔样品放置于冻干机(Scientz-100F)中真空冷冻干燥;利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨(30Hz,1.5min)至粉末状。称取50mg的粉末,溶解于1.2mL70%甲醇提取液中,每30分钟涡旋一次,每次持续30秒,共涡旋6次。离心(转速12000rpm,3min)后,吸取上清,用0.22μm微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中;所有样品溶液均精确移取100μL充分混合,制成质量控制样本溶液,用于UPLC-MS/MS分析。
(2)食用槟榔样品的检测与分析:本实施例中数据的采集在超高效液相色谱(SHIMADZU Nexera X2,https://www.shimadzu.com.cn/)-三重四极杆离子阱质谱仪(Applied Biosystems 4500 QTRAP,http://www.appliedbiosystems.com.cn/)上进行,采集所使用的仪器条件如下:
液相色谱条件:色谱柱为Agilent SB-C18柱,2.1mm×100mm,1.8μm;流动相为含0.1%的甲酸水溶液A和含0.1%甲酸的乙腈B;流速0.35mL/min;柱温40℃,进样体积为4μL;洗脱条件为:0-9min,5%-95%;9-10min,95%,10-11.1min,95%-5%,11.1-14min,5%。
质谱条件:电喷雾离子源温度550℃;离子喷雾电压5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式);离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60和25psi,碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式,并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)优化,完成各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物,在每个时期监测一组特定的MRM离子对。
(3)食用槟榔样品的定性定量分析:基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB,根据保留时间、子母离子对信息和二级质谱信息与采集的质谱数据进行比对,对食用槟榔样品代谢产物进行定性分析。分析时去除了同位素信号,含K+、Na+、NH4 +的重复信号,以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号;基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析;在MRM模式中,第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子,排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰;前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片,然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选,使定量更加准确,提高重复性;在获得不同样本的代谢物质谱数据后,通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合,以保证定性和定量的准确性。
在食用槟榔中共鉴定出1063种代谢物(图2),在正离子模式下共鉴定出602种代谢物,在负离子模式下共鉴定出463种代谢物。这些代谢物可分为11类,其中包括氨基酸及其代谢物(7.90%)、核苷酸及其衍生物(4.80%)、脂质(15.05%)、生物碱类(8.37%)、有机酸类(8.00%)、黄酮类(25.02%)、酚酸类(15.24%)、木脂素和香豆素类(3.20%)、萜类(3.10%)、鞣质(0.47%)和其它类(8.84%)。其中,黄酮类、酚酸类和脂质是最主要的三类代谢物,食用槟榔中也含有较多的生物碱类化合物,鞣质类化合物较少。
实施例2、食用槟榔中主要类型化合物的组成分析
根据各化合物的色谱峰相对面积判断化合物的相对含量水平,色谱峰相对面积在1.00×107以上时认为其相对含量较高。表1列出了食用槟榔中主要类型相对含量较高的化合物。
在检测到的266种黄酮类代谢物中,有215种化合物在正离子模式下被检出,51种化合物在负离子模式下被检出。各化合物的相对含量水平结果显示:川陈皮素、桔皮素、牡荆素-2”-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷等12种化合物的相对含量较高。
在检测到的162种酚酸类代谢物中,有118种化合物在负离子模式下被检出,44种化合物在正离子模式下被检出。各化合物的相对含量水平结果显示:乙基麦芽酚、4-羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲醛和4-硝基苯酚等8种化合物的相对含量较高。
在检测到的160种脂质代谢物中,有86种化合物在正离子模式下被检出,74种化合物在负离子模式下被检出。各化合物的相对含量水平结果显示:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和硬脂酸等15种化合物的相对含量较高。
在检测到的89种生物碱代谢物中,N-亚硝基去甲槟榔次碱、吲哚-3-甲酸、吲哚-5-甲酸和乙酸胍在负离子模式下被检出,有84种化合物在正离子模式下被检出(其中,N-甲基大麦芽碱在[M]+模式下检出)。各化合物的相对含量水平结果显示:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱和N-苯亚甲基异甲胺等5种化合物的相对含量较高,槟榔碱次之,色谱峰相对面积为9.85×106。
表1食用槟榔中主要类型相对含量较高的化合物
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述,但是本领域技术人员应认识到,在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而,本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
Claims (5)
1.一种利用广泛靶向代谢组学技术鉴别食用槟榔中活性成分的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)食用槟榔样品及质控样品的制备:向食用槟榔的粉末中加入溶剂,经涡旋、静置、离心后吸取上清,用微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中;所有样品溶液均精确移取100µL充分混合,制成质量控制样本溶液,用于超高效液相色谱和串联质谱(UPLC-QTRAP MS/MS)分析;
(2)食用槟榔样品的检测分析:采用超高效液相色谱和串联质谱仪,在多反应监测模式下采集质谱数据,在获得不同样本的代谢物质谱数据后,通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行积分和校正,以保证定性和定量的准确性;
(3)食用槟榔样品的定性定量分析:将质谱数据与迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB进行比对,鉴定样品中的代谢成分,基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析;
(4)代谢组学数据的处理与分析:按照代谢物类别对检测到的代谢物进行划分,得到食用槟榔中主要类型的代谢物,根据各化合物的色谱峰相对面积判断化合物的相对含量水平;
所述步骤(1)中加入溶剂为甲醇,食用槟榔粉末与甲醇的质量体积比为0.5g:12mL,所述甲醇的体积分数为70%;
所述步骤(3)中槟榔代谢成分的定性定量分析是通过以下策略完成的:基于迈维生物技术有限公司自建的数据库MWDB,根据保留时间、子母离子对信息和二级质谱信息与采集的质谱数据进行比对,对食用槟榔样品代谢产物进行定性分析;分析时去除了同位素信号,含K+、Na+、NH4 +的重复信号,以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号;基于三重四极杆质谱的多反应监测模式进行定量分析;在MRM模式中,第一重四极杆首先筛选目标物的前体离子,排除其他物质对应的前体离子以消除它们的干扰;前体离子在碰撞室中经碰撞诱导解离成碎片,然后通过第三重四极杆进行碎片离子筛选,使定量更加准确,提高重复性;在获得不同样本的代谢物质谱数据后,通过MultiQuant软件对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行校正和整合,以保证定性和定量的准确性;
所述步骤(4)中根据各化合物的色谱峰相对面积判断化合物的相对含量水平,选择色谱峰相对面积≥1.00×107的认为其相对含量较高,获得40种主要类型相对含量较高的代谢成分;
获得的40种主要类型相对含量较高的代谢成分如下:(1)黄酮类化合物12种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2''-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素;(2)酚酸类化合物8种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛;(3)脂质类化合物15种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构);以及(4)生物碱类化合物5种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述的超高效液相色谱和串联质谱仪为超高效液相色谱-三重四极杆离子阱质谱。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的液相色谱条件为:色谱柱为Agilent SB-C18柱,2.1mm×100mm,1.8µm;流动相为含0.1%的甲酸水溶液A和含0.1%甲酸的乙腈B;流速0.35mL/min;柱温40℃,进样体积为4µL;洗脱条件为:0-9min,5%-95%;9-10min,95%,10-11.1min,95%-5%,11.1-14min,5%。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的质谱条件为:电喷雾离子源温度550℃;离子喷雾电压正离子模式5500V/负离子模式-4500V;离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60和25psi,碰撞诱导电离参数设置为高。
5.特征代谢物组合物在鉴别食用槟榔中活性成分的方面的应用,其特征在于,所述特征代谢组合物包括下述40种化合物:(1)黄酮类化合物12种:川陈皮素、苜蓿素、桔皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、水仙苷、鼠李素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-O-鼠李糖-葡萄糖、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、牡荆素-2''-O-半乳糖苷、牡荆素葡萄糖苷和棕矢车菊素;(2)酚酸类化合物8种:乙基麦芽酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、2-羟基肉桂酸、4-硝基苯酚、α-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲醛;(3)脂质类化合物15种:棕榈醛、溶血磷脂酰胆碱18:3、溶血磷脂酰胆碱18:3(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰乙醇胺16:0、溶血磷脂酰乙醇胺18:2、溶血磷脂酰乙醇胺18:2(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:0、硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1(2n异构)、溶血磷脂酰胆碱16:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:1(2n异构)和溶血磷脂酰胆碱18:2(2n异构);以及(4)生物碱类化合物5种:N-苯甲酰基-2-氨基乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、葫芦巴碱、N-苯亚甲基异甲胺、阿魏酰腐胺和组氨醇。
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