CN102507772A

CN102507772A - 一种检测混合物中抗氧化活性化合物的方法

Info

Publication number: CN102507772A
Application number: CN2011103303426A
Authority: CN
Inventors: 张强; 苏印泉; 李秀红; 朱铭强
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2012-06-20

Abstract

本发明是一种检测混合物中的抗氧化活性化合物的装置及其操作方法，属于色谱分析技术和活性化合物检测技术领域。此发明可以快速检测混合物中具有抗氧化活性的组分。装置由一台高效液相色谱仪(包括高压泵，液相色谱柱，可见紫外检测器)和一台高压泵，一台可见检测器，一个HPLC用“三通”，一个缓冲器和一个反应圈组成，采用化学自由基ABTS测定混合物中抗氧化活性成分。混合物中各组分经液相色谱分离后逐一与自由基反应，有活性的组分使自由基褪色，成为负峰，对比色谱图和与自由基反应后的色谱图，可以得到混合物中抗氧化活性组分的数目，各组分保留时间和抗氧化活性强弱。此方法快速简便，灵敏度高。

Description

一种检测混合物中抗氧化活性化合物的方法

一、技术领域：

本发明属于色谱分析技术和活性化合物检测技术领域，更详细的说，是一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在线检测混合物中抗氧化活性化合物的方法。

二、背景技术：

高效液相色谱是一种高效分离分析混合物中化合物的仪器和方法，配备不同的检测器，可以检测混合物中不同性质的化合物。常用的检测器有：紫外吸收检测器(UVD)、二极管阵列检测器(PDAD)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MSD)。这些检测器均以化合物的某种化学物理性质检测化合物，与化合物活性没有紧密联系。

抗氧化活性化合物在植物、动物组织、血液中广泛存在。一些食品中加入抗氧化剂以延长保质期。检测食品中抗氧化剂，以及检测植物、动物组织以及血液中的抗氧化活性化合物是当今食品安全检测研究、植物化学研究，天然抗氧化剂开发研究，药物代谢研究等等研究与技术领域不可或缺的部分。按照传统方法从动植物组织的提取物中检测抗氧化活性化合物是一项耗时费力的工作。因为检测混合物中未知的活性化合物的传统方法是分离纯化混合物中所有(尽量多)的化合物，然后逐一进行活性测试。这种方法消耗大量的人力、物力(大量溶剂、分离用填料和样品)和时间(几个月)，而且样品在长时间分离过程中可能发生氧化反应等变化。分离得到的化合物多数无活性，具有较高活性的化合物较少。即使在活性跟踪下分离纯化也同样存在流程长，人力、物力消耗大，效率较低的弊病。

检测食品、血液中抗氧化剂则要求知道抗氧化剂的结构性质等，才能确定检测方法，无法做到对未列入检测项目的抗氧化剂的检测。

鉴于以上种种情况，一种将高效液相色谱和自由基检测系统联用以快速检测混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化剂的方法逐步发展起来。该方法相当于在高效液相色谱已有的可见紫外检测器的基础上再加上抗氧化活性检测器，这样一次色谱分析即可得到混合物中各个化合物的抗氧化活性数据，检测出已知的和未知的抗氧化活性化合物和抗氧化剂。

这类方法在国内仅有3篇文章发表，朱卉等选取H₂O₂及O₂ ^·-为检测自由基，检测了一种药品中抗氧化活性化合物。吴雷等以O₂ ^·-为检测自由基，检测了中药材麦冬中的抗氧化活性化合物。H₂O₂和和O₂ ^·-不稳定，系统需要用鲁米诺和连苯三酚或者过氧化氢，因此体系反应复杂，稳定性和灵敏度不理想。王小淞等选取DPPH自由基为检测用自由基，检测了黄芩根提取物中的抗氧化活性成分。DPPH自由基稳定，系统组成与使用ABTS自由基类似，但灵敏度不及ABTS自由基。国外有应用ABTS自由基的装置，但是由于没有应用缓冲器，不能避免由高压泵压力波动导致的信号噪音，使得方法灵敏度受到限制。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种以高效液相色谱和自由基检测系统联用的装置和方法，检测动植物组织提取物，食品等混合物中的抗氧化活性化合物和抗氧化剂。从而为混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化剂的检测提供一种灵敏度高，重复性好，操作简便，检测快速的方法，以消除传统方法费时耗力耗物，效率低下的弊端，以及同类方法稳定性和灵敏度较差的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测混合物中的抗氧化剂和抗氧化活性化合物的方法，是利用高效液相色谱分析混合物中抗氧化活性化合物以及抗氧化剂的分析方法，包括以下装置，参数设置和分析方法：

(1)装置：所需仪器有一套高效液相色谱仪HPLC(包括高压泵；进样器；可见紫外检测器；软件和计算机，配以C18液相色谱柱)，一台可见检测器，一个缓冲器，一台信号记录仪，一台高压泵，一个HPLC用“三通”和HPLC用塑料(PEEK)管道。

HPLC 的可见紫外检测器连接到一个HPLC用“三通”，“三通”另一路经缓冲器连接至输送自由基溶液的高压泵，第三路经由反应圈(HPLC用连接管道，材料为PEEK，内径小于等于0.25mm，长度为10.0-30.0的高压泵，第三路经由反应圈(HPLC用连接管道，材料为PEEK，内径小于等于0.25mm，长度为10.0-30.0m)连接至可见吸收检测器和一个信号记录器。

(2)参数设置：

①自由基选用ABTS自由基，浓度为0.32mmol/L，流速0.5-1.0mL/min，可见检测器检测波长为414nm。

ABTS贮存液配制方法。0.110gABT溶于90mL磷酸盐缓冲液(NaCl 8.2/L，KH₂PO₄0.26g/L，Na₂HPO₄1.4g/L，KCl 0.14g/L)，加入10mL K₂S₂O₈溶液(0.8gK₂S₂O₈溶于1L前述磷酸盐缓冲液中)，避光保存于4℃冰箱中12h以上。溶液需在48h内使用。

ABTS工作溶液配制方法。使用时取ABTS贮存液16mL(或者1-2倍)以10％(v/v)甲醇磷酸盐缓冲液溶液定容至100mL(或者1-2倍)。

②高效液相色谱参数设定。洗脱剂流速0.5-1.0mL/min。洗脱剂pH范围3.5-8.5。洗脱剂为水和甲醇或乙腈，甲醇或者乙腈含量最高可达到100％。检测器波长依检测对象和目的设置。

(3)分析方法：

①开启系统中所有仪器。按照(2)设定参数。②进样分析。③仪器分析完成后，将两台可见紫外检测器所得图谱对照，如果两张图有色谱峰保留时间一致，可确定此色谱峰代表的化合物为活性化合物。HPLC的检测器出现的色谱峰无保留时间一致的自由基检测峰可确定为无活性化合物。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

(1)本发明在系统中采用ABTS自由基作为抗氧化活性检测自由基，ABTS自由基为市售商品，质量稳定，来源广泛，使用方便。ABTS自由基比H₂O₂及O₂ ^·-稳定，与抗氧化剂反应灵敏度高。因此与使用后两种自由基的类似系统相比，本系统组成简单，性能稳定，检测限低。

(2)本发明采用缓冲器显著降低了高压泵流速波动带来的噪音，提高了系统灵敏度。

(3)本发明所建立的抗氧化物质检测系统与传统检测方法相比简便快速，成本低。传统方法需要将混合物中的化合物分离纯化，得到纯化合物后再逐一检测其抗氧化活性，费时费力，成本很高。本系统将HPLC和抗氧化活性检测系统结合在一起，一次进样就可以检测出混合物中的抗氧化活性化合物以及抗氧化剂。

四、附图说明：

附图为本发明的装置图。图中上部所示HPLC高压泵、进样器、色谱柱、紫外检测器和记录仪等是一套HPLC仪器。样品进样后，经色谱柱分离，经紫外检测器得到上部的色谱图，再流向“三通”，与高压泵经缓冲器输送来的自由基溶液混合，在反应圈中反应，再经过检测器得到下部只有“负峰”出现的色谱图。由下部色谱图可知混合物中抗氧化活性化合物数目与各自活性大小，对比上部色谱图可知对应活性成分的保留时间。

五、具体实施方式：

为了进一步说明本发明，下面举一个实施例：利用本发明建立的系统检测植物杜仲叶50％乙醇提取物中抗氧化活性化合物：

1样品与溶剂处理

所有需要HPLC分析的样品及溶剂均过滤处理(0.45μm，RC 55；Schleicher&Schuell；Dassel，德国)。杜仲叶样品取10g，加入100mL的50％乙醇，80℃下回流提取60min，提取液过滤减压挥尽溶剂得提取物。提取物以50％乙醇配制为10mg/mL溶液。

2自由基溶液配制方法

ABTS贮存液配制。0.110g ABTS于90mL磷酸盐缓冲液(NaCl 8.2g/L，KH₂PO₄0.26g/L，Na₂HPO₄ 1.4g/L，KCl 0.14g/L)，加入10mL K₂S₂O₈溶液(0.8g K₂S₂O₈溶于1L前述磷酸盐缓冲液中)，避光保存于4℃冰箱中12h以上。

ABTS工作溶液配制。取ABTS贮存液16mL以10％(v/v)甲醇磷酸盐缓冲液溶液定容至100mL。

3HPLC分析方法

流动相A：水97.9％+甲酸0.1％+乙腈2.0％；流动相B：乙腈99.8％+甲酸0.1％+水0.1％。样品浓度10mg/mL，进样量10μL。流速0.5mL/min，检测波长280nm。杜仲叶提取物梯度洗脱程序为0-100min，流动相B：5％-50％。

4在线系统参数设定

HPLC流速0.5mL/min，检测波长280nm。自由基检测波长414nm。ABTS自由基浓度0.32mmol/L，自由基溶液流速0.5mL/min，反应圈长度10.0m。

5杜仲叶提取物中抗氧化活性化合物检测结果

由试验得到的两张色谱图可知，杜仲叶至少含有18种抗氧化活性成分，而且这18种成分在实验色谱条件下的保留时间也已经确定，18种成分的活性由负峰的峰面积确定。

Claims

1.一种检测混合物中抗氧化活性化合物的方法，是利用高效液相色谱分析混合物中抗氧化活性化合物以及抗氧化剂的分析方法，其装置由一台高效液相色谱仪(包括进样器，高压泵，液相色谱柱，可见紫外检测器，信号记录仪)和一台高压液相色谱高压泵，一个缓冲器，一台可见吸收检测器，一个信号记录器和一个反应圈组成。

2.如权利要求1所述，装置各部分连接如下：

HPLC的可见紫外检测器连接到一个HPLC用“三通”，“三通”另一路经缓冲器连接至输送自由基溶液的高压泵，第三路经由反应圈(HPLC用连接管道，材料为PEEK，内径小于等于0.25mm，长度为10.0-30.0m)连接至可见吸收检测器和一个信号记录器。

3.如权利要求(1)所述，自由基选用ABTS(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)自由基，浓度0.32mmol/L，流速0.5-1.0mL/min，可见检测器检测波长为414nm。

4.如权利要求(1)所述，高效液相色谱溶剂流速0.5-1.0mL/min，pH范围3.5-8.5。