CN113325107A - 利用lc-ms/ms高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法 - Google Patents

利用lc-ms/ms高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用LC‑MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法，包括以下步骤：S1、植物代谢修饰组样品制备；S2、仪器准备；S3、6500neutral loss获取碎片，汇总去重；S4、筛掉具有相同母离子、子离子碎片和RT的离子对；S5、利用定量积分方法筛选出峰强度在1000cps以上的离子对；S6、将峰强度在1000cps的离子对通过6500质谱仪的MRM‑IDA‑EPI模式进行检测，最后后通过sMRM进行植物代谢修饰组的定量分析。本发明既可以检测已知修饰基团的各种代谢物，也可以检测各种未知修饰基团的代谢物，具有高通量、高灵敏、高分辨率和广覆盖的优点。

Description

利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法
技术领域
本发明涉及植物代谢分析技术领域，具体为利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法。
背景技术
植物中含有丰富的代谢物，研究显示植物代谢产物的总数量在20-100万之间，这也意味着植物是人类发现新代谢物的重要来源(Dixon and Strack 2003,Wurtzel andKutchan 2016)。植物代谢物的种类和结构高度多样化，其含量和分布也差异显著，准确检测这些代谢物面临很大的挑战。植物代谢物种类的多样性主要是由于不同基团的修饰引起的，例如糖基化、甲基化、酰基化、羟基化、磷酸化、磺酸化和异戊烯基化等。除了上述已知的修饰类型外，还存在很多未知的代谢修饰类型和修饰物，种类繁多的代谢修饰物构成了植物代谢修饰组
随着研究技术的不断发展，代谢组学作为一门新兴学科已经取得了长足的发展，极大的促进了植物代谢组的检测。非靶向代谢组学(untargeted metabolomics)可以在不预先了解生物样品成分的前提下，获取样品的综合代谢谱。但是该方法灵敏度比较低，同时其检测器极易达到饱和，有限的线性范围对于不同数量级浓度的代谢物的定量分析具有很大的挑战(Chen et al 2013a)。靶向代谢组学(targeted metabolomics)是利用质谱技术研究代谢物的黄金手段，具有较好的重复性和广泛的线性度；但只能研究已知结构的代谢物，不适合应用于多组学研究(Luo et al 2016)。近期新发展的广泛靶向代谢组学可以广覆盖的检测多种植物代谢物并实现高通量的定量分析(Chen et al 2013b)，但因为低分辨率的质谱信息导致代谢物结构解析存在巨大挑战。目前的代谢组学研究方法均无法系统全面的检测已知和未知类型的代谢修饰物，不能实现植物代谢修饰组的检测。
现有技术，基于非靶向代谢组学的代谢修饰物的检测，该方法通过总结前人已经发表的修饰类型和修饰物，只能检测少量已知的修饰类型。例如糖基化的代谢物，可以检测该物质可能含有糖基化，但解析物质非常困难。
该技术仅可以检测含有已知修饰基团的物质，不能发现新的修饰基团类型。所检测到的物质多为未知物质，难以解析其结构。非靶向代谢组学本身具有灵敏度低，重复性差的缺陷。
另外还有，基于靶向代谢组的代谢修饰物的检测，该方法通过已知物质的结构来鉴定已经存在的修饰基团，仅可以检测已知代谢物。
该方法通过已知代谢物鉴定部分修饰基团，不能够用于未知代谢物的检测，这极大的限制了新物质的发现。另外，该方法通过鉴定已知物质结构的上修饰基团，这类修饰基团基本上属于已知的修饰类型，无法探索新的修饰基团和类型。
综上所述，现有技术存在以下两个问题：
1、目前可以通过已有研究总结出部分代谢物的修饰基团，利用靶向代谢组和非靶向代谢组的方法检测直接检测含有该修饰基团的代谢物，所研究的修饰物都是已知的修饰类型，对于未知的修饰类型无法进行检测。
2、目前只能零散的研究已经报道的基团修饰，都停留在代谢物的检测水平，不能进入组学层面，目前尚无大规模系统检测植物代谢修饰组的技术方法。
发明内容
本发明提供了一种利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法，为了实现本发明目的，本发明整合超高压液相色谱-高分辨质谱和超高压液相色谱-串联四级杆线性离子阱质谱的优势，建立基于广泛靶向代谢组学的植物代谢修饰组的检测方法，实现可以高效定性定量分析植物代谢修饰组。
为实现上述研究目的，本发明的技术方案如下：
S1、植物代谢修饰组样品制备
(1)取新鲜植物叶片(10g以上)样品，放在液氮中保存。
(2)配制提取液。水溶性提取液构成比例为V甲醇：V水：V乙酸＝75:25:0.04，脂溶性提取液构成比例为V甲醇：V乙酸＝100:0.04，其中V代表体积；所使用的甲醇和乙酸为色谱纯试剂(德国Merck公司，http://www.merck-chemicals.com)，去离子水用Thermo scientific纯化系统(LabTower EDI 15)处理获得。
(3)将植物叶片真空冷冻干燥后，利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨成粉末，条件为30Hz，1.0min。先将提取液放在4℃冰箱预冷，分别称取3g植物叶片干粉末按照1g:2ml加入水溶性和脂溶性提取液，然后剧烈涡旋使粉末和提取液充分混匀，每10min剧烈涡旋一次，涡旋3次后放入4℃冰箱静置12h。
(4)将水溶性和脂溶性样品从4℃冰箱取出，在10,000g转速下4℃离心8min，分别吸取水溶性和脂溶性上清，并按1:1比例混匀；利用微孔滤膜(SCAA-104,0.22μm,上海安普，http://www.anpel.com.cn/)进行过滤，将过滤后的上清液装在进样瓶中，保存在-80℃中准备用于LC-MS分析。
S2、仪器条件
(1)色谱
液相色谱仪分别为岛津SHIMADZU Nexera X2和Thermo UltiMate3000；色谱柱为SHIMADZU Shim-pack GISS C18(1.9um，2.1x100mm)；流动相A相为体积百分比为0.04％乙酸水溶液，流动相B相为体积百分比为0.04％乙酸乙腈溶液；液相色谱采用线性洗脱梯度，0min，5％B，0-10min线性升至95％B并保持1min，11-11.1min恢复初始5％B，并保持5％B至14min；流量为0.3mL/min，进样量为2μL；进样器温度为10℃，柱温为40℃；
(2)质谱条件：
A.AB Sciex QTRAP 6500+,串联四级杆线性离子阱质谱仪：
参数设置：
离子源：Turbo V，电离模式：ESI(+)
NL(neutral loss)参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CXP＝10，CAD＝High,Scanrate:2000Da/s Loss of的范围为n＝14-400,质谱扫描范围start＝n+5,stop＝1000,cycle<1sec.
MRM参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CES＝10，CAD＝High,每对离子对扫描时间(Dwell Time)为5ms
IDA参数：离子流阈值：1000cps,never,不排除目标离子
EPI参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CES＝10，CAD＝High,Scan rate:10000Da/s,范围为n＝50-1000
sMRM参数：scheduled MRM:basic；MRM detectin window:30sec；cycle:0.6sec；DP＝50，EP＝10，CE＝40,CXP＝10，CAD＝High,
Thermo Scientific Q Exactive Plus组合型四极杆Orbitrap质谱仪：Full MS/dd-MS2
Full MS:Resolution＝70000；AGC target＝3e6，Scan range:100to1000
dd-MS2:Resolution＝35000；AGC target＝1e5，Stepped NCE:20,40,60
dd-settings:Minimum AGC target＝5e3。
S3、AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪步进中性丢失模式获取修饰组代谢谱
首先利用6500质谱仪以NL-IDA-EPI模式进行数据采集，其中loss of参数n的范围为14,15,16,17,18,……298,299,300，以1Da为间隔递增，母离子扫描范围为:n+5-1000。
S4、将上述模式采集的一级质谱信息母离子Q1、二级质谱信息子离子Q3及其丰度(以及其他二级质谱信息Q4，Q5，Q6及其丰度……)、色谱峰保留时间RT进行汇总，筛掉具有相同母离子、子离子碎片和RT的离子对。
S5、将上述筛选的离子对利用6500质谱仪的sMRM模式进行检测，每个方法文件中包含1200个离子对，然后利用Analyst软件(1.7版)进行数据处理，利用定量积分方法筛选出峰强度在1000cps以上的离子对。
S6、将上述峰强度在1000cps的离子对通过6500质谱仪的MRM-IDA-EPI模式进行检测，每个方法文件中包含80个离子对，采集高质量的二级质谱碎片信息，进一步更新一级质谱信息母离子，保留时间RT，以及碎片对应的丰度，得到广泛靶向的植物修饰组数据清单。同时利用QE质谱仪对上述数据清单以FS/AIF/dd-MS2模式进行数据采集，获取具有高分辨率的母离子。通过比对具有高分辨率的母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT和母离子的裂解模式等进行去重对齐，建立包含高分辨母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT的高质量植物代谢修饰组数据库。最后后通过sMRM进行植物代谢修饰组的定量分析。
本发明提供的方法，既可以检测已知修饰基团的各种代谢物，也可以检测各种未知修饰基团的代谢物，具有高通量、高灵敏、高分辨率和广覆盖的优点。通过本方案建立植物不同组织的修饰组代谢数据库，包含高分辨的母离子、子离子碎片、离子丰度以及保留时间等重要信息，方便研究者比对检索，将极大推动植物代谢修饰组以及代谢物多样性的研究。
附图说明
图1为实施例番茄叶片中性丢失为176Da的修饰组代谢图谱。
图2a为实施例正离子模式下亚精胺的中性丢失的代谢物检测；
图2b为实施例正离子模式下2-羟基苯丙氨酸的中性丢失的代谢物检测；
图2c为实施例正离子模式下槲皮素-3β-D-葡萄糖苷的中性丢失的代谢物检测；
图2d为实施例正离子模式下5-羟基吲哚的中性丢失的代谢物检测；
图3为实施例鉴定番茄叶片中含有162Da中性丢失的代谢物定量色谱图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
S1、番茄代谢修饰组的样品制备
(1)代谢样品的采集。在番茄植株处于绿熟期时，取新鲜番茄叶片10片，装入预先扎孔的50ml离心管中，放在液氮中保存。
(2)提取液的配制。水溶性提取液构成比例为V甲醇：V水：V乙酸＝75:25:0.04，脂溶性提取液构成比例为V甲醇：V乙酸＝100:0.04，其中V代表体积；所使用的甲醇和乙酸为色谱纯试剂(德国Merck公司，http://www.merck-chemicals.com)，去离子水用Thermo scientific纯化系统(LabTower EDI 15)处理获得。
(3)将番茄叶片真空冷冻干燥后，利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨成粉末，条件为30Hz，1.0min。先将提取液放在4℃冰箱预冷，然后称取3g番茄叶片干粉末按照1g:2ml加入水溶性提取液，然后剧烈涡旋使粉末和提取液充分混匀，每10min剧烈涡旋一次，涡旋3次后放入4℃冰箱静置12h。脂溶性代谢物的提取流程和水溶性代谢物提取方式相同。
(4)分别将水溶性和脂溶性番茄叶片代谢样品从4℃冰箱取出，在10,000g转速下4℃离心8min，分别吸取上清并按1:1比例混合；利用高纯氮气将上清液吹干，再按10g:1ml比例加入纯甲醇进行充分溶解。利用微孔滤膜(SCAA-104,0.22μm,上海安普，http://www.anpel.com.cn/)进行过滤，将过滤后的上清液装在进样瓶中，保存在-80℃中准备用于LC-MS分析。
S2、仪器条件
(1)色谱条件：
液相色谱仪分别为岛津SHIMADZU Nexera X2和Thermo UltiMate3000；色谱柱为SHIMADZU Shim-pack GISS C18(1.9um，2.1x100mm)；流动相A相为体积百分比为0.04％乙酸水溶液，流动相B相为体积百分比为0.04％乙酸乙腈溶液；液相色谱采用线性洗脱梯度，0min，5％B，0-10min线性升至95％B并保持1min，11-11.1min恢复初始5％B，并保持5％B至14min；流量为0.3mL/min，进样量为2μL；进样器温度为10℃，柱温为40℃；
(2)质谱条件：
A.AB Sciex QTRAP 6500+,串联四级杆线性离子阱质谱仪：
参数设置：
离子源：Turbo V，电离模式：ESI(+)
NL(neutral loss)参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CXP＝10，CAD＝High，Scanrate:2000Da/s Loss of的范围为n＝14-400,start＝n+5,stop＝1000,cycle<1min.
MRM参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CES＝10，CAD＝High,每对离子对扫描时间(Dwell Time)为5ms
IDA参数：离子流阈值：1000cps,never,不排除目标离子
EPI参数：DP＝50，EP＝10，CE＝40,CES＝10，CAD＝High,Scan rate:10000Da/s,范围为n＝50-1000
sMRM参数：scheduled MRM:basic；MRM detectin window:30sec；cycle:0.6sec；DP＝50，EP＝10，CE＝40,CXP＝10，CAD＝High,
B.Thermo Scientific Q Exactive Plus组合型四极杆Orbitrap质谱仪：
Full MS:Resolution＝70000；AGC target＝3e6，Scan range:100to1000
dd-MS2:Resolution＝35000；AGC target＝1e5，Stepped NCE:20,40,60
dd-settings:Minimum AGC target＝5e3。
3.AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪步进中性丢失模式获取修饰组代谢谱
首先利用AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪以NL-IDA-EPI模式进行数据采集，其中loss of参数n的范围为14,15,16,17,18,……298,299,300，以1Da为间隔递增，母离子扫描范围为:n+5-1000。请见表一。
表一 中性丢失在14-300范围内的番茄叶子代谢物代谢物检测(部分数据，下同)
Figure BDA0003094267850000061
S4.将上述模式采集的一级质谱信息母离子Q1、二级质谱信息子离子Q3及其丰度(以及其他二级质谱信息Q4，Q5，Q6及其丰度……)、色谱峰保留时间RT进行汇总，筛掉具有相同母离子、子离子碎片和RT的离子对。请见表二。
表二 利用NL IDA-EPI模式获取番茄叶子的代谢修饰组离子对(部分数据)
Figure BDA0003094267850000062
S5.将上述筛选的离子对利用6500质谱仪的sMRM模式进行检测，每个方法文件中包含1200个离子对，然后利用Analyst软件(1.7版)进行数据处理，利用定量积分方法筛选出峰强度在1000cps以上的离子对。
S6、将上述峰强度在1000cps的离子对通过6500质谱仪的MRM-IDA-EPI模式进行检测，每个方法文件中包含80个离子对，采集高质量的二级质谱碎片信息，进一步更新一级质谱信息母离子，保留时间RT，以及碎片对应的丰度，得到广泛靶向的植物修饰组数据清单。同时利用QE质谱仪对上述数据清单以FS/AIF/dd-MS2模式进行数据采集，获取具有高分辨率的母离子。通过比对具有高分辨率的母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT和母离子的裂解模式等进行去重对齐，建立包含高分辨母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT的高质量植物代谢修饰组数据库。最后后通过sMRM进行植物代谢修饰组的定量分析。
表三 番茄叶子代谢修饰组数据库(部分数据)
Figure BDA0003094267850000071
图1为实施例番茄叶片中性丢失为176Da的修饰组代谢图谱。在NL-IDA-EPI正离子模式下检测番茄叶片中小于1000Da的修饰代谢物。图2a到图2d为正离子模式下四种典型的中性丢失的代谢物检测。图3利用本发明鉴定番茄叶片中含有162Da中性丢失的代谢物定量色谱图。本图展示的是番茄叶片中489种含有六碳糖修饰的代谢物色谱图。
本发明创新性地通过步进中性丢失扫描方式进行植物代谢修饰组的检测，具有广泛覆盖的优点，可以检测含有各类修饰基团的代谢物。利用三重四级杆线性离子阱质谱仪sMRM扫描模式进行修饰组的分析，一次可以实现上千种代谢修饰物的定量分析，具有高灵敏度和高通量的优点。同时整合QE质谱仪获得高分辨率的母离子、子离子碎片等质谱信息，可以促进未知代谢物的结构解析，具有高分辨的优点。

Claims (3)

1.利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、植物代谢修饰组样品制备
(1)取新鲜植物叶片样品，放在液氮中保存；
(2)配制提取液；
(3)将植物叶片真空冷冻干燥后，利用研磨仪研磨成粉末，加入水溶性和脂溶性提取液，然后剧烈涡旋使粉末和提取液充分混匀，每10min剧烈涡旋一次，涡旋3次后放入4℃冰箱静置12h；
(4)将水溶性和脂溶性样品从4℃冰箱取出，在10,000g转速下4℃离心8min，分别吸取水溶性和脂溶性上清，并按1:1比例混匀；利用微孔滤膜进行过滤，将过滤后的上清液装在进样瓶中，保存在-80℃中准备用于LC-MS分析；
S2、仪器准备
(1)色谱
液相色谱仪流动相A相为体积百分比为0.04％乙酸水溶液，流动相B相为体积百分比为0.04％乙酸乙腈溶液；液相色谱采用线性洗脱梯度，0min，5％B，0-10min线性升至95％B并保持1min，11-11.1min恢复初始5％B，并保持5％B至14min；流量为0.3mL/min，进样量为2μL；进样器温度为10℃，柱温为40℃；
(2)质谱条件：
A.AB Sciex QTRAP 6500+串联四级杆线性离子阱质谱仪：
S3、6500neutral loss获取碎片，汇总去重
首先利用6500质谱仪以NL-IDA-EPI模式进行数据采集，其中loss of参数n的范围为14,15,16,17,18,……298,299,300，以1Da为间隔递增，母离子扫描范围为:n+5-1000；
S4、将步骤S3模式采集的一级质谱信息母离子Q1、二级质谱信息子离子Q3及其丰度、以及其他二级质谱信息Q4，Q5，Q6及其丰度……、色谱峰保留时间RT进行汇总，筛掉具有相同母离子、子离子碎片和RT的离子对；
S5、将筛选的离子对利用6500质谱仪的sMRM模式进行检测，每个方法文件中包含1200个离子对，然后利用Analyst软件进行数据处理，利用定量积分方法筛选出峰强度在1000cps以上的离子对；
S6、将峰强度在1000cps的离子对通过6500质谱仪的MRM-IDA-EPI模式进行检测，每个方法文件中包含80个离子对，采集高质量的二级质谱碎片信息，进一步更新一级质谱信息母离子，保留时间RT，以及碎片对应的丰度，得到广泛靶向的植物修饰组数据清单；同时利用QE质谱仪对上述数据清单以FS/AIF/dd-MS2模式进行数据采集，获取具有高分辨率的母离子；通过比对具有高分辨率的母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT和母离子的裂解模式等进行去重对齐，建立包含高分辨母离子Q1，离子对碎片Q3，Q4，Q5…,保留时间RT的高质量植物代谢修饰组数据库；最后后通过sMRM进行植物代谢修饰组的定量分析。
2.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法，其特征在于，S1中所述的水溶性提取液构成比例为V甲醇：V水：V乙酸＝75:25:0.04，脂溶性提取液构成比例为V甲醇：V乙酸＝100:0.04，其中V代表体积；所使用的甲醇和乙酸为色谱纯试剂，去离子水用纯化系统处理获得。
3.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高效定性定量分析植物代谢修饰组的方法，其特征在于，S1中条件为30Hz，1.0min；先将提取液放在4℃冰箱预冷，分别称取3g植物叶片干粉末按照1g:2ml加入水溶性和脂溶性提取液。
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