CN115060822B - 基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法 - Google Patents

基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，涉及生物医药技术领域，包括：中药成分簇与人体经络脏腑按照超分子印迹模板产生气析作用而产生药性与药效，并与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，获取指纹图谱并划分出印迹模板成分簇；获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积，并建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系；根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值排序，确定各印迹模板成分簇对浸出率的影响大小；结合仪器响应常数项，以累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围以及平均浓度、浸出率的趋势。本发明能够用于中药浸出物定量分析与质量控制体系，具有较大市场价值。

Description

基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，属于中医药和分析化学结合的交叉学科，更具体的说是涉及一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法。
背景技术
中药材、饮片(包括颗粒饮片)和复方制剂(三者统称产品)是中医药临床治病的三大物质基础，现用指纹图谱进行质量评价和控制。由于指纹图谱色谱峰的峰数和面积受到中药材产地、炮制方法和制剂制备工艺的影响，表现出特征和指纹色谱峰，处于动态变化之中。因此，怎么建立各动态成分指纹图谱的色谱峰面积与总含量的关系就变成了大家关注的问题，一直没有得到很好的解决。
中药材、饮片(颗粒饮片)及其制剂的药效成分群复杂，按多层次、多靶点的超分子“印迹模板”作用于人体经络脏腑而发挥其整体效应，目前对中药成分采用指纹图谱进行定性定量分析。定性的相似度分析方法有相关系数法、聚类分析、夹角余弦法、模糊尖T一分布法、欧式距离法、超信息特征数字化及总量统计矩(相似度)法等，通过比较样品与对照品指纹图谱的各参数相似度，判断其是否来自同一个样本。定量方法多采用一测多评的分析方法，已由单个成分的定性定量质量评价和控制过渡到多成分的定性定量质量评价与控制，以适应中药多成分多靶点作用要求。然而，这些方法难以适用于成分群与药效变化不对应的中药质量评价和控制。
譬如对某地的39批龙牙百合进行指纹图谱分析，其色谱峰峰数最多为62个、最少为22个，相差近3倍；其均值为44.95个，方差为14.75个，RSD为32.81％；浸出率最大为33.67％，最小为16.93％，相差近2倍，其均值为24.26％，方差为5.596％，RSD为23.07％。又如金银花与山银花的化学成分的研究，发现两者在挥发油、环烯醚萜类、黄酮类、三萜皂苷成分、有机酸等成分种类和含量均有明显差异，也就是金银花与山银花成分的构成比和含量存在差异，但临床长期混用，并没有出现明显的疗效和不良反应差异报道，从循证医学的角度考虑，存在“异原等效”现象。因此，仅采用目前的指纹图谱相似性和成分含量测定方法来进行成分群动态变化明显的中药质量评价和控制就会显得非常困难和不便：一则单成分的数目过多，进行统计运算变量过多，运算困难；二则成分含量变化很大，甚至在某一样品的指纹图谱中不能测出，回归偏差过大，这就给参数方程的建立带来了困难，因此如何整合动态变化的成分簇并建立谱量学研究方法是至今尚未解决的难题。
上述问题长期没有得到很好的解决，其根本原因是欠缺关于中药超分子客体对色谱柱和人体产生相同(相似)的印迹性作用特征及其与检测器的响应关系的全面认识。因此，如何攻克中药指纹图谱谱量学研究难题，解决以上所述的现有技术中存在的问题是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，能够解决以上现有技术存在的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，包括以下步骤：
中药成分簇进入人体后，与人体经络脏腑按照超分子印迹模板产生气析作用而产生药性与药效；进行色谱分析时，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，获取指纹图谱并划分出印迹模板成分簇；其中，所述指纹图谱由多个段带成分簇构成；
获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积，并建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系；
根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值排序，确定各印迹模板成分簇对浸出率的影响大小；结合仪器响应常数项，以累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围以及平均浓度、浸出率的趋势。
可选的，所述产生药性与药效，具体为：
中药来源动植物体且为生物巨复超分子体，其中，所述中药的客体为中药成分簇，主体为包括原药材的细胞组织物、酶、DNA、RNA、基因在内的合成中药成分的大分子；
所述中药成分簇与人体经络脏腑按照印迹模板产生印迹作用，呈现印迹行为而产生药性与药效，并反映到中药成分簇与色谱柱按照印迹模板印迹作用的指纹图谱色谱峰的特征变化上，建立以中药印迹模板印迹作用划分成分簇的色谱学方法。
可选的，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，具体为：
所述中药成分簇与色谱柱进行印迹作用，具体表现为某个分子的某一个基团印迹模板随机与色谱固定相进行结合-迁移-解结合-再结合-再迁移的印迹作用，综合印迹特征以色谱峰的保留时间对响应值高斯函数曲线指纹图谱表征出来，根据中药印迹模板特征进行印迹模板成分簇的划分，获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积。
可选的，所述中药成分簇对人体经络脏腑印迹作用的印迹模板与对色谱柱印迹作用的印迹模板内部存在关系，具有相同或相似的印迹模板的成分簇具有相同或相似的药效、相同或相似的保留时间、相同或相似的印迹特征，通过对各成分簇构成和含量变化分析来评价和控制其内在质量。
可选的，建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系，具体为：
各段带色谱峰与其成分相对应，原色谱峰总面积与浓度呈线性关系，整合后的段带色谱峰总面积也与段带成分总浓度或浸出率呈线性叠加关系，获得公式(1)和公式(2)：
ci＝Aiki+bi (1)；
Figure BDA0003693006950000041
式中，ci、Ai、ki分别为单成分浓度、峰面积和响应系数，bi为仪器测定时单成分的响应常数；Cm、Am、Km分别为按匹配频数法划分出的第m“印迹模板”成分簇的段带总浓度、总峰面积和总响应系数，Bm为仪器测定时成分簇响应常数，整合的峰数目从f到g个；ki、Km因不同的检测器而异。
可选的，建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系，具体为：
段带色谱峰总面积与总成分浓度关系式为：
Figure BDA0003693006950000042
段带色谱峰总面积与总浸出率关系式为：
Figure BDA0003693006950000043
式中，CT、VT、WT分别为总成分簇浓度、提取液体积和药材总重量，成分簇共有n个；P、KmT、BmT分别为总成分簇浸出率、总段带成分簇浸出率的响应系数、仪器测定常数，BT为仪器测定时总成分浓度的响应常数。
可选的，根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值排序，确定各印迹模板成分簇对浸出率的影响大小；根据累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围，其中，各段带成分簇的贡献率通过式(5)确定，回归贡献率通过式(6)确定；
Figure BDA0003693006950000051
Figure BDA0003693006950000052
式中，Es、Ek分别为成分簇与回归项的贡献率，
Figure BDA0003693006950000053
为段带成分簇的平均总峰面积，
Figure BDA0003693006950000054
为实测浸出率的平均值。
可选的，根据以上所述的一种基于中药印迹模板成分簇的指纹图谱谱量学的分析方法，获得以下产品：
所述产品包括中药产品、以及体现在中药成分簇印迹模板印迹性分析学上的形式，具体为色谱分析系统、计算软件、色谱柱、试剂和用于印迹模板印迹性分析的对照品；
其中，中药产品标明了包括指纹图谱色谱峰谱量学在内的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子印迹模板色谱峰印迹技术标明包括客体成分色谱峰峰面积在内的各参数。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，将中药成分簇的生物超分子“印迹模板”印迹作用规律和指纹图谱测定的检测器的响应线性叠加规律以及统计学原理结合起来，并根据成分簇作用量和平均峰回归方程的贡献率排序确定成分簇贡献大小和回归趋势，适用于生物原料及其产品的质量评价和控制，具有普适性特点，可应用于中药材、饮片及制剂产品，以及生物制剂的理论、生产与应用研究情况，故具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为39批龙牙百合药材的HPLC指纹图谱，其中，S1、S2为标准品(1.王百合苷A；2.阿魏酸)、S3-S41为39批龙牙百合药材、S42为甲醇；
图2为39批次龙牙百合不同保留时间的匹配频数图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，包括以下步骤：
中药成分簇进入人体后，与人体经络脏腑按照超分子印迹模板产生气析作用而产生药性与药效；进行色谱分析时，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，获取指纹图谱并划分出印迹模板成分簇；其中，所述指纹图谱由多个段带成分簇构成；
获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积，并建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系；
根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值排序，确定各印迹模板成分簇对浸出率的影响大小；结合仪器响应常数项，以累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围以及平均浓度、浸出率的趋势。
中药为生物巨复超分子体是指在自然界的生物进化过程中，生命体通过自组织、自组装、自识别与自复制，在众多小分子模板基础上进行超分子主体结构的合成，组成超分子，最终构成整个生物世界，生物体为各种形式的超分子体。中药多来源于动植物体且为生物巨复超分子体，其中，所述中药的客体为中药成分簇，主体为原药材的细胞组织物、酶、DNA、RNA、基因在内等合成中药成分的大分子；所述中药成分簇与人体经络脏腑按照印迹模板产生气析作用，呈现印迹行为而产生药性与药效，并最终反映到中药成分簇与色谱柱按照印迹模板印迹作用的指纹图谱色谱峰的特征变化上，建立以中药印迹模板印迹作用划分成分簇的色谱学方法。
进一步地，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，具体为：
所述中药成分簇与色谱柱进行印迹作用，即中药成分在进行色谱分析时具体表现为某个分子的某一个基团印迹模板随机与色谱固定相进行结合-迁移-解结合-再结合-再迁移等印迹作用，综合印迹特征以色谱峰的保留时间对响应值高斯函数曲线指纹图谱表征出来，根据中药印迹模板特征进行印迹模板成分簇的划分，获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积。
其中，中药对人体和对色谱柱作用可通过印迹模板的作用方式连通起来，也就是说，所述中药成分簇对人体经络脏腑印迹作用的印迹模板与对色谱柱印迹作用的印迹模板内部存在关系，具有相同或相似的印迹模板的成分簇具有相同或相似的药效、相同或相似的保留时间、相同或相似的印迹特征，通过对各成分簇构成和含量变化分析来评价和控制其内在质量。
进一步地，色谱峰的保留时间对响应值高斯函数曲线，呈色谱图的凸凹函数状分布，可根据多个样品的色谱峰匹配频数划分出印迹模板成分簇，获得该成分簇的段带色谱峰总面积，具体为：
将同一中药的S个样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp，各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD和匹配数Np，其中匹配数就是“印迹模板”成分群对应一定保留时间共同出现色谱峰的数目，由中药色谱指纹图谱相似度评价系统给出。可先对所纳入的指纹图谱的匹配频数进行统计分析，求算平均匹配频数和标准差，设定置信系数，计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值，排序，取大于该界值的匹配频数的成分峰为共有“印迹模板”数，获得成分簇“印迹模板”总数目。再对两两“印迹模板”间的色谱峰用匹配频数对保留时间的统计分析法确定各“印迹模板”成分簇的界线色谱峰的保留时间，并将同一“印迹模板”成分簇的峰面积加合计算得段带色谱峰总面积。
进一步地，建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系，具体为：
各段带色谱峰与其成分相对应，段带色谱峰总面积与其浓度呈线性关系是指根据式(1)的线性叠加所得式(2)，原色谱峰总面积与浓度呈线性关系，整合后的段带色谱峰总面积也与段带成分总浓度或浸出率呈线性叠加关系，亦为式(1)和式(2)。目前常用的指纹图谱分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、色谱/质联用分析法、毛细管电泳法、薄层色谱法、荧光分析法、标记免疫分析法(酶联免疫方法、放射免疫技术测定法和化学发光酶免疫测定法)等，其检测器输出的响应值与药物质量呈线性，为式(1)：
ci＝Aiki+bi (1)；
若整合成第m成分簇后，其色谱峰峰数目从f到g压缩为1个，则为式(2)：
Figure BDA0003693006950000081
式中，ci、Ai、ki分别为单成分浓度、峰面积和响应系数，bi为仪器测定时单成分的响应常数；Cm、Am、Km分别为按匹配频数法划分出的第m“印迹模板”成分簇的段带总浓度、总峰面积和总响应系数，Bm为仪器测定时成分簇响应常数，整合的峰数目从f到g个；ki、Km因不同的检测器而异。
进一步地，建立段带色谱峰总面积与总浓度、浸出率的谱量学关系是指当整个指纹图谱由n个段带成分簇构成时，各段带色谱峰总面积与总浓度、浸出率呈线性关系，体现线性的叠加性，可得段带色谱峰总面积与总成分浓度关系式为：
Figure BDA0003693006950000091
进一步与浸出率进行关联可得段带色谱峰总面积与总浸出率关系式为：
Figure BDA0003693006950000092
式中，CT、VT、WT分别为总成分簇浓度、提取液体积和药材总重量，成分簇共有n个；P、KmT、BmT分别为总成分簇浸出率、总段带成分簇浸出率的响应系数、仪器测定常数，BT为仪器测定时总成分浓度的响应常数。
进一步地，根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值排序，确定各印迹模板成分簇对浸出率的影响大小；结合仪器响应常数项，根据累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围以及平均值趋势是指各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值按式(5)计算；
Figure BDA0003693006950000093
回归项的贡献率按式(6)确定：
Figure BDA0003693006950000094
式中，Es为成分簇作用量的贡献率，表征各成分簇对总体浸出率的贡献程度，越大，可能产生正作用或负作用越大，成分簇作用的贡献度越大，越需进行质量控制；
Figure BDA0003693006950000101
为段带成分簇的平均总峰面积，/>
Figure BDA0003693006950000102
为实测浸出率的平均值，Ek分别为回归的贡献率，也为成分簇趋于稳定的总浓度、浸出率的平均值趋势，亦理论平均浸出率与实测平均浸出率的比值。按式(5)大小排序，确定各成分簇对浸出率的影响大小；可根据其累积作用量的百分率至90％(中药制剂的有效期按降解到90％所需时间计算，故以90％成分簇所产生影响为质量控制成分簇)来确定质量控制的成分簇种类；并根据回归系数的误差确定各成分簇浓度的变化范围；根据回归项的贡献程度作为浸出率的平均值贡献趋势，从而建立完整的中药谱量学理论和实验体系，以实现精确控制中药质量的目的。
进一步地，根据以上所述的一种基于中药印迹模板成分簇的指纹图谱谱量学的分析方法，获得以下产品，所述产品包括中药产品、以及体现在中药成分簇印迹模板印迹性分析学上的形式，具体为色谱分析系统、计算软件、色谱柱、试剂和用于印迹模板印迹性分析的对照品；其中，中药产品标明了指纹图谱色谱峰谱量学等技术的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子印迹模板色谱峰印迹技术标明包括客体成分色谱峰峰面积在内的各参数。
接下来，通过具体的实施例进行描述，以对本发明的技术方案进行更进一步地理解。
1、材料与方法
1.1仪器：超高效液相色谱仪(美国Waters公司，型号：ACQUITY UPLC H-Class)；真空冷冻干燥机(美国GOLD-SIM公司，型号：FD5-3)；真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DZF-6050)；低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司，型号：TDZ4-WS)；电子天平(上海良平仪器仪表有限公司，型号：MA110)；循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司，型号：SHZ-D(III))；超声波清洗器(上海科寻超声仪器有限公司，型号：SK3300H)；超纯水机(长沙市科临电子科技有限公司，型号：EKup-II-20T)。
1.2试剂与试药：乙腈(批号：20075279)、甲醇(批号：20075141)均为色谱纯，均购于美国天地试剂公司；甲酸(上海麦克林生化科技有限公司，批号：20181201)、甲醇(太仓沪试试剂有限公司，批号：20200105)均为分析纯；磷酸为分析纯(重庆川东化工有限公司，批号：20190629)；水为怡宝纯净水(华润怡宝饮料有限公司，批号：14310Z10J)；0.22μm微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司，批号：160531014)；阿魏酸、王百合苷A(上海源叶生物科技有限公司，批号：B20007、B25344)龙牙百合为湖南省邵阳市隆回县百合加工厂提供，由湖南中医药大学药学院石继连教授按《中华人民共和国药典》有关项下进行鉴定，其中S5、S8、S16、S19批次龙牙百合浸膏不符合2020版《中国药典》标准，其余均符合标准。
1.3方法：39批次干燥龙牙百合按2020版《中国药典》中采用冷浸法测定浸膏，并采用高效液相获得39批次百合UPLC指纹图谱。
1.3.1供试品制备：参考相关文献进行百合供试品溶液制备：百合粉碎后过4号筛，取粉末0.5g，置于50mL锥形瓶中，精密称定，加入50％甲醇20mL，称重，记录重量，室温下静置1h，超声提取40min，50％甲醇补足失重，放入12000r/min离心机离心10min，去上清液过0.22μm微孔滤膜，置于进样小瓶中，待测。
1.3.2对照品溶液制备：分别精密称定王百合苷A1.00mg，定容到10ml容量瓶，分别吸取一定量配制浓度为80、40、20、10μg/ml标准溶液，过0.22μm微孔滤膜后备用；精密称定阿魏酸5.00mg定容到10ml容量瓶，分别吸取一定量配制浓度为150、75、40、10、1μg·ml-1的标准溶液，过0.22μm滤膜后备用。
1.3.3色谱条件：色谱柱为Waters AcquityUPLC BEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相:乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱:0～2min，3％A；2～6min，3％～10％A；6～9min，10％～15％A；9～12min，15％A；12～16min，15％～25％A；16～18min，25％～30％A；18～22min，30％～40％A；22～25min，40％～80％A；25～27min，80％～95％A；27～30min，95％A；30～36min，3％A；柱温35℃；流速0.4mL·min-1；进样量3μL。
2、结果
2.1方法学考察
2.1.1线性关系考察：王百合苷A和阿魏酸对照品溶液按1.3.3的色谱条件测定样品。以对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，相应峰面积为纵坐标，得到各指标成分的线性回归方程和线性范围。其中，王百合苷A和阿魏酸回归方程分别为y＝63247x-17113，r＝0.9982；y＝42957x-25800，r＝0.9995，表明王百合苷A、阿魏酸分别在10-100、10-150μg·mL-1与峰面积呈良好线性关系。
2.1.2精密度实验：精密取百合粉末样品0.5g，按照1.3.1制备供试品，在1.3.3的色谱条件下连续进样6次，以王百合苷A为参照峰，计算得到相对保留时间RSD均小于1％，测得峰面积RSD均小于3％，表明仪器的精密度良好。
2.1.3重复性实验：精密取鲜百合粉末6份，每份精密称取0.5g，按照1.3.1制备供试品，按1.3.3的色谱条件进样，以对照品王百合苷A为参照峰，计算得到相对峰保留时间均小于1％，峰面积的RSD值均小于5％，表明实验重复性良好。
2.1.4稳定性实验：精密称取百合粉末0.5g，按照1.3.1制备供试品，按照1.3.3的色谱条件在0、2、4、6、8、12、24h进样，以王百合苷A为对照峰，计算相对保留时间RSD值均小于1％，相对峰的RSD值均小于3％，表明供试品24h内稳定性良好。
2.1.5加样回收实验：平行精密称取已知含量(0.4097mg·g-1)的百合粉末9份，精密称定，按照已知量的50％、100％、150％水平精密加入王百合苷A对照品，按照1.3.1制备供试品溶液，每个质量浓度制成三份，按照1.3.3色谱条件进样计算得到王百合苷A的平均回收率为100.51％，RSD值为2.60％，结果表明该方法准确性良好，见表1。
表1王百合苷A加样回收率结果
Figure BDA0003693006950000131
2.2不同批次龙牙百合UPLC指纹图谱的建立：取39批龙牙百合样品，按1.3.1的方法制备龙牙百合供试品溶液，进样得到指纹图谱，如S1；按1.3.2的方法制备混标溶液，标注为S2；按1.3.3的色谱条件测定UPLC图谱，并采用国家药典委员会2012版《中药指纹图谱相似度评价系统130-723》软件进行图谱处理，结果见图1。
2.3龙牙百合指纹图谱“印迹模板”成分簇的划分：将39批次龙牙百合指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统经校正、匹配后导出数据获得不同保留时间的匹配频数，见图2，其中高匹配频数的成分主要集中在7.29-19.03min，说明共有成分主要集中在这个保留时间段内。按式(1)计算出39批次龙牙百合成分簇划成“印迹模板”中心成分的最少匹配频数为40.93个，所以取大于最大匹配数39的匹配频数色谱峰为“印迹模板”成分簇中心成分，共确定了12个“印迹模板”成分簇；再根据式(2)划分出每个“印迹模板”成分簇间的界线，再根据段带统计矩法计算出新保留时间和新峰面积，其划分后生成新的指纹图谱的保留时间和峰面积，见表2。
表2 39批次龙牙百合“印迹模板”划分的成分簇及浸膏得率
Figure BDA0003693006950000141
2.4谱量学方程的建立及验证
2.4.1谱量学方程的建立：所有数据采用Excel收集，将数据导入SPSS软件，以浸膏得率(PT)作为应变量，12个“印迹模板”成分簇零阶矩参数作为自变量，进行线性回归，建立龙牙百合谱量学方程：
PT＝0.244-1.10×10-3A1+3.88×10-4A2+1.75×10-3A3+3.91×10-5A4-1.23×10- 4A5-4.65×10-3A6-1.88×10-4A7-1.61×10-4A8+2.18×10-7A9-2.25×10-5A10+7.75×10-4A11+1.01×10-4A12(R＝0.959,P＜0.001)
中药化学成分受到遗传、产地、加工炮制等因素的影响，种类和含量动态变化。但中药材化学成分呈现“印迹模板”稳定和随株随域随法变化的规律，可基于“印迹模板”成分簇构建的谱量学模型进行成分的印迹性分析。回归系数反映一个变量对因变量的响应值，回归系数越大，代表着这个变量内的值变化更能容易被检测到，说明这个“印迹模板”成分簇的成分种类或者含量较高，而回归系数误差可表征出“印迹模板”成分簇中化学成分的变异程度。而当回归系数乘以成分含量就能体现该成分簇的作用量大小，因此回归系数与峰面积(即总量零阶矩)的乘积可表示该“印迹模板”成分簇对浸膏体系印迹量的占比，可表征出成分簇的印迹作用大小。而回归系数的正负号代表这个“印迹模板”成分簇对总化学成分作用方向，表征对浸膏率是起增加还是减少作用，而作用量的标准差可以表征成分簇的变异大小，也就是变化上下限。
对12个“印迹模板”成分簇的回归系数、回归系数与总量零阶矩乘积和回归系数的正负进行排序，见表3。由表可知，“印迹模板”成分簇12中的成分种类或者含量变化最大，“印迹模板”成分簇8变化最小；“印迹模板”成分簇1在龙牙百合多成分体系总体化学作用最大，“印迹模板”成分簇9作用最小；在龙牙百合化学多成分体系中，“印迹模板”成分簇2、3、4、9、11、12可能是促浸出物生成的“印迹模板”成分簇，而1、5、6、7、8、10是促浸出物分解的“印迹模板”成分簇，两者相互作用，达到平衡时理论的平均浸出率为24.08％，而实验测定平均浸出率为24.28％，回归率为99.19％，预测结果在10％质量控制范围内。
表3 12个“印迹模板”成分簇的回归系数、作用量排序及方差、贡献率与回归率
Figure BDA0003693006950000161
2.4.2实验验证：王百合苷A和阿魏酸在多批次百合药材中都存在，王百合苷A按保留时间划分归属于“印迹模板”成分簇3，阿魏酸则归属于“印迹模板”成分簇7，对二者进行含量测定及结果验证。39批次龙牙百合中王百合苷A的含量在0.277-1.805mg/g范围之内，RSD值为44.23％，说明“印迹模板”成分簇3中成分含量变化较大；阿魏酸含量在0.094-0.324mg/g之间，RSD值为30.93％，较之王百合苷A变化较少；结果表明“印迹模板”成分簇3中成分含量比“印迹模板”成分簇7大，变化趋势初步验证上述结果。
另取上述龙牙百合样品(n＝3)，按2.3.1制备处理得供试液，进样后获得的指纹图谱划分“印迹模板”成分簇，所得各段总量零阶矩代入谱量学方程，回归方程得PT分别为22.74％、22.78％、31.84％，而实测值分别为18.17％、21.25％、33.67％，其相关系数为0.983，平均偏差为6.497％，在质量控制10％以内，验证结果说明建立的谱量学能较好的预测不同批次龙牙百合的总浸出物的含量。
以上实例已从某些角度证明本发明具有对色谱峰的压缩性和对原指纹图谱特征参数及样本间变异性的保持性，显而易见，通过本发明的不同组合和可视化软件表征，可从全方位实现整合成“印迹模板”成分簇来表征新型指纹图谱和物质基础单元，降低中医药现代化研究的难度。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
中药成分簇进入人体后，与人体经络脏腑按照超分子印迹模板产生气析作用而产生药性与药效；进行色谱分析时，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，获取指纹图谱并划分出印迹模板成分簇；其中，所述指纹图谱由多个段带成分簇构成；
获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积，并建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系；其中，建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系，具体为：
段带色谱峰总面积与总成分浓度关系式为：
Figure FDA0004277793440000011
段带色谱峰总面积与总浸出率关系式为：
Figure FDA0004277793440000012
式中，CT、VT、WT分别为总成分簇浓度、提取液体积和药材总重量，成分簇共有n个；P、KmT、BmT分别为总成分簇浸出率、总段带成分簇浸出率的响应系数、仪器测定常数，BT为仪器测定时总成分浓度的响应常数；Am、Km分别为按匹配频数法划分出的第m“印迹模板”成分簇的总峰面积和总响应系数，Bm为仪器测定时成分簇响应常数；
根据各段带色谱峰总面积与回归系数乘积的绝对值AmKmT排序，确定各“印迹模板”成分簇对浸出率的贡献大小
Figure FDA0004277793440000013
结合仪器响应常数项，以累积百分率确定质量控制的印迹模板成分簇种类和范围以及平均浓度、浸出率的趋势；其中，各段带成分簇的累积贡献率通过式(5)确定，回归贡献率通过式(6)确定；
Figure FDA0004277793440000021
Figure FDA0004277793440000022
式中，Es、Ek分别为成分簇累积贡献率与回归项的贡献率，
Figure FDA0004277793440000023
为段带成分簇的平均总峰面积，/>
Figure FDA0004277793440000024
为实测浸出率的平均值。
2.根据权利要求1所述的一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，其特征在于，所述产生药性与药效，具体为：
中药来源动植物体且为生物巨复超分子体，其中，所述中药的客体为中药成分簇，主体为包括原药材的细胞组织物、酶、DNA、RNA、基因在内的合成中药成分的大分子；
所述中药成分簇与人体经络脏腑按照印迹模板产生印迹作用，呈现印迹行为而产生药性与药效，并反映到中药成分簇与色谱柱按照印迹模板印迹作用的指纹图谱色谱峰的特征变化上，建立以中药印迹模板印迹作用划分成分簇的色谱学方法。
3.根据权利要求1所述的一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，其特征在于，中药成分簇与色谱柱按照印迹模板产生印迹作用，具体为：
所述中药成分簇与色谱柱进行印迹作用，具体表现为某个分子的某一个基团印迹模板随机与色谱固定相进行结合-迁移-解结合-再结合-再迁移的印迹作用，综合印迹特征以色谱峰的保留时间对响应值高斯函数曲线指纹图谱表征出来，根据中药印迹模板特征进行印迹模板成分簇的划分，获得所述印迹模板成分簇的段带色谱峰总面积。
4.根据权利要求1所述的一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，其特征在于，所述中药成分簇对人体经络脏腑印迹作用的印迹模板与对色谱柱印迹作用的印迹模板内部存在关系，具有相同或相似的印迹模板的成分簇具有相同或相似的药效、相同或相似的保留时间、相同或相似的印迹特征，通过对各成分簇构成和含量变化分析来评价和控制其内在质量。
5.根据权利要求1所述的一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，其特征在于，建立段带色谱峰总面积与总成分浓度或浸出率的谱量学关系，具体为：
各段带色谱峰与其成分相对应，原色谱峰总面积与浓度呈线性关系，整合后的段带色谱峰总面积也与段带成分总浓度或浸出率呈线性叠加关系，获得公式(1)和公式(2)：
ci＝Aiki+bi(1)；
Figure FDA0004277793440000031
式中，ci、Ai、ki分别为单成分浓度、峰面积和响应系数，bi为仪器测定时单成分的响应常数；Cm、Am、Km分别为按匹配频数法划分出的第m“印迹模板”成分簇的段带总浓度、总峰面积和总响应系数，Bm为仪器测定时成分簇响应常数，整合的峰数目从f到g个；ki、Km因不同的检测器而异。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法，获得以下产品，其特征在于：
所述产品包括中药产品、以及体现在中药成分簇印迹模板印迹性分析学上的形式，具体为色谱分析系统、计算软件、色谱柱、试剂和用于印迹模板印迹性分析的对照品；
其中，中药产品标明了包括指纹图谱色谱峰谱量学在内的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子印迹模板色谱峰印迹技术标明包括客体成分色谱峰峰面积在内的各参数。
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