CN114184727A - 源自皂荚的三种药材的鉴别方法及其应用 - Google Patents

源自皂荚的三种药材的鉴别方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明关于中药鉴定技术领域，尤其涉及一种源自皂荚的三种中药的鉴别方法及其应用。本发明采用反相超高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用技术，以鉴别大皂角和猪牙皂的三个标志物(Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B)和鉴别皂角刺的四个标志物(2‑Methyl‑7‑(2‑methyl‑2‑propanyl)‑2‑[(3E,7E)‑4,8,12‑trimethyl‑3,7,11‑tridecatrien‑1‑yl]‑6‑chromanol或其同分异构体(C30H46O2)、齐墩果酸的同分异构体(C30H48O3)、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2))，能够实现对皂荚属三种中药大皂角、猪牙皂和皂角刺的精准分析与鉴别。

Description

源自皂荚的三种药材的鉴别方法及其应用
技术领域
本发明关于中药鉴定技术领域，尤其涉及一种源自皂荚的三种中药的鉴别 方法及其应用。
背景技术
皂荚，又名皂角，是医药产品，保健品，化妆品及洗涤用品的天然原料， 具有很高的经济价值。在中国药典中收录了源自皂荚的三种药材，包括：大皂 角，猪牙皂和皂角刺。大皂角为豆科植物皂荚的干燥成熟果实；可以开窍，祛 痰，通窍等，主要治疗猝然昏迷、口噤不开，支气管哮喘，便秘等。猪牙皂为 皂荚所结的畸形小荚果；具有通窍，涤痰，搜风，杀虫的功效。皂角刺，又称 皂角针，为豆科植物皂荚的干燥棘刺；具有消肿排脓，抗癌抑癌的功效。目前， 对于大皂角，猪牙皂和皂角刺的鉴别，中国药典中所收载的鉴别方法只有薄层色谱法，参照物均为各自的对照药材。然而，由于上述三种药材均来自于皂荚 同一植物，所含成分类型相似，如三萜皂苷、生物碱、甾醇类、香豆素类、黄 酮类、木脂素类、酚类等，而目前对于这三种中药之间的差异成分的阐释并不 明确。系统阐释三种皂荚来源中药的化学组成差异，对于保障其临床应用、构 建更加科学的质量标准具有重要的意义。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种源自皂荚的三种中药的鉴别方法及其 应用，该鉴别方法联合使用反相超高效液相色谱与高分辨率四级杆飞行时间质 谱技术采集皂荚属植物的样品数据，通过QI解卷积结合多元统计分析，寻找出 大皂角、猪牙皂和皂角刺间的差异鉴别点，能够准确鉴别大皂角、猪牙皂和皂 角刺。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种源自皂荚的三种中药的鉴别方法，所述中药为大皂角，猪牙皂和皂角 刺；以Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B、 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)、齐墩果酸的同分异构体 (C30H48O3)、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)中的至少一种化 合物作为标志物，利用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱 (UHPLC/Q-TOF-MS)进行检测，通过检测结果鉴别上述三种中药。
其中，2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11- tridecatrien-1-yl]-6-chromanol的结构式如下所示：
Figure BDA0003372705100000021
在知晓上述标志物的基础之上，已经可以通过本领域常规技术手段对皂荚 样品进行一般的分离检测，并在此基础之上经过试验研究后加以初步判断
本发明的鉴别方法在利用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱法对皂荚 样品进行检测，经过QI软件处理，将解卷积后的标志物和内标的峰面积比作为 确定值，依据不同标志物确定值的大小可以将大皂角、猪牙皂和皂角刺进行区 分。
优选地，所述鉴别方法以(3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R) bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo-2-oxabicyclo[2.2.1]heptane-1-carboxylate)或其同分异构体(C50H74O8)为内标。该化合物在皂荚样品中均含有且含量相差不大，在色 谱图中的响应不影响其他成分，可以用于不同批次间相同成分含量比较。
其中，(3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R)bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo- 2-oxabicyclo[2.2.1]heptane-1-carboxylate)的结构式如下所示：
Figure BDA0003372705100000031
优选地，所述标志物包括Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B、 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)、齐墩果酸的同分异构体(C30H48O3)、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)。以上述全部化 合物作为标志物可在不提升成本的情况下，更为准确地鉴别大皂角、猪牙皂和 皂角刺。
优选地，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱， 所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003372705100000032
Figure BDA0003372705100000041
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：35～45℃。
本发明所采用的流动相以及线性洗脱程序能够将差异成分进行有效分离， 得到较多的色谱峰，从而有利于质谱分析。
优选地，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18。在本发明的色谱条件 下，采用该色谱柱能够在短时间内得到色谱峰多，离子数多，分离度好的BPI 图。
优选地，所述柱温为40℃。在本发明的色谱条件下，柱温40℃时所得到的 BPI图色谱峰多，分布均匀，且通过与UNIFI数据库匹配后所得到的离子数最 多。
优选地，所述质谱的参数为：
正离子模式下，喷雾电压+3.0kV；锥孔电压20V；碰撞能量为10-30V；辅 助气50L/h；脱溶剂气600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围 120-2400m/z；扫描时间0.3s；或
负离子模式下，喷雾电压-3.0kV；锥孔电压60V；小分子量化合物碰撞能 量为10-30V；大分子量化合物碰撞能量为60-80V；辅助气50L/h；脱溶剂气 600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围120-2400m/z；扫描 时间0.3s。
优选地，所述辅助气、脱溶剂气均为氮气N2。
经过验证，本发明所提供的上述超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱参数 可获得较大的峰面积，化合物的二级碎片分布均匀。
利用上述超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱法对大皂角、猪牙皂和皂角 刺进行检测后，经过QI软件处理，解卷积后得到不同标志物和内标的峰面积比 的确定值后，依据不同标志物确定值的大小对大皂角、猪牙皂和皂角刺进行区 分的判断标准如下：
标志物为Saikachinoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙 皂或皂角刺，若确定值>1.5，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为Locustoside B时，若确定值≥0.5，则判断所述皂荚样品为大皂角， 若确定值<0.05，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或猪牙皂；
标志物为Locustoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或 皂角刺，若确定值>0.4，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)时，若确定值<0.2，则判断所述皂 荚样品为大皂角或猪牙皂，若确定值>1.2，则判断所述皂荚样品为皂角刺；
标志物为齐墩果酸的同分异构体(C30H48O3)时，若确定值>0.6，则判断所 述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为花旗松素时，若确定值>0.5，则判断所述皂荚样品为皂角刺，若 确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)时，若确定值>0.5，则判断所 述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂。
在本发明所提供的检测方法的基础之上，按照上述的判断标准，可准确、 有效区分大皂角、猪牙皂和皂角刺。
本发明所提供的大皂角、猪牙皂和皂角刺的鉴别方法具体可包括如下步骤：
S1、将皂荚样品粉碎，用45～55％v/v甲醇进行超声提取，得到待测样品溶 液；
S2、以所述超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱对所述待测样品溶液进行 检测，经过QI软件处理，将解卷积后得到的所述标志物和所述内标的峰面积比 作为所述标志物的确定值；
S3、对步骤S2所得确定值进行判断。
在步骤S3中依据上述任意一项判断标准对步骤S2所得确定值进行判断即 可。
优选地，S1中将所述皂荚样品粉碎至粒径＜250μm。在实际操作中可利用 四号筛对粒径进行控制。
优选地，S1中所述超声的温度为38～42℃，超声时间为1～1.5h。
以及，本发明还提供上述源自皂荚的三种中药的鉴别方法在鉴别成方制剂 中大皂角，猪牙皂和皂角刺的应用。以上鉴别方法可鉴别出待测皂荚样品是大 皂角，猪牙皂和皂角刺中的哪一种，即使在中成药的复杂体系中，也可鉴别所 含皂荚源中药的种类。
本发明的有益效果在于：本发明选取的标志物可将大皂角、猪牙皂和皂角 刺进行初步区分。结合本发明提供的上述更有针对性的检测方法——采用超高 效液相色谱/四级杆飞行时间质谱(UHPLC/Q-TOF-MS)对样品进行分离和检测， 能够确保有效地分离皂荚样品并进行检测，进而按照本发明所提供的判断标准 即可准确判断样品是否为大皂角、猪牙皂和皂角刺。本发明所提供的上述检测 方法便捷、准确，重复性高。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例1中正离子模式下不同产地的皂荚样品以及QC样品 的PCA得分图；
图2为本发明实施例1中正离子模式下不同产地的皂荚样品的OPLS-DA 得分图；
图3为本发明实施例1中正离子模式下大皂角、猪牙皂的OPLS-DA得分 图；
图4为本发明实施例1中正离子模式下不同产地的皂荚样品的VIP图；
图5为本发明实施例1中正离子模式下大皂角、猪牙皂和皂角刺间46个潜 在标志物含量差异热图。
图6为本发明实施例1中标志物Saikachinoside A的箱线图及典型三种中药 样品中对应的提取离子流图；
图7为本发明实施例1中标志物Locustoside A的箱线图及典型三种中药样 品中对应的提取离子流图；
图8为本发明实施例1中标志物Locustoside B的箱线图及典型三种中药样 品中对应的提取离子流图；
图9为本发明实施例1中标志物 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)的箱线图及典型三种中药样品中 对应的提取离子流图；
图10为本发明实施例1中标志物齐墩果酸的同分异构体(C30H48O3)的箱 线图及典型三种中药样品中对应的提取离子流图；
图11为本发明实施例1中标志物花旗松素的箱线图及典型三种中药样品中 对应的提取离子流图；
图12为本发明实施例1中标志物白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)的箱 线图及典型三种中药样品中对应的提取离子流图；
图13为本发明实施例1中内标 (3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R)bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo-2-oxabicycl o[2.2.1]heptane-1-carboxylate)或同分异构体(C50H74O8)的箱线图及典型三种中 药样品中对应的提取离子流图；
图14为本发明对比例1中不同提取溶剂制备待测样品溶液的一级质谱图；
图15为本发明对比例2来自三个不同供应商(Waters、Agilent、Phenomenex) 十种不同亚2μm色谱柱比较图；
图16为本发明对比例4中正、负离子模式下，毛细管电压比较图；
图17为本发明对比例5中正、负离子模式下，锥孔电压比较图；
图16和图17中正离子模式下指标成分：G：7,4'-二羟基-5,3'-二甲氧基黄 酮醇或其同分异构体(tR：6.48min，[M+H]+：m/z 333.0968)，H：Locustoside A(通过化合物对照鉴定)，E：Gleditsia saponin C'或其同分异构体(tR：8.69min， [M+H]+：m/z 1617.7530)，I：Caspicaoside F或其同分异构体(tR：8.50min， [M+H]+：m/z 1779.8058)，J：GleditsiosideN或其同分异构体(tR：21.41min， [M+H]+：m/z 1803.8938)，K：Gleditsia saponin B或其同分异构体(tR：12.81min， [M+H]+：m/z 1981.9415)，L：Caspicaoside I或其同分异构体(tR：21.31min， [M+H]+：m/z 1933.9568)；负离子模式下指标成分，A：Gleditsia saponin B或其同分异构体(tR：21.31min，[M-H]-：m/z 1979.9271)，B： 5-(3″-acetoxypropyl)-2-(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)-7-methoxy-3-methylbenzofu ran或其同分异构体(tR：28.34min，[M-H]-：m/z 383.1501)，C：丁香脂素-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷或其同分异构体(tR：6.97min，[M-H]-：m/z 579.2084)，D： diosmetin-7-O-β-D-glucoside或其同分异构体(tR：4.31min，[M-H]-：m/z 459.1297)，E：Gleditsia saponin C'或其同分异构体(tR：8.73min，[M-H]-： m/z 1615.7386)，F：鹅掌揪苷或其同分异构体(tR：5.35min，[M-H]-：m/z741.2612)，G：7,4'-二羟基-5,3'-二甲氧基黄酮醇或其同分异构体(tR：6.51min， [M-H]-：m/z 331.0824)。[M-H]-、[M+H]+质荷比均为化合物的理论值，设置允 许质量偏差100ppm进行提取，所得提取离子流图积分得峰面积值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
皂荚源中药大皂角，猪牙皂和皂角刺，通过目前中国药典收载的薄层鉴别 方法难以准确鉴别与区分，针对该问题，本发明首次使用代谢组学技术结合超 高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱联用技术对来源于皂荚的三种药材进行分 析，将质谱等采集到的数据通过采用成熟的组学软件，智能化的对采集的大数 据进行分析，找到差异成分作为指标从而指导中药真伪鉴别，同时结合靶标分 离的技术对差异成分进行鉴定，为中药物质基础研究提供有力的支撑。
以下实施例中所采用的试剂和药品：
乙腈(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲酸(ACS,Wilmington,USA)，均 为色谱纯。去离子水经Milli-Q系统(Millipore,Bedford.MA,USA)纯化。
3种皂荚属45批大皂角、猪牙皂和皂角刺主要购自河南、河北、山西、陕 西、山东、贵州、云南、广西、四川、安徽、湖北、江西等地，样品信息见表 1。
表1 3种皂荚属45批大皂角、猪牙皂和皂角刺的样品信息
Figure BDA0003372705100000091
Figure BDA0003372705100000101
以下实施例中所采用的主要仪器：
UHPLC/Q-TOF MS高分辨液质联用仪：ACQUITY UPLC I-Class PLUS超 高效液相色谱仪(Waters Corporation,Milford,MA,USA)；高分辨质谱仪Xevo G2-XS Q-TOF MS(Waters Corporation,Milford,MA,USA)；SB-5200DT超声 波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，浙江，中国)；Vortex-2旋涡混 匀仪(上海泸析实业有限公司，上海，中国)；5804R低温高速离心机(Eppendorf, Germany)。
以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本 领域公知方法取得。
实施例1
本发明实施例提供了差异鉴别标志物的获得过程。
1、样品制备
分别将表1所示的45批大皂角、猪牙皂和皂角刺粉碎，过四号筛。精确称 取200mg粉末用50％v/v甲醇8mL进行提取，在40℃下超声1h，静置放冷后 补足失重，14000rmp离心10min，分别取上清液至10mL容量瓶中，定容至刻 度线，混匀后分别用移液枪移取1mL至1.5mL EP管中，14000rmp离心10min 后，取上清液。吸取同样体积的由大皂角、猪牙皂、皂角刺制得的上清液，混 匀制得大皂角、猪牙皂、皂角刺三种不同药材的QC样品。用于监测序列运行 中仪器的稳定性。
2、色谱条件
固定相：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱；
流动相：A：0.1％v/v甲酸-水溶液，B：乙腈；柱温：40℃；流速：0.3mL/min； 进样量：3μL；按以下梯度洗脱程序进行洗脱：
Figure BDA0003372705100000111
3、质谱条件
Waters Xevo G2-XS Q-TOF MS质谱参数：正离子模式，喷雾电压+3.0kV； 锥孔电压20V；碰撞能量为10-30V；辅助气50L/h；脱溶剂气600L/h；源温度 350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围120-2400m/z；扫描时间0.3s。
4、数据采集
在上述色谱条件和质谱条件下进行45批样品的数据采集，采用随机进样的 原则，对大皂角、猪牙皂和皂角刺样品进行采集，每6个样品分析后注入QC 样品，实时监测仪器的稳定性。
5、数据分析
对来源于皂荚三种药材进行非靶标代谢组学分析，将在正离子模式下采集 的45批样品数据导入QI软件进行解卷积处理，包括峰对齐和峰检出，采用同 位素和加合物结合的技术，加合物形式包括[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、 [2M+H]+等，最终得到包括tR、m/z、归一化丰度的数据矩阵，采用“80％规则、 30％变异”原则进行数据处理，导入SIMCA软件绘制PCA图以比较三种药材 的离散程度，以OPLS-DA模型变量权重值(VIP)>8.0为筛选标准，筛选显著 性差异标志物。
6、选取标志物
如图1所示：图1为正离子模式下，三种皂荚药材及QC(45个批次药材 提取物等比例混合样品)的主成分分析法(PCA)得分图，QC聚类良好，数 据可靠，皂角刺与大皂角和猪牙皂存在明显差异。
进一步对大皂角、猪牙皂和皂角刺进行正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA分析)，得到OPLS-DA得分图，如图2和图3所示。选取VIP列 表中>8.0为筛选标准，共得到了70个显著性差异代谢物(如图4中虚线以上部 分所示)，其中鉴定了46个为潜在标志物，记录在表2和表3。图5为大皂角、 猪牙皂和皂角刺差异代谢物的热图，反映了该化合物在三种药材间的含量差异。
表2 46个用于区分大皂角、猪牙皂和皂角刺的潜在标志物
Figure BDA0003372705100000121
Figure BDA0003372705100000131
Figure BDA0003372705100000141
Figure BDA0003372705100000151
注：EA：16α-羟基齐墩果酸(C30H48O4，472.35Da)，OA：齐墩果酸(C30H48O3，456.36Da)，Glc：葡萄糖基(C6H10O5，162.05Da)，Ara：阿拉伯糖(C5H8O4， 132.04Da)，Xyl：木糖(C5H8O4，132.04Da)，Rha：鼠李糖(C6H10O4，146.06Da)， GluA：葡萄糖醛酸(C6H10O6，178.05Da)，Ter：6(R)-6-羟基-2,6-二甲基-2,7- 辛二烯酸(C10H16O3，184.11/166.10Da)，Ter-OH：6(R)-6-羟基-2-羟甲基-6-甲 基-2,7-辛二烯酸(C10H16O4，200.10/182.09Da)。
表3 46个用于区分大皂角、猪牙皂和皂角刺的潜在标志物的二级碎片
Figure BDA0003372705100000152
Figure BDA0003372705100000161
Figure BDA0003372705100000171
Figure BDA0003372705100000181
Figure BDA0003372705100000191
注：C代表每种药材中都拥有的化合物；AF代表猪牙皂；F代表大皂角； T代表皂角刺。
7、特征成分
特征成分是指这些成分是该药材中所特有的，其它药材中没有或很少，而 在该药材中含量高。特征成分一定是差异成分，而差异成分不一定是特征成分。 故本发明从上述46个差异成分中寻找每种药材的特征成分，以此来作为该药材 的“鉴别标志物”。
7.1特征成分的分离
称2.0kg大皂角药材进行粉碎，用75％乙醇进行提取，提取两次，每次超 声1h，过滤，将滤液浓缩至干，得到582.5g的提取物，用水复溶提取物，上样， 静置吸附，用水，20％，40％，60％，80％，100％乙醇洗脱D101大孔树脂柱， TLC薄层色谱指导合并，质谱检测，确定差异成分所在馏分Fr3，进行下一步 分离，用水复溶Fr3馏分，上样，静置吸附，用5％，10％，15％，20％，25％， 30％，35％乙醇依次洗脱MCI柱，TLC薄层色谱指导合并，液质检测，确定差 异成分所在馏分并进行制备，依次得到Saikachinoside A和Locustoside A两个 单体化合物。
7.2特征成分的鉴定
从豆科植物皂荚的成熟果实(大皂角)中分离得到化合物M2，呈棕色固 体，易溶于水。在ESI-MS中有一个m/z 396.1517[M-H]-的准分子离子峰，保 留时间为2.14min，与UNIFI自建数据库相匹配，结合二级裂解碎片， ESI-MS/MS：m/z 396.1517[M-H]-、234.0994[M-H-Glc]-与文献中所给出的质谱 碎片相一致。在1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)中δH 8.09(s，1H)为与N 相连的C-8位上的特征氢信号，5.42(d，J＝8.5Hz，1H)为糖端基氢信号，δ 3.33–3.66有6个糖上氢的信号，5.26(t，J＝6.8Hz，1H)处的氢信号表示C-2’ 连接一个氢，4.59(d，J＝7.1Hz，2H)表示C-1'位有2个氢，4.11(s，2H)表 示C-4'位有2个氢，1.68(s，3H)表示C-5'位上连接3个氢。13C-NMR(125MHz, DMSO-d6)中，低场区显示5个不饱和碳信号δC 154.9(C-2)，153.5(C-6)， 153.0(C-4)，142.9(C-8)，102.6(C-5)，根据13C-NMR信号确定为腺嘌呤，碳谱给出了糖的端基碳信号86.4(C-1″)和其他5个碳的信号δC 79.3(C-5″)， 76.3(C-3″)，72.5(C-2″)，68.0(C-4″)，58.9(C-6″)。DEPT谱显示δC 86.4，79.3，76.3，72.5，68.0为叔碳，δC 58.9为仲碳。根据糖的13C-NMR数据可以 确定为核糖。根据以上分析并与文献对照，鉴定化合物M2为Saikachinoside A， 分子式为C16H23N5O7。
从豆科植物皂荚的成熟果实(大皂角)中分离得到化合物M27，呈棕色固 体，易溶于水。在ESI-MS中有一个m/z 382.1723[M+H]+的准分子离子峰，保 留时间为4.56min，与UNIFI自建数据库相匹配，结合二级裂解碎片， ESI-MS/MS：m/z 382.1723[M+H]+、314.1099[M+H-68Da]+、152.0570[M+H-68 Da-Glc]+与文献报道的质谱碎片一致，在1H-NMR(600MHz，CD3OD)中δH 8.14 (s，1H)表示与N相邻的C-8位上所连的氢，5.60(d，1H)为糖端基氢信号，5.14(t，J＝7.2Hz，1H)为C-2'位上所连的氢受邻位CH2的影响裂分成三重峰， 3.74–3.96显示了6个糖上氢的信号，1.77(s，3H)和1.68(s，3H)分别为 C-5'和C-4'位上的3个氢信号。13C-NMR(150MHz,CD3OD+D2O)中，δC 158.1 (C-2)，154.9(C-6)，153.9(C-4)，145.2(C-8)，104.8(C-5)，显示为 腺嘌呤的13C-NMR信号，88.1为糖的端基碳信号，80.1(C-5″)，76.7(C-3″)， 73.5(C-2″)，69.2(C-4″)，60.1(C-6″)为一组糖的信号。根据以上分析并 与文献对照，鉴定化合物M27为Locustoside A，分子式为C16H23N5O6。
特征成分M7是M27的呋喃糖类似物，在ESI-MS中有一个m/z 514.2150 [M+H]+的准分子离子峰，保留时间为5.06min，与UNIFI自建数据库相匹配， 结合二级裂解碎片，ESI-MS/MS：m/z 514.2150[M+H]+、446.1522[M+H-68Da]+、 314.1098[M+H-68Da-Xyl]+、220.1190[M+H-Xyl-Glc]+、152.0570[M+H-68 Da-Xyl-Glc]+与文献报道的质谱碎片一致。通过其与M27的二级碎片相比较得 出，该成分结构上新增加一个呋喃糖，故将M7鉴定为LocustosideB，分子式 为C21H31N5O10。
多元统计分析所发现的70个差异离子通过成分鉴定可以归属为46个差异 成分，将这些成分进一步分析，并以箱线图的形式展示。箱线图及典型三种中 药样品中对应的提取离子流图(EIC)如图6～13所示，可以直观的看出各个成 分在皂荚不同部位中的含量差异。Saikachinoside A、Locustoside B、Locustoside A在大皂角中含量高，而在猪牙皂和皂角刺中含量很低，可以作为大皂角的特 征成分。这三个化合物的结构如下所示。
Figure BDA0003372705100000221
整体上，大皂角和猪牙皂所含化学成分基本相同，除了以上这三个特征成 分之外，其他差异成分在大皂角和猪牙皂中含量相差较小。
皂角刺的特征成分为 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)、齐墩果酸的同分异构体 (C30H48O3)、花旗松素和白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)，它们在皂角刺 中含量很高，而在大皂角和猪牙皂中含量却很少。皂角刺所含的化学成分与大 皂角和猪牙皂相比有显著性差异。故可以直接通过这四个特征成分的一种或至 少两种作为标志物鉴别出皂角刺。
特征成分M8的保留时间为30.77min，在正离子模式下，可观察到m/z 439.3575[M+H]+分子离子峰，结合Xcalibur软件可推测出该化合物的分子式为 C30H46O2，质量偏差为1.18ppm。根据二级质谱碎片m/z 421.3459[M+H-H2O]+， 395.3143[M+H-H2O-C2H2]+，381.3149[M+H-H2O-C3H4]+，327.2684 [M+H-H2O-C2H2-CH2-C4H6]+，273.2212[M+H-H2O-C2H2-CH2-2C4H6]+，结合 Xcalibur软件可推测出二级碎片m/z 273.2212的分子式为C19H29O+(质量偏差 为0.34ppm)，推测该化合物可能的连接方式为C19H29O-2C4H6-CH2-C2H2-OH。 通过分子式在ChemSpider数据库中检索，将M8的结构推测为 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体。
特征成分M20的保留时间为30.55min，在正离子模式下，可观察到分子 离子峰m/z457.3678[M+H]+，以及二级碎片m/z 411.3619[M+H-CH2O2]+、 383.3297[M+H-CH2O2-CO]+。本实验使用了白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的标 准品进行对照，其中白桦脂酸的保留时间为25.78min，齐墩果酸为26.24min， 熊果酸为26.36min。M20的保留时间与这三个化合物的保留时间不一致，结合 Xcalibur软件，推测该化合物的分子式为C30H48O3，故将M20鉴定为齐墩果酸 的同分异构体。
特征成分M21的保留时间为5.97min，与标准品花旗松素的保留时间一致， 在负离子模式下，可以观察到m/z 303.0509[M-H]-分子离子峰，以及m/z 285.0403[M-H-H2O]-、259.0610[M-H-CO2]-、241.0499[M-H-CO2-H2O]-、 217.0506、177.0191、151.0037、125.0244的裂解碎片，它们与标准品的二级碎 片相一致，故可以鉴定M21为花旗松素。
特征成分M34的保留时间为28.70min，在正离子模式下，可观察到 441.3726[M+H]+分子离子峰，m/z 423.3623[M+H-H2O]+与411.3622 [M+H-HCOH]+等二级裂解碎片，但它们与文献报道的白桦脂醛碎片m/z 411、 256、234、207、189不一致。根据[M+H]+分子离子峰，结合Xcalibur软件可推 测出该化合物的分子式为C30H48O2，质量偏差为0.24ppm，故将M34鉴定为白 桦脂醛的同分异构体。
根据上述试验结果，标志物及确定值阈值范围如表4所示。
表4 标志物及确定值阈值范围
Figure BDA0003372705100000231
Figure BDA0003372705100000241
内标化合物的选择，其应该在45批皂荚样品中均含有且含量相差较小，且 受其他成分干扰小，起到可以用于不同批次间相同成分含量比较的作用。本实 例所选内标为M46(3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R)bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo-2-oxabicycl o[2.2.1]heptane-1-carboxylate)或同分异构体(C50H74O8)，保留时间为30.96min， [M+H]+分子离子峰为m/z 803.5439，结合Xcalibur软件推测其分子式为C50H74O8，质量偏差2.17ppm。
实施例2
本发明实施例提供了大皂角，猪牙皂和皂角刺的鉴别方法。
S1、待测样品的处理
称取一定量的药材，粉碎，过四号筛。精确称取200mg粉末用50％v/v甲 醇8mL进行提取，在40℃下超声1h，静置放冷后补足失重，14000rmp离心 10min，分别取上清液至10mL容量瓶中，定容至刻度线，混匀后分别用移液枪 移取1mL至1.5mL EP管中，14000rmp离心10min后，取上清液即得待测样品 溶液。
S2、检测
对待测样品溶液进行超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱 (UHPLC/Q-TOF-MS)检测并得到基峰图(BPI图)；
超高效液相色谱分析在Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS超高效液相 系统下完成，色谱条件具体如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm；Waters)；
流动相：0.1％v/v甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：3μL；
进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003372705100000251
质谱条件为：
正离子模式下，喷雾电压+3.0kV；锥孔电压20V；碰撞能量为10-30V；辅 助气50L/h；脱溶剂气600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围 120-2400m/z；扫描时间0.3s；或
负离子模式下，喷雾电压-3.0kV；锥孔电压60V；小分子量化合物碰撞能 量为10-30V；大分子量化合物碰撞能量为60-80V；辅助气50L/h；脱溶剂气 600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围120-2400m/z；扫描 时间0.3s。
选取Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B、 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)、齐墩果酸的同分异构体 (C30H48O3)、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)作为标志物，并 以 (3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R)bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo-2-oxabicycl o[2.2.1]heptane-1-carboxylate)或同分异构体(C50H74O8)为内标。
采集的多批次样品数据经过QI软件处理，将解卷积后得到的不同标志物与 内标的峰面积比作为不同标志物的确定值。
S3、判断
通过步骤S2所得到的不同标志物的确定值，依据如下判断方法进行判断：
标志物为Saikachinoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙 皂或皂角刺，若确定值>1.5，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为Locustoside B时，若确定值≥0.5，则判断所述皂荚样品为大皂角， 若确定值<0.05，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或皂角刺；
标志物为Locustoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或 皂角刺，若确定值>0.4，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为 2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1 -yl]-6-chromanol或其同分异构体(C30H46O2)时，若确定值<0.2，则判断所述皂 荚样品为大皂角或猪牙皂，若确定值>1.2，则判断所述皂荚样品为皂角刺；
标志物为齐墩果酸的同分异构体(C30H48O3)时，若确定值>0.6，则判断所 述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为花旗松素时，若确定值>0.5，则判断所述皂荚样品为皂角刺，若 确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为白桦脂醛的同分异构体(C30H48O2)时，若确定值>0.5，则判断所 述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂。
对比例1
本对比例提供了采用不同提取溶剂制备待测样品溶液的鉴别结果。
取猪牙皂一批粉碎，过筛(4号筛)，精确称取200mg用不同溶剂(纯水、 30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇)8mL进行提取，在40℃下超声1h， 静置放冷后补足失重，4000rmp离心10min，分别取上清液至10mL容量瓶中， 定容至刻度线，混匀后分别用移液枪移取1mL至1.5mL EP管中，14000rmp离 心10min后，取上清液200μL至进样小瓶，得到浓度分别为20mg/mL的样品。 在Waters Xevo G2-XS QTOF仪器上进样，进样量为3μL，比较一级质谱图(如 图14所示)，确定提取溶剂为50％甲醇。
对比例2
本对比例提供了采用不同色谱柱所得的BPI图。
精密称取表1所示的45批大皂角、猪牙皂和皂角刺各200mg，用50％甲 醇8mL进行提取，在40℃下超声1h，静置放冷后补足失重，4000rmp离心10min， 分别取其上清液至10mL容量瓶中，定容至刻度线，混匀后用移液枪各取300μL 至1.5mL EP管中，涡旋2min，14000rmp离心10min后，取上清液200μL至进 样小瓶，得到大皂角、猪牙皂、皂角刺三种不同药材的待测样品。
色谱条件在实施例2中S2的基础上，将色谱柱更换为Kinetex XB-C18,BEH ShieldRP18,HSS T3,BEH C18,CORTECS UPLC T3,ZORBAX SB-C18, ZORBAX Eclipse Plus C18，CSH Phenyl-Hexyl，CSH Fluoro-Phenyl，CSH C18，所得色谱图如图15所示，ACQUITY UPLCBEH C18(2.1×100mm,1.7μm) 色谱柱在短时间内得到色谱峰多，离子数多，分离度好的BPI图，优于其他各 色谱柱。
对比例3
本对比例提供了采用不同柱温下所得的BPI图。
待测样品溶液的制备方法同对比例2。
色谱条件在实施例2中S2的基础上，将柱温选为25℃、30℃、35℃、40℃， 结果发现，当柱温从25℃升高到40℃时，所得到的BPI图，色谱峰多，分布均 匀，且通过与UNIFI数据库匹配后所得到的离子数最多，因此40℃的柱温为本 发明色谱条件中柱温的最佳选择。
对比例4
本对比例提供了采用不同毛细管电压所得的峰面积。
待测样品溶液的制备方法同对比例2，色谱条件同实施例2。
质谱条件在实施例2中S2的基础上，毛细管电压选取1.0kV，1.5kV，2.0kV， 2.5kV，3.0kV，3.5kV，比较不同毛细管电压下的高中低质量端不同亚型化合物 的峰面积值，如图16和图17所示，正离子模式下，当毛细管电压达到3.0kV 时，化合物的峰面积最大。
对比例5
本对比例提供了采用不同锥孔电压所得的峰面积。
待测样品溶液的制备方法同对比例2，色谱条件同实施例2。
质谱条件在实施例2中S2的基础上，锥孔电压选取20V，40V，60V，80V， 100V，120V，比较不同锥孔电压下的高中低质量端不同亚型化合物的峰面积值， 如图17所示，正离子模式下，随着锥孔电压的升高，所选化合物的峰面积值在 不断减小，综合各化合物的峰面积变化，20V的锥孔电压作为最佳选择。
对比例6
本对比例提供了采用不同裂解能量下化合物的二级碎片分布情况。
待测样品溶液的制备方法同对比例2，色谱条件同实施例2。
质谱条件在实施例2中S2的基础上，裂解能量选取10-30V，20-40V， 30-50V，40-60V，50-70V，60-80V，比较不同裂解能量下指标性成分的二级 裂解碎片。结果显示，在10-30V的裂解能量下，化合物的二级碎片分布均匀。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述中药为大皂角，猪牙皂和皂角刺；以Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B、2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1-yl]-6-chromanol或其同分异构体、齐墩果酸的同分异构体、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体中的至少一种化合物作为标志物，利用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱进行检测，通过检测结果鉴别上述三种中药。
2.根据权利要求1所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法以(3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diyl(1S,4R,1'S,4'R)bis(4,7,7-trimethyl-3-oxo-2-oxabicyclo[2.2.1]heptane-1-carboxylate)或其同分异构体(C50H74O8)为内标。
3.根据权利要求1所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述标志物包括Saikachinoside A、Locustoside A、Locustoside B、2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1-yl]-6-chromanol或其同分异构体、齐墩果酸的同分异构体、花旗松素、白桦脂醛的同分异构体。
4.根据权利要求1所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，
所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0003372705090000011
Figure FDA0003372705090000021
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：35～45℃。
5.根据权利要求4所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18。
6.根据权利要求4所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述柱温为40℃。
7.根据权利要求4所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，所述质谱的参数为：
正离子模式下，喷雾电压+3.0kV；锥孔电压20V；碰撞能量为10-30V；辅助气50L/h；脱溶剂气600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围120-2400m/z；扫描时间0.3s；或
负离子模式下，喷雾电压-3.0kV；锥孔电压60V；小分子量化合物碰撞能量为10-30V；大分子量化合物碰撞能量为60-80V；辅助气50L/h；脱溶剂气600L/h；源温度350℃；脱溶剂温度600℃；MSE扫描范围120-2400m/z；扫描时间0.3s。
8.根据权利要求1～7任一项所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，待测样品数据经过QI软件解卷积得到不同标志物和内标的峰面积比的确定值后，依据不同标志物确定值的大小对大皂角、猪牙皂和皂角刺进行区分的判断标准如下：
标志物为Saikachinoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或皂角刺，若确定值>1.5，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为Locustoside B时，若确定值≥0.5，则判断所述皂荚样品为大皂角，若确定值<0.05，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或皂角刺；
标志物为Locustoside A时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为猪牙皂或皂角刺，若确定值>0.4，则判断所述皂荚样品为大皂角；
标志物为2-Methyl-7-(2-methyl-2-propanyl)-2-[(3E,7E)-4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrien-1-yl]-6-chromanol或其同分异构体时，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂，若确定值>1.2，则判断所述皂荚样品为皂角刺；
标志物为齐墩果酸的同分异构体时，若确定值>0.6，则判断所述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为花旗松素时，若确定值>0.5，则判断所述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.3，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂；
标志物为白桦脂醛的同分异构体时，若确定值>0.5，则判断所述皂荚样品为皂角刺，若确定值<0.2，则判断所述皂荚样品为大皂角或猪牙皂。
9.根据权利要求1～7任一项所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法，其特征在于，具体可包括如下步骤：
S1、将皂荚样品粉碎，用45～55％v/v甲醇进行超声提取，得到待测样品溶液；
S2、以所述超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱对所述待测样品溶液进行检测，经过QI软件处理，将解卷积后得到的所述标志物和所述内标的峰面积比作为所述标志物的确定值；
S3、对步骤S2所得确定值进行判断。
10.权利要求1～7任一项所述的源自皂荚的三种中药的鉴别方法在鉴别成方制剂中大皂角，猪牙皂和皂角刺的应用。
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