CN105467045B - 一种香菇中l‑噻唑烷‑4‑羧酸的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种香菇中L‑噻唑烷‑4‑羧酸的快速检测方法，包括香菇前处理提取、样品净化、液相色谱检测。其主要步骤如下：样品用甲醇‑水（70:30，v/v）进行前处理提取；经过WondaSep MAX固相萃取小柱净化处理；样品分析采用Inertsil HILIC亲水作用色谱柱（4.6×250 mm，5μm）进行分离测定，流动相采用乙腈‑0.1%磷酸水（85:15，v/v）等度洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长193 nm，柱温30℃，进样量5μL。该方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好。弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L‑噻唑烷‑4‑羧酸分离测定的空缺。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法。
背景技术
香菇（Lentinula edodes）在我国已有近千年的栽培历史，其产量逐年增加。其味道鲜美，香气沁人，营养丰富，素有“山珍之王”之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。但香菇子实体中普遍含有内源性甲醛，国内外相关学者一直致力于甲醛抑制剂的探索。其中有研究发现，外源添加L-半胱氨酸不仅能对香菇进行保鲜，还能降低香菇甲醛含量，有研究表明两者发生反应，生成L-噻唑烷-4-羧酸。L-噻唑烷-4-羧酸(L-Thiazolidine-4- carboxylic acid)，又称L-硫代脯氨酸，国内外许多研究已表明此物质具有抑制癌细胞扩散、使肿瘤细胞逆转为正常细胞、抗炎、降血糖的功能，并且该物质在一定剂量范围内，对人体不会产生副作用。目前对于L-噻唑烷-4-羧酸的检测可供参考的方法较少，还没有建立相应的检测标准。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法。本发明以L-噻唑烷-4-羧酸标准品进行检测条件的优化，建立快速检测方法，并以L-半胱氨酸处理过的香菇为实验材料，以未经L-半胱氨酸处理的香菇为对照，实际应用该方法进行了检测和证明：采用固相萃取-亲水作用色谱法测定其L-噻唑烷-4-羧酸含量。该方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好，弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分离测定的空缺，并为研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和检测方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，包括香菇子实体前处理、固相萃取、亲水作用色谱测定，其操作步骤如下：
（1）配制标准溶液：称取50.0 μg L-噻唑烷-4-羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，以流动相（乙腈-0.1wt%磷酸水溶液，85:15，v/v）定容，配成1000 μg/L的标准储存液；以此为母液，准确移取20、50、100、500、1000 μL于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 μg/mL系列质量浓度的标准溶液；测定标准品在2～100 μg/mL范围内的线性关系；所得线性回归方程为Y=5146.42X-1171.96，相关系数为0.9998；
（2）样品预处理：准确称取2.0 g研磨后的香菇样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)摇匀，100 W功率下超声提取20 min，在10000 r/min转速下，离心10min；离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷涡旋混匀1 min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 mL2wt%氨水摇匀作为上样液；（3）样品净化：采用WondaSep MAX固相萃取小柱（阴离子萃取小柱，60 mg/3 mL，购自于岛津公司），先分别用3 mL甲醇和3 mL去离子水将小柱活化，再加入步骤（2）提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0 wt%甲酸(90:10，v/v)混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40℃将洗脱液吹干，加入1mL乙腈-0.1wt%磷酸（85:15，v/v）溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μm有机滤膜，供HPLC测定；
（4）液相色谱测定参数：操作系统为岛津LC-solution工作站；色谱柱：岛津Inertsil HILIC液相色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：有机相为乙腈，无机相为0.1wt%磷酸水，体积比为85:15，等度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样体积：5 μL；检测波长：193 nm。
本发明优点在于：
①根据L-噻唑烷-4-羧酸显弱酸性的特点，香菇样品前处理首次采用阴离子固相萃取的方式进行净化，有效保留了目标物的同时降低了基质效应；
②由于L-噻唑烷-4-羧酸属于极性小分子物质，普通C18反相色谱柱难以进行分离，因此本发明采用亲水作用色谱法对香菇中的L-噻唑烷-4-羧酸进行分离测定；
③本发明的检测方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好，弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分离测定的空缺，并为研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和检测方法；该检测方法耗时5h；加标回收率为96.3%~101.7%，相对标准偏差在1.3%~4.8%之间，检出限为0.24 μg/mL，定量限为0.73 μg/mL。
具体实施方式
为了充分公开本发明的香菇L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，以下结合实施例加以说明。
实施例1
一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，包括以下步骤：
1. 配制标准溶液：称取50.0 μg L-噻唑烷-4-羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，以流动相（乙腈-0.1wt%磷酸水溶液，85:15，v/v）定容，配成1000 μg/L的标准储存液；以此为母液，准确移取20、50、100、500、1000 μL于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 μg/mL系列质量浓度的标准溶液；测定标准品在2~100 μg/mL范围内的线性关系；所得线性回归方程为Y=5146.42X-1171.96，相关系数为0.9998；
2. 香菇样品前处理：将香菇样品分成两份，其中一份喷洒40 mM L-半胱氨酸，另外一份喷洒等量的水做对照，常温下放置16h，待其自然晾干；晾干后，分别进行研磨，准确称取2.0 g的香菇样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)摇匀，100 W功率下超声提取20 min，在10000 r/min转速下，离心10 min；离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷涡旋混匀1 min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 mL 2wt%氨水摇匀作为上样液；
3. 固相萃取：采用WondaSep MAX固相萃取小柱（阴离子），先分别用3 mL甲醇和3mL去离子水将小柱活化，再加入上述提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0wt%甲酸水溶液(90:10，v/v)混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40℃将洗脱液吹干，加入1 mL乙腈-0.1%磷酸（85:15，v/v）溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μm有机滤膜，供HPLC测定；
4. 液相色谱测定：操作系统为采用岛津LC-solution工作站；色谱柱：岛津Inertsil HILIC液相色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：有机相为乙腈，水相为0.1%磷酸水，体积比为85:15，等度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样体积：5 μL；检测波长：193 nm。以上参数选定后，分别对提取的样品进行分离测定；
5. 样品分离测定后发现，经 L-半胱氨酸处理后的香菇可检测到L-噻唑烷-4-羧酸，含量为13.95μg/g，对照未检测到L-噻唑烷-4-羧酸。
整体耗时为21h。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配制标准溶液：配制2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL系列质量浓度的L-噻唑烷-4-羧酸标准溶液，测定L-噻唑烷-4-羧酸标准品在2～100 μg/mL范围内的浓度和峰面积的线性关系；
（2）香菇样品的预处理：准确称取2.0 g研磨后的香菇样品于50 mL离心管中，加入20mL甲醇水溶液摇匀，100 W功率下超声提取20 min；再在10000 r/min转速下，离心10 min；离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋混匀1 min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 mL 2wt%氨水摇匀作为上样液；
（3）固相萃取：采用WondaSep MAX固相萃取小柱，先分别用3 mL甲醇和3 mL去离子水将小柱活化，再加入步骤（2）提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40℃将洗脱液吹干，加入1 mL乙腈-0.1wt%磷酸溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μm有机滤膜，供HPLC测定；
（4）液相色谱测定：操作系统为岛津LC-solution工作站；色谱柱：岛津Inertsil HILIC液相色谱柱，其规格为4.6×250 mm，5 μm；流动相：有机相为乙腈，无机相为0.1wt%磷酸水溶液，体积比为85:15，等度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样体积：5 μL；检测波长：193 nm；以上参数选定后，分别对提取的样品进行分离测定。
2.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为70:30。
3.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于：步骤（3）所述WondaSep MAX固相萃取小柱为阴离子固相萃取小柱，其规格为60 mg/3 mL；步骤（3）所述甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液中，甲醇、1.0 wt%甲酸水溶液的体积比为90:10。
4.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于：步骤（3）所述乙腈-0.1wt%磷酸溶液中，乙腈、0.1wt%磷酸溶液的体积比为85:15。
5.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于：步骤（1）所得线性关系为：线性回归方程为Y=5146.42X-1171.96，相关系数为0.9998。
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