CN104007215B

CN104007215B - 中药罗仙子指纹图谱的构建方法

Info

Publication number: CN104007215B
Application number: CN201410190089.2A
Authority: CN
Inventors: 朱家勇; 褚夫江; 金小宝; 李小波; 梅寒芳; 吴玉萍
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: CN104007215A

Abstract

本发明属于中药材分析技术领域，具体公开一种中药罗仙子指纹图谱的构建方法，包括罗仙子药材的水解、衍生化、高效液相色谱条件的选择及测定，成功构建了中药罗仙子指纹图谱，确定了保留时间0~35min共有24个共有特征峰，适用于日后对中药罗仙子药材真伪和品质的进一步鉴别和分类。此外，本发明公开的中药罗仙子指纹图谱的构建方法步骤简单，成本低廉，稳定性和重现性良好，操作性强，精密度高。

Description

中药罗仙子指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于中药材分析技术领域，具体涉及中药罗仙子指纹图谱的构建方法。

背景技术

中药罗仙子（Musca domestica），俗称蛆，又名五谷虫、谷虫、水仙子等，广东习称为罗仙子。载于《本草纲目》虫部第四十卷，该虫性寒、无毒，入脾、胃经，能治疗臁疮、唇疔和痈疽等感染性外科疾病。近年来研究发现，罗仙子中富含凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等活性。

中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一，已经成为公认的评价中药质量和鉴别中药品种的有效手段之一，属于国内外广泛接受的中药质量评价模式。现阶段，指纹谱图的研究和应用已逐渐拓展至生物、食品、化工等领域，成为控制产品质量的有效工具。迄今为止尙未有关于中药罗仙子的指纹图谱报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种中药罗仙子指纹图谱的构建方法，本发明选取了十个不同生产批次的罗仙子抗动脉粥样硬化活性部位提取物样品，利用2，4-二硝基氟苯为柱前衍生剂，建立了罗仙子抗动脉粥样硬化有效部位水解氨基酸的高效液相指纹图谱。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种中药罗仙子指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

S1. 罗仙子有效部位提取物的制备：新鲜罗仙子匀浆、过滤、超声粉碎、过滤取滤液、加热、冷却、离心取上清液、超滤、冻干制得罗仙子有效部位提取物；

S2. 供试品溶液的制备：将罗仙子有效部位提取物与盐酸混合水解，过滤取滤液，滤液干燥后的残渣再用50%乙醇溶解得供试品前处理液；供试品前处理液加入二硝基氟苯DNFB衍生化制得供试品溶液；

S3. 高效液相色谱分析：色谱分离柱为Welch Ultimate XB-C8柱，250 mm×4.6 mm，5μm；流动相为乙腈、水、0.05mol/L乙酸钠缓冲液；流速：1.0ml/min；检测波长：360nm；柱温：44℃；进样量：10 μL；采用梯度洗脱的方式，洗脱程序如下：

时间0min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水；

时间13min 38%乙酸钠缓冲液、31%乙腈、31%水；

时间21min 32%乙酸钠缓冲液、34%乙腈、34%水；

时间23min 50%乙腈、50%水；

时间25min 50%乙腈、50%水；

时间26min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水；

时间35min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水。

优选地，步骤S3中所述0.05mol/L乙酸钠缓冲液中还含有10ml/L N,N-二甲基甲酰胺，有利于检测样品中不同有效成分的洗脱分离。

本发明所述罗仙子有效部位提取物的水解采用常规技术，加入盐酸混合水解即可，作为一种实施方案，水解的具体步骤为将罗仙子有效部位提取物与6mol/L盐酸混合在100~120℃条件下水解20~30h。

优选地，步骤S2中所述罗仙子有效部位提取物与盐酸混合的质量体积比为1mg：0.8~1.2mL，更有利于促进罗仙子的水解。

优选地，步骤S2中所述50%乙醇的用量为滤液体积的0.3~0.8，利于后续衍生化处理。

本发明所述供试品前处理液加入二硝基氟苯DNFB衍生化实质是采用DNFB将供试品前处理液中的氨基酸衍生化，便于后续高效液相色谱检测，作为一种实施方案，所述衍生化的具体步骤为：先配制浓度为35~45 mg/mL的碳酸氢钠溶液及浓度为9~11mL/L的DNFB乙腈溶液，将供试品前处理液与碳酸氢钠溶液、DNFB乙腈溶液按体积比1：0.8~1.2：0.8~1.2混合，避光衍生化反应，冷却后加入6~8倍供试品前处理液体积的0.01mol/L磷酸氢二钾溶液混合均匀、离心、过滤。

优选地，所述避光衍生化反应的衍生温度为55~65℃，衍生时间为50~70min，样品可达到稳态，衍生化完全，且节约原料和能源，降低成本。

本发明步骤S1属于本领域常规步骤，作为一种实施方案，具体步骤为：

（1）称取新鲜罗仙子放入高速组织匀浆机中按重量体积比为1:3的比例加入单蒸水，充分匀浆，匀浆液用200目的纱网过滤，得滤液；

（2）将滤液超声粉碎30s，反复6次，强度14kHz，800W；

（3）将超声处理后的样品4℃，12000rpm离心25min，取上清液，用6层纱布过滤去除最上层的凝固脂肪；

（4）将滤液在80℃水浴中搅拌加热10min，在冰浴中冷却后，4℃，12000rpm离心25min，取上清液；

（5）将上清液用100kD分子截留量的超滤膜过滤后，用30kD分子截留量的超滤膜过滤；

（6）将超滤液冷冻干燥，得到分子量为30kD以下的小分子蛋白冻干粉即为罗仙子有效部位提取物。

本发明采用标样法，通过氨基酸标准品的检测来归属供试品高效液相色谱图中的色谱峰。本发明对10批罗仙子供试品进行检测，通过定性和定量分析测得样品罗仙子样品中各类氨基酸的种类和含量：谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸平均质量分数分别为7.62%、1.19%、5.46%、1.32%、1.40%、3.69%、1.68%、3.30%、2.47%、4.48%、1.02%。

本发明对检测结果的精密度也进行了考察，具体实验如下：

精密度实验：取同一供试液，连续进样5次，各共有特征峰相对保留时间RSD < 0.13%，相对峰面积RSD <1.00%，表明仪器精密度良好。

重复性实验：取同一样品5份，按1.6项方法平行制备供试液，进样检测，各共有特征峰相对保留时间RSD <1.10%；相对峰面积 RSD <1.14%，表明重复性良好。

稳定性实验：取同一样品，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样测定，各共有特征峰相对保留时间RSD <1.56%；相对峰面积RSD <1.93%，表明供试液在24 h内稳定性良好。

根据本发明所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，对10批罗仙子供试品进行高效液相色谱检测，结果导入中药指纹图谱相似度软件2004A，对保留时间 0~35 min的色谱峰进行自动匹配，确定了24个共有特征峰，保留时间分别为3.321 min、3.647 min、5.439 min、5.871 min、6.483 min、6.601 min、6.937 min、7.071 min、7.785 min、8.147 min、10.387 min、11.984 min、12.289 min、13.227 min、14.291 min、15.175 min、15.663 min、16.174 min、16.600 min、19.493 min、22.380 min、22.982 min、26.676 min、26.872 min，这些共有特征峰构成了中药罗仙子药材的指纹特征，作为罗仙子药材的标准指纹图谱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明成功构建了中药罗仙子指纹图谱，确定了保留时间0~35 min共有24个共有特征峰，适用于日后对中药罗仙子药材真伪和品质的进一步鉴别和分类。

（2）本发明公开的中药罗仙子指纹图谱的构建方法步骤简单，成本低廉，稳定性和重现性良好，操作性强，精密度高。

附图说明

图1为中药罗仙子的指纹图谱；

图2为10批次罗仙子的高效液相色谱相似度分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例

1、仪器和试剂：

使用Waters高效液相色谱仪；中药罗仙子药材共10批次，由广东药学院生物活性物质研究所养殖（10个批次的样品采集日期分别为2012-11-20、2012-12-16、2012-12-31、2013-01-18、2013-01-25、2013-03-27、2013-04-19、2013-05-10、2013-06-19、2013-07-08的中药罗仙子）；其它试剂为色谱纯或分析纯，直接商业购买。

常规溶液配制：

（1）0.05mol/L 乙酸钠缓冲液（含10ml/L N,N-二甲基甲酰胺）：称取4.1g乙酸钠，加700ml纯净水溶解，用乙酸调pH至6.5，加水至1L，加10ml N,N-二甲基甲酰胺，0.45μm滤膜过滤；

（2）10ml/L DNFB（2，4二硝基氟苯）溶液：取1.0ml DNFB，加乙腈定容至100ml；

（3）0.01mol/L 磷酸二氢钾溶液：称取1.36g磷酸二氢钾，加700ml纯净水溶解，用磷酸调pH7.0，定容至1L；

（4）碳酸氢钠溶液：称取40.2g碳酸氢钠，加纯净水定容至1L。

2、罗仙子有效部位提取物的制备：

（1）称取各批次新鲜冷冻的罗仙子，在室温下解冻，放入高速组织匀浆机中按1:3（m:v）的比例加入单蒸水，充分匀浆，匀浆液用200目的纱网过滤，得滤液；

（2）将滤液超声粉碎30s，反复6次，强度14kHz，800W；

（3）将超声处理后的样品4℃离心25min（12000rpm），取上清，用6层纱布过滤去除最上层的凝固脂肪；

（4）将滤液在80℃水浴中搅拌加热10min，在冰浴中冷却后，4℃离心25min（12000rpm），取上清；

（6）将超滤液在-80℃冰冻2h后，进行冷冻干燥，得到分子量为30kD以下的小分子蛋白冻干粉即为罗仙子有效部位提取物。

2、供试品溶液的制备：

称取罗仙子有效部位提取物5.0mg，精密称定，置于10ml安瓿瓶中，准确加入6mol/L盐酸5ml，酒精喷灯加热封口，置于110℃烘箱中，水解24h，取出，放冷，将水解液过滤，取3ml续滤液至蒸发皿中，加热挥干，残渣以1.5ml 50%乙醇溶解制得供试品前处理液。

精密量取1.0 mL供试品前处理液置10ml棕色量瓶中，加入1.0ml 碳酸氢钠溶液、1.0ml 10ml/L DNFB乙腈溶液，摇匀，置于60℃烘箱中避光反应60min，取出，冷却至室温，用0.01mol/L磷酸氢二钾稀释至刻度，摇匀，8000 rpm离心5min，取上清，0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

3、高效液相色谱分析条件：

色谱柱：Welch Ultimate XB-C8 柱（250 mm×4.6 mm,5μm）；流动相：乙腈、水、0.05mol/L乙酸钠缓冲液（含10ml/L N,N-二甲基甲酰胺），梯度洗脱，程序见表1；流速：1.0ml/min；检测波长：360nm；柱温：44 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序

时间（min）	乙酸钠缓冲液（%）	乙腈（%）	水（%）
				0	70	15	15
13	38	31	31
				21	32	34	34
23	0	50	50
				25	0	50	50
26	70	15	15
				35	70	15	15

4、指纹图谱的构建：

在上述HPLC条件下分析10批供试品溶液，记录色谱图，将色谱图的检测结果导入中药指纹图谱相似度软件2004A，对保留时间0~35 min的色谱峰进行自动匹配，得到中药罗仙子的指纹图谱，确定24个共有特征峰，如图1所示。

从图1可以看出，24个共有特征峰的保留时间分别为3.321 min、3.647 min、5.439 min、5.871 min、6.483 min、6.601 min、6.937 min、7.071 min、7.785 min、8.147 min、10.387 min、11.984 min、12.289 min、13.227 min、14.291 min、15.175 min、15.663 min、16.174 min、16.600 min、19.493 min、22.380 min、22.982 min、26.676 min、26.872 min，这些共有特征峰构成了中药罗仙子药材的指纹特征，可作为罗仙子药材的标准指纹图谱。

5、供试品氨基酸的测定：

采用氨基酸标准品对检测样品中氨基酸的种类和含量进行标定。

（1）氨基酸标准品溶液的制备

分别秤取3 mg氨基酸标准品，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入6mol/L盐酸2.5ml，用蒸馏水稀释至刻度，制得18种氨基酸标准品混合溶液，18种氨基酸分别为：天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）。

分别秤取5mg赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸标准品，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加入6mol/L盐酸0.5ml，用蒸馏水稀释至刻度，得11种氨基酸标准品溶液。

（2）氨基酸标准品衍生化

精密量取1.0ml氨基酸标准品溶液置10ml棕色量瓶中，加入1.0ml 碳酸氢钠溶液、1.0ml 10ml/L DNFB乙腈溶液，摇匀，置于60℃烘箱中避光反应60min，取出，冷却至室温，用0.01mol/L磷酸氢二钾稀释至刻度，摇匀，8000 rpm离心5min，取上清，0.45μm微孔滤膜过滤，制得氨基酸标准品衍生化溶液。

（3）中药罗仙子指纹图谱共有特征峰标定

将氨基酸标准品衍生化溶液进行高效液相色谱分析，根据保留时间标定中药罗仙子指纹图谱中的共有特征峰，并根据色谱峰积分面积测定供试品中氨基酸的含量。

10批供试品测得的指纹图谱的共有特征峰标定结果如下：

谱峰1为门冬氨酸；谱峰2为谷氨酸；谱峰3为丝氨酸；谱峰6为精氨酸；谱峰7为甘氨酸；谱峰8为苏氨酸；谱峰9为脯氨酸；谱峰10为丙氨酸；谱峰13为缬氨酸；谱峰14为蛋氨酸；谱峰16为异亮氨酸；谱峰17为亮氨酸；谱峰18为组氨酸；谱峰19为苯丙氨酸；谱峰22为赖氨酸；谱峰23为酪氨酸。此外，经检测，谱峰4为2,4-二硝基苯酚DNP-OH（即DNFB的衍生化产物）；

10批供试品的氨基酸含量测定结果如下：谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸平均质量分数分别为7.62%、1.19%、5.46%、1.32%、1.40%、3.69%、1.68%、3.30%、2.47%、4.48%、1.02%。

6、指纹图谱相似度计算：

参照现有技术对10批样品指纹图谱进行匹配，并分别以生成的对照谱图(中位数法)作为对照模板，计算相似度。

10批样品的高效液相色谱相似度分析图谱如图2所示，图中S1~S10分别对应批次为2012-12-31、2013-01-18、2013-07-08、2013-01-25、2012-11-20、2012-12-16、2013-06-19、2013-05-10、2013-04-19、2013-03-27的中药罗仙子，计算得知10批样品的相似度均在0.999~1之间，表明10批样品具有较好的相似度。

7、方法学考察：

精密度实验：取批次为2012-12-16样品，连续进样5次，各共有特征峰相对保留时间RSD < 0.13%，相对峰面积RSD <1.00%，表明仪器精密度良好。

重复性实验：取批次为2012-12-16样品5份，按1.6项方法平行制备供试液，进样检测，各共有特征峰相对保留时间RSD < 1.10%；相对峰面积RSD < 1.14%，表明重复性良好。

稳定性实验：取批次为2012-12-16样品，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，各共有特征峰相对保留时间RSD < 1.56%；相对峰面积RSD < 1.93%，表明供试液在24 h内稳定性良好。

Claims

1.一种中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 罗仙子有效部位提取物的制备：新鲜罗仙子匀浆、过滤、超声粉碎、过滤取滤液、加热、冷却、离心取上清液、超滤、干燥制得罗仙子有效部位提取物；

S2. 供试品溶液的制备：将罗仙子有效部位提取物与盐酸混合水解，过滤取滤液，滤液干燥后的残渣再用50%乙醇溶解得供试品前处理液；供试品前处理液加入2,4-二硝基氟苯DNFB衍生化制得供试品溶液；

时间0min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水；

时间13min 38%乙酸钠缓冲液、31%乙腈、31%水；

时间21min 32%乙酸钠缓冲液、34%乙腈、34%水；

时间23min 50%乙腈、50%水；

时间25min 50%乙腈、50%水；

时间26min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水；

时间35min 70%乙酸钠缓冲液、15%乙腈、15%水；

步骤S3中所述0.05mol/L乙酸钠缓冲液中还含有10ml/L N,N-二甲基甲酰胺。

2.根据权利要求1所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤S2中所述水解的具体步骤为将罗仙子有效部位提取物与6mol/L盐酸混合在100~120℃条件下水解20~30h。

3.根据权利要求2所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述罗仙子有效部位提取物与盐酸混合的质量体积比为1mg：0.8~1.2mL。

4.根据权利要求1所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤S2中所述50%乙醇的用量为滤液体积的0.3~0.8。

5.根据权利要求1所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述衍生化的具体步骤为：先配制浓度为35~45 mg/mL的碳酸氢钠溶液及浓度为9~11mL/L的2,4-二硝基氟苯DNFB乙腈溶液，将供试品前处理液与碳酸氢钠溶液、2,4-二硝基氟苯DNFB乙腈溶液按体积比1：0.8~1.2：0.8~1.2混合，避光衍生化反应，冷却后加入6~8倍供试品前处理液体积的0.01mol/L磷酸氢二钾溶液混合均匀、离心、过滤。

6.根据权利要求5所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述避光衍生化反应的衍生温度为55~65℃，衍生时间为50~70min。

7.根据权利要求1所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤为：

（1）称取新鲜罗仙子放入高速组织匀浆机中按重量体积比为1:3的比例加入单蒸水，充分匀浆，匀浆液用200目的纱网过滤；

（2）将滤液超声粉碎30s，反复6次，强度14kHz，800W；

（3）将超声处理后的样品4℃，12000rpm离心25min，取上清液，用6层纱布过滤；

（6）将超滤液冷冻干燥，制得罗仙子有效部位提取物。

8.根据权利要求1至7任一项所述中药罗仙子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱确定了24个共有特征峰，保留时间分别为3.321 min、3.647 min、5.439 min、5.871 min、6.483 min、6.601 min、6.937 min、7.071 min、7.785 min、8.147 min、10.387 min、11.984 min、12.289 min、13.227 min、14.291 min、15.175 min、15.663 min、16.174 min、16.600 min、19.493 min、22.380 min、22.982 min、26.676 min、26.872 min。