CN107402266A - 一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药材指纹图谱领域，具体涉及一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，及其该方法在鉴别冬虫夏草中药材中的应用。该方法是将样品进行前处理后按如下色谱条件利用液质联用LC‑Q‑TOF‑MS技术进行测定：所述的色谱条件为：色谱柱：Welch Xtimate C4；填充剂：四烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为0.1％甲酸‑水，B为0.1％甲酸‑乙腈；梯度洗脱。本发明的结果表明与现有技术相比具有以下优点和积极的效果：首次采用LC‑Q‑TOF‑MS技术建立了冬虫夏草蛋白质指纹图谱，同时确定了样品蛋白提取条件和分析条件的最优参数，灵敏度高，分离效果好，提高了结果的准确性和可靠性。最后将蛋白指纹图谱应用于冬虫夏草真伪鉴别中，可为冬虫夏草的质量控制提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及中药材指纹图谱领域，具体涉及一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，以及该方法在鉴别冬虫夏草中药材中的应用。
背景技术
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。性味甘，平，归肺、肾经，具有补肾益肺，止血化痰疗效，用于治疗肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血等。现代研究表明冬虫夏草含有核苷、蛋白质、多糖、甾醇等活性物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗衰老等活性。
冬虫夏草是一味珍稀中药材，近年来市场需求逐渐增大，而资源却十分匮乏，导致价格高昂，使得市场上掺杂品、混淆品、伪品增多。于是解决冬虫夏草真伪鉴别问题便成为一个急迫的问题，目前虽有王君等报道的《HPLC指纹图谱在鉴别冬虫夏草上的应用》对冬虫夏草、蛹虫草和假虫草进行了鉴别，以及张薇薇等报道的《人工虫草与冬虫夏草HPLC特征图谱研究》对冬虫夏草、人工北虫草、发酵虫草菌粉等进行了鉴别，而蛋白质作为冬虫夏草的一种活性成分，将其蛋白质指纹图谱用于冬虫夏草真伪鉴别却是一片空白。
本发明突破了常规的限制，利用蛋白质大分子的蛋白质指纹图谱代替传统的小分子的指纹图谱对冬虫夏草进行真伪鉴别。现有的蛋白质指纹图谱技术多采用凝胶电泳技术，如双向电泳(如钱正明等人的《冬虫夏草蛋白图谱及干燥条件对超氧化物歧化酶活性影响》)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如朱雪飞等人的《五种不同苜蓿的种子蛋白指纹图谱研究》)和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)技术(如郎明林等人的《中国北方麦冬区主栽品种醇溶蛋白指纹图谱数据库的建立》)，其存在的缺点是：所用试剂多为有毒试剂、样品准备与制胶过程繁琐、耗时，凝胶图谱重复性差、专属性差。另外，药典中关于阿胶的鉴定使用到高效液相色谱-质谱法(2015版《中国药典》189页)，但其前处理麻烦，需要用酶解12h，而本发明无需酶处理，更加简便。目前，MALDI-TOF-MS成为蛋白质指纹图谱分析的热点技术，其灵敏度高、精确、重现性好，但是仪器价格昂贵，样品前处理耗时，目前多用于研究病原微生物、动物和人体的蛋白质指纹图谱和蛋白质组学，鲜有用于研究中药材的蛋白质指纹图谱。
发明内容
本发明所提供的LC-Q-TOF-MS技术具有快捷、简便、易行，样品用量小和高通量分析等特点，且样品前处理简单，可最大程度的保护样品的蛋白成分。同时所建立的方法可用于鉴别冬虫夏草中药材的真伪，为临床用药的安全、有效提供准确的参考依据。
本发明的目的是建立一种冬虫夏草蛋白质指纹图谱的方法及其该方法在鉴别冬虫夏草真伪中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明公开了一种冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备冬虫夏草供试品溶液；
(2)使用LC-Q-TOF-MS技术测定供试品溶液得到蛋白质指纹图谱，其中，
高效液相色谱条件：所用的色谱柱为反相色谱柱，所述的反相色谱柱的填充剂为烷基键合硅胶；流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-乙腈；
梯度洗脱条件：
0min→10min：18％B→21％B；
10min→40min：21％B→30％B；
40min→50min：30％B→31.5％B；
50min→70min：31.5％B→33％B；
70min→100min：33％B→38.5％B；
100min→130min：38.5％B→49％B；
130min→135min：49％B→90％B；
135min→150min：90％B→90％B；
150min→155min：90％B→18％B。
优选地，本发明所使用的反相色谱柱规格为4.6mm×250mm，3μm，检测波长：200-280nm；流速：0.4-0.6mL/min；柱温：25-30℃；所述反相色谱柱的填充剂为四烷基硅烷键合硅胶。
优选地，本发明所使用的质谱条件为：离子源：Dual AJS-ESI；离子化模式：正离子；扫描模式：全扫；质荷比范围：100-3000m/z；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：4000V；碰撞电压：200V；锥孔电压：65V；八级杆电压：750V；喷嘴电压：1000V。
进一步的，本发明的冬虫夏草供试品溶液制备方法如下：
a、称取冬虫夏草样品，加入超纯水，匀浆，匀浆温度控制为5-10℃；
b、将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，温度控制为15-20℃，然后将超声提取后的样品放入-20-4℃冰箱中冷冻；
c、将冷冻后的样品取出，解冻后再次匀浆，超声提取，离心，离心温度控制为4-10℃，得上清液，冻干；
d、往冻干样品中加入超纯水，复溶，之后加入无水乙醇，搅拌均匀后放置4-10℃下静置过夜；随后离心，离心温度控制为4-10℃，收集絮状沉淀，并往沉淀中加入超纯水使之复溶；最后使用水系滤膜过滤，即得供试品样品。
更进一步的，本发明所使用检测波长为：214nm；流速：0.6mL/min；柱温：30℃。
更进一步的，本发明在所述步骤(a)加入样品与超纯水的重量体积比为1:7～10g/mL。
更进一步的，本发明在所述步骤(a)、(c)中的匀浆条件为匀浆时间5～10min，匀浆转速为3000～4000rpm，温度控制为5-10℃。
更进一步的，本发明在所述步骤(b)、(c)中的的超声提取条件为超声提取时间30-40min，超声功率为400-600W，温度控制为15-20℃。
更进一步的，本发明在所述步骤(d)中的冻干品与加入超纯水的的重量体积为1:10-15g/mL；所述样品复溶后与加入无水乙醇的体积比为1:4-8；往沉淀中加入超纯水的重量体积比为1:10-15g/mL；使用的水系滤膜孔径为0.22μm。
更进一步优选地，本发明在所述步骤(d)中醇沉后往沉淀中加入超纯水的重量体积比为1:12.5g/mL。
在一些实施例中，本发明所提供的方法可应用于虫草类中药材真伪的鉴别。
优选地，本发明可应用于冬虫夏草、冬虫夏草伪品和发酵虫草样品的鉴别。
与现有技术相比，本发明具有的积极效果在于：
①本发明首次采用LC-Q-TOF-MS技术建立冬虫夏草的蛋白质指纹图谱，该方法具有快捷、简便、易行、专属性好、重复性强的优点。
②本发明所提供的供试品样品处理方法温和，可最大限度保护样品的蛋白成分。
③本发明所提供的色谱条件如所使用的色谱柱实现了对大分子蛋白质的检测和分离，突破了传统蛋白质难检测、分离的难题；确定了样品分析条件的最优参数，灵敏度高，分离效果好，提高了结果的准确性和可靠性，可为冬虫夏草的质量控制提供参考。
④本发明首次利用冬虫夏草的蛋白质指纹图谱，并将其与相似度评价系统相结合，可以直观地区别冬虫夏草、冬虫夏草伪品和发酵虫草产品，为冬虫夏草与其他虫草类样品的鉴别提供了简便、有效的方法。
附图说明
图1为12批(S1-S12)冬虫夏草匹配后的蛋白质指纹图谱。
图2为12批(S1-S12)冬虫夏草生成的共有模式蛋白质指纹图谱。
图3为13批(S13-S25)冬虫夏草伪品及发酵虫草产品的蛋白质指纹图谱。(S13-S15为蝉花，S16-S18为蛹虫草，S19-S20为凉山虫草，S21-S22为亚香棒虫草，S23为蝙蝠蛾被毛孢菌丝体，S24为百令胶囊，S25为中华被毛孢菌丝体)
具体实施方式
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改和改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利所限定的范围。
药材、仪器与试剂：
1.1药材
S1-S12为冬虫夏草：均来源于宜昌山城水都冬虫夏草有限公司。
S13-S15为蝉花：S13来源于浙江，S14-S15来源于江西。
S16-S18为蛹虫草：S16来源于浙江宝芝林中药科技有限公司，S17来源于广东逢春制药有限公司，S18来源于长生源滋补养生堂。
S19-S20为凉山虫草：均来源于四川。
S21-S22为亚香棒虫草：均来源于江苏。
S23为蝙蝠蛾被毛孢菌粉：来源于杭州众芝康菇生物技术有限公司。
S24为百令胶囊：来源于杭州中美华东制药有限公司。
S25为中华被毛孢菌丝体：来源于杭州众芝康菇生物技术有限公司。
1.2仪器
超纯水机(德国Millipore公司)；超声仪(宁波新芝有限公司)；匀浆机(德国IKA公司)；万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；涡旋振荡仪(Scientific Industries公司)；冷冻离心机(Thermo fisher Scientific科技公司)；安捷伦液质联用色谱仪(Agilent公司)；冻干机(Telstar公司)；高效液相色谱色谱柱Welch Xtimate C4(4.6×250mm，3μm)(月旭科技股份有限公司)；数显恒温流浴振荡器(常州国立试验设备研究院)；酶标仪(美国分子仪器公司)。
1.3试剂
无水乙醇(分析纯，成都科龙试剂有限公司)；色谱乙腈(色谱纯，Merck公司)；色谱甲酸(色谱纯，阿拉丁上海有限公司)；BCA试剂盒(Thermo fisher Scientific科技公司)。
实施例一 供试品样品的制备方法
(1)供试品溶液制备方法1
称取冬虫夏草样品1.00g，按重量体积比加入7mL超纯水，匀浆，匀浆转速为3000rpm，匀浆时间为10min，温度控制为5℃。将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，提取时间为40min，超声功率为400W，温度控制为15℃，之后将样品放置在-20℃冰箱中冷冻。随后将样品取出，解冻，重复匀浆和超声提取步骤。将超声提取后样品进行离心，离心温度控制为4℃，得上清液，冻干。往冻干后的样品中加入1.1mL超纯水复溶，之后加入8.8mL无水乙醇，在4-10℃下静置过夜。离心，离心温度控制为4℃，倾去上清液，收集固体沉淀。待沉淀中的溶剂挥干，加入3mL超纯水复溶，之后用孔径为0.22μm水系滤膜过滤，即得供试品溶液。
(2)供试品溶液制备方法2
称取冬虫夏草样品1.00g，按重量体积比加入8mL超纯水，匀浆，匀浆转速为3500rpm，匀浆时间为7min，温度控制为7℃。将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，提取时间为35min，超声功率为500W，温度控制为17℃，之后将样品放置在-8℃冰箱中冷冻。随后将样品取出，解冻，重复匀浆和超声提取步骤。将超声提取后样品进行离心，离心温度控制为7℃，得上清液，冻干。往冻干后的样品中加入0.9mL超纯水复溶，之后加入5.4mL无水乙醇，在4-10℃下静置过夜。离心，离心温度控制为7℃，倾去上清液，收集固体沉淀。待沉淀中的溶剂挥干，加入3mL超纯水复溶，之后用孔径为0.22μm水系滤膜过滤，即得供试品溶液。
(3)供试品溶液制备方法3
称取冬虫夏草样品1.00g，按体积重量比加入10mL超纯水，匀浆，匀浆转速为4000rpm，匀浆时间为5min，温度控制为10℃。将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，提取时间为30min，超声功率为600W，温度控制为20℃，之后将样品放置在4℃冰箱中冷冻。随后将样品取出，解冻，重复匀浆和超声提取步骤。将超声提取后样品进行离心，离心温度控制为10℃，得上清液，冻干。往冻干后的样品中加入1mL超纯水复溶，之后加入4mL无水乙醇，在4-10℃下静置过夜。离心，离心温度控制为10℃，倾去上清液，收集固体沉淀。待沉淀中的溶剂挥干，加入3mL超纯水复溶，之后用孔径为0.22μm水系滤膜过滤，即得供试品溶液。
(4)测蛋白含量
按照体积比25:24:1分别移取BCA试剂盒A液，B液，C液各2mL，1.92mL，0.08mL，混合，振荡均匀，得BCA反应液。
配制2.0mg/mL牛血清蛋白对照品溶液，移取20μL逐级稀释浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03mg/mL的对照品溶液，移取对照品稀释液10μL至96孔酶标板中(平行2孔)，加入BCA反应液200μL，置于振荡器37℃下孵育30min，取出，在562nm下测定其吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得标准曲线，拟合回归方程。
移取醇沉样品复溶溶液0.1mL，稀释10倍，测定其吸光值，代入拟合的回归方程，计算得醇沉样品的蛋白浓度。3种制备方法所得样品的蛋白质的百分含量分别为2.82％、2.67％、2.69％。
实施例二 冬虫夏草蛋白质指纹图谱的建立方法
(1)供试品溶液的制备方法
按照实施例一中制备方法3制备12批(S1-S12)供试品溶液样品。
(2)色谱分析条件：高效液相色谱色谱柱Welch Xtimate C4(4.6×250mm，3μm)，色谱柱的填充剂为四烷基硅烷键合硅胶，采用梯度洗脱，流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液，流速为0.6mL/min，紫外检测波长为214nm，柱温为30℃，进样量为20μL。
梯度洗脱条件为：
0min→10min：18％B→21％B；
10min→40min：21％B→30％B；
40min→50min：30％B→31.5％B；
50min→70min：31.5％B→33％B；
70min→100min：33％B→38.5％B；
100min→130min：38.5％B→49％B；
130min→135min：49％B→90％B；
135min→150min：90％B→90％B；
150min→155min：90％B→18％B；
(3)质谱分析条件：离子源：Dual AJS-ESI；离子化模式：正离子；扫描模式：全扫；质荷比范围：100-3000m/z。干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：4000V；碰撞电压：200V；锥孔电压：65V；八级杆电压：750V；喷嘴电压：1000V。
(4)测定：吸取供试品溶液20μL注入仪器，按照以上方法进行测定，得蛋白质指纹图谱。
(5)结果：如图1所示为12批(S1-S12)冬虫夏草的蛋白质指纹图谱。通过12批冬虫夏草蛋白质指纹图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰，将结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典委员会2004A版)”，确定了11个共有峰，采用中位数法自动匹配自动生成冬虫夏草共有模式蛋白指纹图谱R，蛋白质指纹图谱R中11个共有峰的保留时间分别为：14.74，17.86，20.88，31.68，33.64，50.99，53.56，80.20，88.64，98.52，110.21min。计算各药材与对照蛋白质指纹图谱的相似度，表1所示为12批(S1-S12)冬虫夏草的相似度，图2为12批冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的共有模式。
本实验选择了各批次稳定出现的11个峰为共有峰，经过相似度评价系统软件计算以后，该12批次冬虫夏草药材与所建立共有模式蛋白指纹图谱相似度除S1，S2(相似度为0.89)外，均在0.90以上，保留时间基本一致，峰面积由于质谱的离子化效率而略有差异。可见，由表1可知12批冬虫夏草蛋白质指纹图谱基本一致。
实施例三 蛋白质指纹图谱在鉴别虫草类中药材中的应用
(1)供试品溶液的制备：按照实施例一中制备方法3制备S11-S25 13批供试品溶液。
(2)色谱分析条件：与实施例二相同。
(3)质谱分析条件：与实施例二相同。
(4)测定：吸取供试品溶液20μL注入仪器，按照以上方法进行测定，得蛋白质指纹图谱。
(5)结果：如图3所述，为13批(S13-S25)冬虫夏草伪品及虫草发酵产品的蛋白质指纹图谱。按照相同的方法，对13批冬虫夏草伪品及发酵产品蛋白指纹图谱进行相似度评价，将结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典委员会2004A版)”。采用中位数法自动匹配自动生成冬虫夏草共有模式蛋白指纹图谱R，得各药材与对照蛋白指纹图谱的相似度。如表2所示为S13-S25批冬虫夏草的相似度。由表2可知13批冬虫夏草相似度相差很大，即蛋白质指纹图谱相差很大。
本实验选择了各批次稳定出现的11个峰为共有峰，经过相似度评价系统软件计算以后，13批次冬虫夏草伪品及虫草发酵产品与所建立的冬虫夏草共有模式的蛋白指纹图谱相似度均在0.20以下，说明通过该方法建立的冬虫夏草指纹图谱可以有效地对冬虫夏草与冬虫夏草伪品进行鉴别。
表1 12批冬虫夏草药材蛋白质指纹图谱的相似度
表2 13批冬虫夏草伪品及虫草发酵产品蛋白指纹图谱的相似度
Claims (8)
1.一种冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备冬虫夏草供试品溶液；
(2)使用LC-Q-TOF-MS技术测定供试品溶液得到蛋白质指纹图谱，其中，
高效液相色谱条件：所用的色谱柱为反相色谱柱，所述的反相色谱柱的填充剂为烷基键合硅胶；流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-乙腈；
梯度洗脱条件：
0min→10min：18％B→21％B；
10min→40min：21％B→30％B；
40min→50min：30％B→31.5％B；
50min→70min：31.5％B→33％B；
70min→100min：33％B→38.5％B；
100min→130min：38.5％B→49％B；
130min→135min：49％B→90％B；
135min→150min：90％B→90％B；
150min→155min：90％B→18％B。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相色谱柱规格为4.6mm×250mm，3μm，检测波长：200-280nm；流速：0.4-0.6mL/min；柱温：25-30℃；所述反相色谱柱的填充剂为四烷基硅烷键合硅胶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件：离子源：Dual AJS-ESI；离子化模式：正离子；扫描模式：全扫；质荷比范围：100-3000m/z；干燥气温度：300℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：4000V；碰撞电压：200V；锥孔电压：65V；八级杆电压：750V；喷嘴电压：1000V。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中冬虫夏草供试品溶液制备方法包括如下步骤：
a、称取冬虫夏草样品，加入超纯水，匀浆，匀浆温度控制为5-10℃；
b、将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，温度控制为15-20℃，然后将超声提取后的样品放入-20-4℃冰箱中冷冻；
c、将冷冻后的样品取出，解冻后再次匀浆，超声提取，离心，离心温度控制为4-10℃，得上清液，冻干；
d、往冻干样品中加入超纯水，复溶，之后加入无水乙醇，搅拌均匀后放置4-10℃下静置过夜；随后离心，离心温度控制为4-10℃，收集絮状沉淀，并往沉淀中加入超纯水使之复溶；最后使用水系滤膜过滤，即得供试品样品。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)加入样品与超纯水的重量体积比为1:7～10g/mL。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)冻干品与加入超纯水的的重量体积为1:10-15g/mL；所述样品复溶后与加入无水乙醇的体积比为1:4-8；往沉淀中加入超纯水的重量体积比为1:10-15g/mL；使用的水系滤膜孔径为0.22μm。
7.权利要求1-8任一项所述的冬虫夏草蛋白质指纹图谱的建立方法在虫草类中药材鉴别中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述虫草类中药材为冬虫夏草、冬虫夏草伪品和发酵虫草样品。
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| CN201710560176.6A CN107402266B (zh) | 2017-07-11 | 2017-07-11 | 一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法及应用 |
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