CN110596277B - 一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法 - Google Patents

一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法。所述鉴别方法以10‑羟基‑木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或异构体、8‑demethyl‑7‑ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、木樨草素中的一种或至少两种作为标志物；以橄榄苦苷糖苷配基为内标；以超高效液相色谱/四极杆‑轨道阱质谱对待测样品进行检测。本发明首先选取了标志物及内标，可有效将女贞子的生品和酒制品进行区分。进一步提供了采用超高效液相色谱/四极杆‑轨道阱质谱(UHPLC/Q‑Orbitrap‑MS)对样品进行分离和检测，可有效分离女贞子样品并进行检测，即可准确判断样品是否为生品或酒制品。

Description

一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法
技术领域
本发明涉及药材检测技术领域，特别是涉及一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法。
背景技术
女贞子(Ligustri Lucidi Fructus)为木犀科植物女贞的干燥成熟果实，具有滋补肝肾明目乌发的功效，2002年卫生部公布女贞子可用于保健食品。从女贞子中已分离出多类生物活性天然成分(包括三萜，环烯醚萜，类黄酮，报道了苯乙醇苷等)，药理作用包括抗肿瘤，保肝，免疫调节，抗氧化，抗衰老，抗炎和降低高胆固醇血症等。在临床实践中，2015版药典中记录了女贞子的多种炮制方法，以加强药物效用，减除毒性或副作用，其中以酒制品使用最为重要。
另外，药典中收藏30个包含女贞子的复方，其中为酒女贞子的有9种。但目前关于炮制后的女贞子成分变化的研究关注的多为极少数(通常少于5个)或单一类型的化合物(如三萜类齐墩果酸和熊果酸；环烯醚萜类特女贞苷，橄榄苦苷，G13，女贞苷，木樨榄苷-11-甲酯和女贞酸；以及苯乙醇类的红景天苷，羟基酪醇，酪醇，松果菊苷等)，缺乏潜在化学基础全面系统的研究。女贞子表面为黑紫色或灰黑色，皱缩不平，酒制品由于在炮制过程中，其内含物随酒渗出附于表面而具有一层白色霜状物。
目前，对于区别女贞子黄酒炮制前后样品多用肉眼鉴别，尚未见质谱方面等灵敏度高、快速的鉴别报道。
功效和毒性的变化往往与加工过程中药材整体化学变化密切相关。受益于分析技术的快速发展，可以直接通过各种分析方法描述化学变化(例如近红外光谱，核磁共振，和环境电离质谱法等)。中药往往化学成分复杂，各组分极性、含量差异大。基于数据依赖性采集(DDA)的常规非目标性分析策略，那些低含量化合物经常面临严重干扰难以描述。因此，灵敏靶向的分析方法对于系统表征变得极为重要。
代谢组学作为一种新兴的学科，是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，旨在寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。分析技术和信息学的最新研究已经将代谢组学用于药物发现和精准医学，已成为代谢物综合分析比较重要的技术手段。植物所含化合物种类多，含量范围大，目前代谢组学是中药认证和食品科学的有力工具，可确保安全性，质量和可追溯性。代谢组学分为非目标和目标模式两种，基于MS的代谢组学方法凭借高灵敏度而在代谢组学中广泛地使用。非靶向代谢组学通常通过全扫描MS或MSE测定生物标志物发现到系统代谢组的变化，而靶向模式通过MRM定量测定已知化合物，基于有限标准化合物分析的代谢组学方法限制了LC-MS在植物研究中的应用。
发明内容
本发明提供一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法，以实现市售的女贞子生品和酒制品的快速鉴别。具体技术方案如下：
一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法，以10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、木樨草素中的一种或至少两种作为标志物；并以橄榄苦苷糖苷配基为内标。
经过验证，选取上述的每一个化合物单独作为标志物已经能够较好地分辨女贞子生品和酒制品。
作为解释和说明，本领域技术人员可以理解：在知晓上述标志物和内标的基础之上，已经可以通过本领域常规技术手段对女贞子样品进行一般的分离检测，并在此基础之上经过试验研究后加以初步判断。
优选地，所述标志物包括10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、和木樨草素。
在以上述全部化合物作为标志物可在不提升成本的情况下，更为准确地鉴别女贞子生品和酒制品。
本发明所述的鉴别方法，优选地，所述标志物还包括：红景天苷、nuzhenal A、女贞酸、芹菜素、protocatechuic acid、acetylnicotiflorine or isomer、10-羟基-木樨榄苷二甲酯中的一种或至少两种。
上述化合物也可良好地反映女贞子生品和酒制品的区别，在需要更为精准的进行鉴别时，可加入上述化合物作为标志物。
本发明所述的鉴别方法，优选地，以超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)进行检测。
进一步优选地，所述超高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱：HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；
流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，0.1％甲酸乙腈(B)；
柱温：25℃，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；洗脱梯度如下：
Figure BDA0002232693740000031
本发明对流动相进行了调整和优化后，得到上述技术方案。发明人于研发时，曾经比较过含0.05％和0.1％甲酸的水相，结果从色谱图0-5min和15-20min可以明显看出色谱峰比含0.2％和0.3％甲酸的水相响应较高，但是酸的浓度过低，色谱重现性差，因此，水相选择0.1％甲酸水。
和/或，所述质谱的参数如下：
喷雾电压+3.0kV/-2.8kV；鞘气(N2)35L/h；辅助气(N2)10L/h；吹扫气(N2)0L/h；毛细管温度350℃；辅助气加热温度400℃，源内裂解电压SID为0eV；Full MS全扫描范围100-1500m/z，分辨率为70000；隔离宽度设置为4Da；动态背景排除(DBS)时间为10s。
本发明所述的质谱在使用时搭配加热电喷雾离子源(HESI)，应用Full MS的正负切换的离子扫描方法，同时打开Inclusion功能，包含根据文献报道的已知成分建立的母离子列表。通过设置动态排除以记录更有针对性的共洗脱前体的碎片信息。
经过验证，本发明所提供的超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱参数可良好地对待测样品进行分离和检测。
本发明所述的鉴别方法，在利用所述超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱法进行对女贞子样品进行检测后，在基峰图(BPC图)中，将所述标志物和所述内标的峰面积比作为确定值。依据不同标志物确定值的大小可以将女贞子生品或酒制品进行区分。
更优选地，在得到不同标志物的确定值之后，判断标准如下：
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯时，所述确定值<1.8，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值＞1.8，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为新女贞苷或同分异构体时，所述确定值>0.5，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值<0.5，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为8-demethyl-7-ketologanin时，所述确定值<0.05，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.05，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为elenolic acid时，所述确定值<0.1，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.1，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为毛蕊花糖苷时，所述确定值>1.1，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值<1.1，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为木樨草素时，所述确定值>0.2，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值<0.2，则判断所述女贞子样品为酒制品。
进一步优选地，判断标准还包括：
所述标志物为红景天苷时，所述确定值<0.135，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.135，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为nuzhenal A时，所述确定值>0.415，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值<0.415，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为女贞酸时，所述确定值<0.15，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.15，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为芹菜素时，所述确定值>0.13，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值<0.13，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为protocatechuic acid时，所述确定值<0.16，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.16，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为acetylnicotiflorine or isomer时，所述确定值为0，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.005，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯或同分异构体时，所述确定值<0.08，则判断所述女贞子样品为生品，所述确定值>0.08，则判断所述女贞子样品为酒制品；
在本发明所提供的检测方法的基础之上，按照上述的判断标准，可准确、有效区分女贞子生品和酒制品。
本发明所提供的女贞子生品和酒制品的鉴别方法，具体可包括如下步骤：
(1)将女贞子样品直接烘干后粉碎提取，得到待测样品；
(2)以所述超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱对所述待测样品进行检测，并在基峰图(BPC图)中，将所述标志物和所述内标的峰面积比作为所述标志物的确定值；
(3)对步骤(2)所得确定值进行判断。
其中，优选地，所述步骤(3)为：依据上述任意一项所述的判断标准对步骤(2)所得确定值进行判断。
优选地，所述女贞子样品的产地来源选自河北、河南、四川、江苏、安徽、西安、山西、浙江、湖北、广西、山东中的一种或至少两种。
作为本发明较为优选的技术方案，本发明提供一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)待测样品的处理：
取得女贞子样品，粉碎后得到样品粉末，样品粉末和甲醇水溶液按照(15-25)ml：1ml的比例后超声，即得到待测样品。
更为优选地，所述步骤(1)，包括如下步骤：
对女贞子样品以粉碎机粉碎三次，每次10秒，过三号筛。精密称定粉末200mg于50ml离心管中，加50％的甲醇20mL，称重，涡旋2min，超声提取30min，恢复至室温后，用50％甲醇补足失重，摇匀后部分提取液14000r/min离心10min，取上清液即得。
(2)检测：
对待测样品进行超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)检测并得到基峰图(BPC图)；
选取10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、和木樨草素作为标志物，并以橄榄苦苷糖苷配基为内标。
在基峰图(BPC图)中，分别得到不同标志物与内标的峰面积比作为不同标志物的确定值。
其中：
超高效液相色谱参数如下：
色谱柱：HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，0.1％甲酸乙腈(B)；柱温：25℃，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；洗脱梯度见表1。
表1、色谱分离的洗脱梯度
Figure BDA0002232693740000071
质谱参数如下：
搭配加热电喷雾离子源(HESI)，应用Full MS的正负切换的离子扫描方法，同时打开Inclusion功能，包含根据文献报道的已知成分建立的母离子列表。设定主要源参数如下：喷雾电压+3.0kV/-2.8kV；鞘气(N2)35L/h；辅助气(N2)10L/h；吹扫气(N2)0L/h；毛细管温度350℃；辅助气加热温度400℃，源内裂解电压SID为0eV。Full MS全扫描范围100-1500m/z，分辨率为70000。隔离宽度设置为4Da。动态背景排除(DBS)时间为10s，通过设置动态排除以记录更有针对性的共洗脱前体的碎片信息。
(3)判断
通过步骤(2)所得到的不同标志物的确定值，依据如下判断方法进行判断。
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯时，所述确定值<1.8，则判断为生品，所述确定值＞1.8，则判断为酒制品；
所述标志物为新女贞苷或同分异构体时，所述确定值>0.5，则判断为生品，所述确定值<0.5，则判断为酒制品；
所述标志物为8-demethyl-7-ketologanin时，所述确定值<0.05，则判断为生品，所述确定值>0.05，则判断为酒制品；
所述标志物为elenolic acid时，所述确定值<0.1，则判断为生品，所述确定值>0.1，则判断为酒制品；
所述标志物为毛蕊花糖苷时，所述确定值>1.1，则判断为生品，所述确定值<1.1，则判断为酒制品；
所述标志物为木樨草素时，所述确定值>0.2，则判断为生品，所述确定值<0.2，则判断为酒制品。
作为更进一步优选的技术方案，步骤(2)所选用的标志物还包括：
红景天苷、nuzhenal A、女贞酸、芹菜素、protocatechuic acid、acetylnicotiflorine or isomer和10-羟基-木樨榄苷二甲酯中的一种或至少两种。
相应地，步骤(3)判断方法还包括：
所述标志物为红景天苷时，所述确定值<0.135，则判断为生品，所述确定值>0.135，则判断为酒制品；
所述标志物为nuzhenal A时，所述确定值>0.415，则判断为生品，所述确定值<0.415，则判断为酒制品；
所述标志物为女贞酸时，所述确定值<0.15，则判断为生品，所述确定值>0.15，则判断为酒制品；
所述标志物为芹菜素时，所述确定值>0.13，则判断为生品，所述确定值<0.13，则判断为酒制品；
所述标志物为protocatechuic acid时，所述确定值<0.16，则判断为生品，所述确定值>0.16，则判断为酒制品；
所述标志物为acetylnicotiflorine or isomer时，所述确定值为0，则判断为生品，所述确定值>0.005，则判断为酒制品；
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯(或同分异构体)时，所述确定值<0.08，则判断为生品，所述确定值>0.08，则判断为酒制品。
经发明人重复试验40次以上，上述所提供的判断标准可准确分辨女贞子生品和酒制品。
本发明首先选取了标志物及内标，可有效将女贞子的生品和酒制品进行区分。作为本领域技术人员，在知晓本发明所提供的标志物及内标的情形下，采用本领域常规的分离和检测手段，可将女贞子生品和酒制品进行初步区分。
不仅如此，本发明进一步提供了更有针对性的检测方法——采用超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)对样品进行分离和检测。采用上述方法，建立了包含前体离子列表的Full Mass(全质量)方法，实现了正负离子模式快速切换采集，同时可通过开启“If idle-pick others”功能获取非目标化合物的碎片信息。在上述检测方法下，可有效分离女贞子样品并进行检测，按照本发明所提供的判断标准即可准确判断样品是否为生品或酒制品。
本发明所提供的检测方法便捷、准确，重复性高。
作为补充说明和解释，本发明所涉及的化合物的英文命名和中文命名或结构式对应如下：
Figure BDA0002232693740000101
Figure BDA0002232693740000111
Figure BDA0002232693740000121
Figure BDA0002232693740000131
Figure BDA0002232693740000141
Figure BDA0002232693740000151
如无特殊说明，本发明中所述的化合物均以上述命名及对应关系为准。
当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为正、负离子模式下，女贞子样品在不同炮制时间以及QC样品的PCA的得分图，其中，左图为负离子模式，右图为正离子模式；
图2为正、负离子模式下，女贞子样品在炮制0h和12h的OPLS-DA得分图，其中，左图为负离子模式，右图为正离子模式；
图3为正、负离子模式下，女贞子样品在炮制0h和12h的S-Plot图，其中，左图为负离子模式，右图为正离子模式；
图4为负离子模式下，女贞子样品在炮制0h和12h的BPC图及13个标志物和内标的出峰位置(编号在A中表示该化合物在生品中峰面积大)，其中，横坐标为时间(min)，纵坐标为相对丰度(％)；
图5为标志物10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、木樨草素的箱线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所涉及仪器如下：
UHPLC/Q-Orbitrap MS质谱仪：Ultimate 3000超高效液相系统(Thermo FisherScientific,San Jose,CA,USA)；
高分辨质谱质谱仪Q-Orbitrap MS(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)；
KQ-250E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，江苏，中国)；
AX205十万分之一天平(Mettler Toledo,Switzerland)；
BP121S万分之一天平(Sartorius,Germany)；
涡旋混合仪(Thermo Scientific,USA)；
5424R低温高速离心机(Eppendorf，Germany)；
电磁炉(美的)。
对实施例中所涉及的部分试剂和药材做来源披露如下：
乙腈(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲酸(ACS,Wilmington,USA)，均为色谱纯。
去离子水经Milli-Q系统(Millipore,Bedford.MA,USA)纯化。
东风花雕酒(3年陈黄酒，清爽型，会稽山绍兴酒股份有限公司)；
女贞子(生品，酒制)样品购自河北省安国药材市场以及全国各大药房。
以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
实施例1
本实施例提供一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法，包括如下步骤：
(1)待测样品的处理：
取得女贞子样品，对女贞子样品以粉碎机粉碎三次，每次10秒，过三号筛。精密称定粉末200mg于50ml离心管中，加50％的甲醇20mL，称重，涡旋2min，超声提取30min，恢复至室温后，用50％甲醇补足失重，摇匀后部分提取液14000r/min离心10min，取上清液得到待测样品。
(2)检测：
对待测样品进行超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)检测并得到基峰图(BPC图)；
选取10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、和木樨草素作为标志物，并以橄榄苦苷糖苷配基为内标。
在基峰图(BPC图)中，分别得到不同标志物与内标的峰面积比作为不同标志物的确定值。
其中：
超高效液相色谱参数如下：
色谱柱：HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，0.1％甲酸乙腈(B)；柱温：25℃，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；洗脱梯度见表1。
表1、色谱分离的洗脱梯度
Figure BDA0002232693740000181
质谱参数如下：
搭配加热电喷雾离子源(HESI)，应用Full MS的正负切换的离子扫描方法，同时打开Inclusion功能，包含根据文献报道的已知成分建立的母离子列表。设定主要源参数如下：喷雾电压+3.0kV/-2.8kV；鞘气(N2)35L/h；辅助气(N2)10L/h；吹扫气(N2)0L/h；毛细管温度350℃；辅助气加热温度400℃，源内裂解电压SID为0eV。Full MS全扫描范围100-1500m/z，分辨率为70000。隔离宽度设置为4Da。动态背景排除(DBS)时间为10s，通过设置动态排除以记录更有针对性的共洗脱前体的碎片信息。
(3)判断
通过步骤(2)所得到的不同标志物的确定值，依据如下判断方法进行判断。
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯时，所述确定值<1.8，则判断为生品，所述确定值＞1.8，则判断为酒制品；
所述标志物为新女贞苷或同分异构体时，所述确定值>0.5，则判断为生品，所述确定值<0.5，则判断为酒制品；
所述标志物为8-demethyl-7-ketologanin时，所述确定值<0.05，则判断为生品，所述确定值>0.05，则判断为酒制品；
所述标志物为elenolic acid时，所述确定值<0.1，则判断为生品，所述确定值>0.1，则判断为酒制品；
所述标志物为毛蕊花糖苷时，所述确定值>1.1，则判断为生品，所述确定值<1.1，则判断为酒制品；
所述标志物为木樨草素时，所述确定值>0.2，则判断为生品，所述确定值<0.2，则判断为酒制品。
试验例1
本试验例提供本发明标志物及内标的选择及验证过程。
包括如下步骤：
(1)采集女贞子(生品和酒制品)样品
采集结果如表2所示：
表2、女贞子(生品和酒制品)样品的信息
Figure BDA0002232693740000191
Figure BDA0002232693740000201
Figure BDA0002232693740000211
(2)样品制备
第一标准样品的制备：
取女贞子生品S1，筛选去梗，称取25g于培养皿(直径180mm)中，移液管加入50％黄酒10mL，摇匀，共36份。用保鲜膜密封12小时直至黄酒吸尽。取闷润后的女贞子于纱布上，隔水蒸。武火(1900W/270℃)水沸后改为文火(800W/130℃)，分别炮制2、4、6、8、10、12h后取出，每个时间点6份。放凉过夜，转移至50℃烘干箱中烘干。粉碎机粉碎(3*10s)，过三号筛。精密称定200mg，加50％的甲醇20mL，称重，涡旋2min，超声处理30min，恢复至室温补足失重，摇匀后部分提取液14000r/min离心10min，取上清液5μL待用；
并制备未炮制(即炮制时间为0h)样品6份。
第二标准样品的制备：
购买的女贞子商品直接烘干后直接粉碎提取待用，具体地，可参考实施例1步骤(1)所公开的方法；在本试验例中，采用实施例1步骤(1)所公开的方法。
QC(质量控制)样品的制备：
QC(质量控制)样品为炮制0、2、4、6、8、10、12h的42个样品提取液的等量混合物。
(3)对第一标准样品、第二标准样品和QC样品分别进行超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)检测得到原始数据，原始数据包括质荷比、保留时间、峰面积。
其中，超高效液相色谱参数如下：
色谱柱：HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，0.1％甲酸乙腈(B)；柱温：25℃，流速：0.4mL/min；进样量：5μL；洗脱梯度见表3。
表3、色谱分离的洗脱梯度
Figure BDA0002232693740000221
质谱参数如下：
搭配加热电喷雾离子源(HESI)，应用Full MS的正负切换的离子扫描方法，同时打开Inclusion功能，包含根据文献报道的已知成分建立的母离子列表。设定主要源参数如下：喷雾电压+3.0kV/-2.8kV；鞘气(N2)35L/h；辅助气(N2)10L/h；吹扫气(N2)0L/h；毛细管温度350℃；辅助气加热温度400℃，源内裂解电压SID为0eV。Full MS全扫描范围100-1500m/z，分辨率为70000。隔离宽度设置为4Da。动态背景排除(DBS)时间为10s，通过设置动态排除以记录更有针对性的共洗脱前体的碎片信息。
(4)数据处理
采用SIMCA-P 14.1、Compound Discover 2.0软件(Thermo Fisher Scientific,USA)。
采用CompoundDiscover软件处理原始数据，分别得到包含不同质荷比离子信息的正负模式列表，在excel中去除QC中响应RSD超过30％的碎片，进行归一化处理。
应用软件SIMCA-P 14.1进行模式识别，通过主成分分析(PCA-X)方法，比较生品(6份S1)和不同炮制时间(2h、4h、6h、8h、10h、12h)的女贞子样品的离散程度来寻找的最佳炮制时间；利用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法，以OPLS-DA模型变量权重值(VIP)>1.5为筛选标准，筛选显著性差异代谢物。
(5)选取标志物
如附图1所示：图1为负、正离子模式下，女贞子不同炮制时间点及QC的主成分分析法(PCA)得分图，显示了女贞子从在0-12小时(H)从生品到酒制品成分整体连续变化轨迹，其中12小时炮制品与生品整体差异最大。
进一步对0h和12h进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA分析)，得到OPLS-DA的得分图，如附图2所示。
再对每一个成分求VIP(Variable Importance in Projection)值，得到VIP列表后，选取VIP列表中>1.5为筛选标准(S-Plot)，如附图3所示。正负离子模式下共得到了171个显著性差异代谢物，如附图3深色部分，其中鉴定了30个为潜在标志物，记载在表4。
如附图4(其中，附图4中所出现的数字编号与表4中的编号指代一致)，在生品和酒制品的BPC图，橄榄苦苷糖苷配基oleuropein aglycone峰面积较大，且统计分析中认为是非差异代谢物，故选作为内标(在图4中标记为“IS”)。
分别将30种标志物与橄榄苦苷糖苷配基(内标)的峰面积比作为确定值，能够明确的区分女贞子生品和实验室自制12h炮制品，如表4所示。
表4标志物及确定值阈值范围
Figure BDA0002232693740000241
Figure BDA0002232693740000251
注：编号顺序为峰面积由大到小排列
作为解释和说明，编号为9所列的数据为测量后所得到的毛蕊花糖苷的具体数据，编号为16所列的数据为毛蕊花糖苷与橄榄苦苷糖苷配基数据的比值。
编号为12所列的数据为测量后所得到的10-羟基橄榄苦苷/ligustal的具体数据，编号为15所列的数据为10-羟基橄榄苦苷/ligustal与橄榄苦苷糖苷配基数据的比值。
编号为23所列的数据为测量后所得到的特女贞苷的具体数据，编号为26所列的数据为特女贞苷与橄榄苦苷糖苷配基数据的比值。
利用所采集的20批商品中的生品和酒制品(S2-S21)进一步验证有13个成分完全符合，生品与酒制品的阈值如表5所示。
表5、区分女贞子生品和酒制品的13个标记物
Figure BDA0002232693740000261
从附图4可看出，编号为2、4、7、8、9、11的化合物的峰面积最大，以峰面积最大的6个化合物作为标志物绘制箱线图，得到附图5(附图5中的数字编号所代表的化合物与表4中相对应)，从附图5可以看出，本发明中所筛选得到的标志物已经可以较好的区分实验室自制及商品化的女贞子生品与酒制品。
作为解释，附图5中，所标注的“R”为生品，“W”为酒制品。
试验例2
本试验例验证本发明所提供的女贞子生品和酒制品的鉴别方法的准确性。
验证方法如下：
(1)样品的选择和处理：
从药房购买女贞子生品和酒制品共5份，其中，生品2份，酒制品3份，记录型号后随机编号为1-5号。
对1-5号样品按照实施例1的步骤(1)所述的方法进行处理，得到待测样品1-5号。
(2)检测：
选取10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或同分异构体、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、和木樨草素作为标志物，并以橄榄苦苷糖苷配基为内标。
按照实施例1的步骤(2)相同的条件对待测样品1-5号分别进行检测，并得到基峰图(BPC图)后，再分别得到待测样品1-5号的标志物与内标的峰面积比值作为确定值。
(3)判断：
通过步骤(2)所得的待测样品1-5号的不同标志物的确定值，依据本发明所提供的判断标准进行判断，并检查待测样品1-5号的购买型号可知，本发明所提供的标志物可有效将女贞子生品和酒制品进行区分。采用本发明所提供的检测方法即可简便有效地鉴别女贞子生品和酒制品。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种女贞子生品和酒制品的鉴别方法，其特征在于，以10-羟基-木樨榄苷二甲酯、新女贞苷、8-demethyl-7-ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、木樨草素中的一种或至少两种作为标志物；并以橄榄苦苷糖苷配基为内标；
在利用超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱法对女贞子样品进行检测后，在BPC图中，将所述标志物和所述内标的峰面积比作为所述标志物的确定值，判断标准如下：
所述标志物为10-羟基-木樨榄苷二甲酯时，所述标志物的确定值<1.8，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值＞1.8，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为新女贞苷时，所述标志物的确定值> 0.5，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值< 0.5，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为8-demethyl-7-ketologanin时，所述标志物的确定值<0.05，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值>0.05，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为elenolic acid时，所述标志物的确定值< 0.1，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值>0.1，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为毛蕊花糖苷时，所述标志物的确定值>1.1，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值<1.1，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为木樨草素时，所述标志物的确定值>0.2，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值<0.2，则判断所述女贞子样品为酒制品。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述标志物还包括：红景天苷、nuzhenal A、女贞酸、芹菜素、protocatechuic acid、acetylnicotiflorine中的一种或至少两种；
判断标准如下：
所述标志物为红景天苷时，所述标志物的确定值< 0.135，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值> 0.135，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为nuzhenal A时，所述标志物的确定值>0.415，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值<0.415，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为女贞酸时，所述标志物的确定值< 0.15，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值> 0.15，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为芹菜素时，所述标志物的确定值>0.13，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值<0.13，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为protocatechuic acid时，所述标志物的确定值< 0.16，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值> 0.16，则判断所述女贞子样品为酒制品；
和/或，
所述标志物为acetylnicotiflorine时，所述标志物的确定值为0，则判断所述女贞子样品为生品，所述标志物的确定值> 0.005，则判断所述女贞子样品为酒制品。
3.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱：HSS T3；
流动相：A ：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈；
柱温：25 ℃，流速：0.4 mL/min；进样量：5µL；
洗脱梯度如下：
时间/min B/%
0‒13.5： 1‒30；
13.5‒14： 30‒32；
14‒14.5： 32‒45；
14.5‒16.5： 45‒64；
16.5‒21.5： 64‒100；
21.5‒26.5： 100-100；
26.5-27： 100-1；
27-29： 1-1。
4.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述质谱的参数如下：
喷雾电压+3.0 kV/-2.8 kV；鞘气35 L/h；辅助气10 L/h；吹扫气0 L/h；毛细 管温度350 ℃；辅助气加热温度400 ℃，源内裂解电压SID为0 eV；Full MS全 扫描范围100-1500m/z，分辨率为70000；隔离宽度设置为4 Da；动态背景排除 DBS时间为10 s。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将女贞子样品直接烘干后粉碎提取，得到待测样品；
（2）以所述超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱对所述待测样品进行检测，在基峰图中，将所述标志物和所述内标的峰面积比作为所述标志物的确定值；
（3）依据所述判断标准对步骤（2）所得确定值进行判断。
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