CN111896634A

CN111896634A - 番茄红素在线分析方法

Info

Publication number: CN111896634A
Application number: CN201910368001.4A
Authority: CN
Inventors: 张琳; 滨田尚树; 李晓东
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2020-11-06

Abstract

本发明涉及一种番茄红素在线分析方法，所述方法包括：在线地将含有番茄红素的待测样品通过超临界流体进行萃取(SFE)，以得到萃取液，并使用超临界流体色谱(SFC)‑检测器对待测样品中的番茄红素含量进行检测，这是首次使用基于SFE‑SFC‑检测器系统的对于番茄红素的在线定量分析的方法。

Description

番茄红素在线分析方法

技术领域

本发明属于天然成分的分析检测领域，特别是一种脂溶性天然成分的在线分析和检测，具体而言，本发明涉及一种快速地对番茄红素在线定量分析的方法。

背景技术

已有的研究表明，西红柿和番茄加工产品的消费能够从很多方面对人类的身体健康提供帮助(参考文献1)。虽然并不完全确定，但主要推测这可能是与西红柿中存在番茄红素正相关。

番茄红素是一种多不饱和烃，也是最重要的类胡萝卜素之一。它具有线性排列的11个共轭和2个未共轭的双键。因此，番茄红素具有极强的疏水性，脂溶性，在加工过程中易于异构化。番茄红素对人体健康的益处可以基于其抗氧化活性和自由基清除能力的特性来解释。现有的研究还报道，富含番茄红素的食物或补品可以降低各种癌症的患病风险(参考文献2)。

由于番茄红素具有上述特定的功能特性，而且，消费者对于天然物质的偏爱又大幅度的在增长，因此，对于番茄红素各种定性和定量的检测方法应运而生，并且各种样品预处理方法和分析系统已应用于番茄红素分析以检测其在待测样品中的含量。例如，基于液-液系统的分析方法已被广泛用于番茄红素提取(参考文献3)。然而，目前这些常规的检测方法需要使用大量有机溶剂以预先对样品进行萃取等预处理。通常情况下，这些溶剂毒性很大并且需要花费大量时间进行处理，并且对于使用过的溶剂的回收也存在能耗或环境问题。

为了避免这些缺点，人们对于进一步地开发环境友好型的技术以促进番茄红素的定性和定量分析已经产生了越来越大的兴趣来。

超临界流体萃取(SFE)被认为是常规溶剂萃取的替代方法之一。最常用的萃取溶剂是超临界CO₂，因为它具有中等的临界压力(74bar)和温度(32℃)。据报道，在最佳的萃取条件下，使用超临界二氧化碳可以成功地从多种原料中提取番茄红素(参考文献4-7)。然而，这些与SFE相关的研究主要集中在工业生产番茄红素的用途，例如，提高从西红柿等原料中获取的番茄红素的产量和纯度。

同时，关于番茄红素测量的分析技术，高效液相色谱(HPLC)，质谱(MS)，FTIR等仪器以及最近的超临界流体色谱(SFC)(参考文献8)已经成功应用。

此外，研究表明，使用超临界二氧化碳作为样品制备的萃取溶剂和用于仪器分析的洗脱溶剂也是非常有前途的。

一些研究报道了可以通过离线组合SFE和SFC来实现，但这意味着番茄样品首先由离线的SFE进行预处理，并且收集提取物然后注入基于SFC的仪器中进行分析。然而，离线整合萃取和色谱分析两套仪器，使得整个过程仍然很复杂，特别是在处理大量样品时。因此，对于这种分析方法，需要进一步的通过优化力求可以将其转化为在线检测系统。

另一方面，无论是自制的还是商业上可获得的方式，一些在线或者离线的SFE-SFC系统已经开发出来，例如参考文献9中公开了一种多酚类物质离线超临界萃取-超临界色谱-质谱联用检测方法。该方法包括：将待测食品与脱水剂混合后，再与萃取液接触并进行超临界萃取处理，以便得到待测液；以及将所述待测液进行超临界色谱-质谱联用检测，以便对所述食品、药品等的多酚类物质进行定性和定量分析。该方法采用超临界萃取处理提取食物中的多酚类化合物，方法简单，自动化程度高，所需样品量少，并能有效避免多酚类物质氧化分解。同时，采用超临界色谱-质谱联用进行检测，检测速度快，灵敏度和精确度高。

但是，通常认为由于不同天然成分具有不同的提取和色谱柱保留特性。对于参考文献9中的方法是否能够适用于其他的天然物质的检测，尤其是是否能够得到满意的定量测量精度，并无法提前预知，也没有明确的有验证。因此，这种系统定量分析方法对于从不同种类的样品(如含有番茄红素的植物样品、含有番茄红素的营养品等)中分析番茄红素的能力尚未得到彻底研究。

参考文献：

1.Giovannucci,E.(1999).Tomatoes,Tomato-Based Products,Lycopene,andCancer:Review of the Epidemiological Literature,J.Natl.Cancer Inst.91,317-331.Jnci Journal of the National Cancer Institute,91(4),317-331.；

2.Singh,A.,Ahmad,S.,&Ahmad,A.(2015).Green extraction methods andenvironmental applications of carotenoids-a review.RSC Advances,5(77),62358-62393；

3.Cucu,T.,Huvaere,K.,Van Den Bergh,M.-A.,Vinkx,C.,&Van Loco,J.(2012).A Simple and Fast HPLC Method to Determine Lycopene in Foods.Food AnalyticalMethods,5(5),1221-1228；

4.Domadia,B.A.,&Vaghela,N.R.(2013).Supercritical fluid extraction oflycopene from tomatos by using CO2as a solvent:A review.Journal of Chemical&Pharmaceutical Research；

5.Nobre,B.P.,Gouveia,L.,Matos,P.G.,Cristino,A.F.,Palavra,A.F.,&Mendes,R.L.(2012).Supercritical extraction of lycopene from tomato industrialwastes with ethane.Molecules,17(7),8397-8407；

6.Singh,A.,Ahmad,S.,&Ahmad,A.(2015).Green extraction methods andenvironmental applications of carotenoids-a review.RSC Advances,5(77),62358-62393；

7.Topal,U.,Sasaki,M.,Goto,M.,&Hayakawa,K.(2006).Extraction oflycopene from tomato skin with supercritical carbon dioxide:effect ofoperating conditions and solubility analysis.J Agric Food Chem,54(15),5604-5610；

8.Li,B.,Zhao,H.,Liu,J.,Liu,W.,Fan,S.,Wu,G.,&Zhao,R.(2015).Applicationof ultra-high performance supercritical fluid chromatography for thedetermination of carotenoids in dietary supplements.J Chromatogr A,1425,287-292.；

9.CN108956813A

发明内容

发明要解决的问题

以往的技术中，尽管在使用超临界萃取和超临界色谱来分析各种天然样品时，本领域已经取得了一定的进展，然而对于特定的天然物质，尤其是对于番茄红素的检测提供一种快速、简便和环境友好的方法仍然存在着进一步研究的需要。

为了进一步丰富天然物质的定性和定量测量方法，提供一种切实可行的、可验证的并具有高的精确度番茄红素的在线快速检测方法，本发明提供了一种基于超临界萃取(SFE)、超临界色谱(SFC)定量检测样品中番茄红素的在线检测方法。对番茄红素的提取条件和样品预处理方法进行优化，提高了提取效率和重现性。

本发明中基于超临界萃取和超临界色谱技术开发了对番茄红素的在线SFE-SFC-检测器的测试方法，该方法基于在线的SFE-SFC-检测器标准曲线的制备或者基于离线的SFC-检测器标准曲线的制备。

本发明所提供的在线检测方法的结果与使用常规溶剂萃取-高效液相色谱(HPLC)方法获得的结果一致。这表明对于样品中番茄红素可以使用在线SFE-SFC-检测器系统进行分析和检测，并能够得出切实可靠的检测结果。

据我们所知，这是第一次使用在线SFE-SFC-检测器系统开发番茄红素分析定量方法的研究。

用于解决问题的方案

[1].本发明提供了一种在线检测番茄红素的方法，所述方法包括：

在线地将含有番茄红素的待测样品通过超临界流体进行萃取，以得到萃取液，之后使用超临界流体色谱-检测器对所述萃取液进行检测，以检测待测样品中的番茄红素的含量。

[2].根据[1]所述的方法，所述萃取的萃取效率为35％以上；所述萃取的压力为10-20MPa，优选为13-15.5MPa；所述萃取的温度为40-70℃，优选为50-65℃。

[3].根据[1]或[2]所述的方法，所述待测样品为干燥过的样品，优选为经过冷冻干燥的样品。

[4].根据[1]或[2]任一项所述的方法，所述检测器选自质谱检测器或者光学检测器。

[5].根据[1]或[2]任一项所述的方法，在检测中，超临界流体色谱对于番茄红素的保留时间为10分钟以上；所述超临界流体色谱的色谱柱中颗粒的平均粒径大于3μm。

[6].根据[1]或[2]任一项所述的方法，所述超临界流体色谱中的流动相包括超临界二氧化碳以及作为改性剂的极性溶剂，优选地，所述极性溶剂为甲醇。

[7].根据[1]或[2]任一项所述的方法，通过在超临界色谱柱前以及在检测器后设置的两个压力控制器，调整从超临界流体萃取后进入到超临界流体色谱的样品量的分流比为3％-10％，优选为5-8％。

发明的效果

本发明通过上述技术方案的实施取得了如下的技术效果：

(1)本发明提供了基于SFE-SFC-检测器的在线定量分析的方法，该方法的标准曲线可以基于在线的SFE-SFC-检测器的标准曲线的制备方法、或者基于离线的SFC-检测器的标准曲线制备方法而得到。针对不同的检测需求，可以使用上述任意的标准曲线制备方法得到标准曲线。使用本发明的SFE-SFC-检测器的在线检测测试样品，将结果与标准曲线进行对比得到测试结果。因此，本发明的方法提高了针对不同检测需求的适用性。

(2)通过在线联合使用SFE-SFC-检测器对番茄红素进行定量分析，相对传统使用HLPC对番茄红素离线分析方法，极大的提高了工作效率，由于减少了繁琐的预处理方法，实现了对番茄红素的在线快速检测。

(3)本法发明所提供在线SFE-SFC-检测器标准曲线的制备方法以及离线的SFC-检测器的标准曲线制备方法在线定量分析的方法具有较高的检测准确性以及重现性，因此，决定了本发明所提供的基于SFE-SFC-检测器的在线定量分析方法具有较高的准确性和重现性。

附图说明

图1：本发明的基于SFE-SFC-PDA在线检测番茄红素的方法示意图

图2：本发明的基于SFC-PDA在线检测番茄红素的方法示意图

图3：三种样品的提取效率以及重现性

图4：基于SFC-PDA和SFE-SFC-PDA在线检测的标准曲线

附图标记：

1：超临界二氧化碳

2：超临界二氧化碳供给泵

3：改性剂

4：改性剂供给泵

5：超临界萃取装置

6，7：阀门

8：超临界萃取罐

9：背压控制器I

10：柱温箱

11：超临界流体色谱柱

12：PDA检测器

13：背压控制器II

14：自动进样器

W：排出

具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方式、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方式、具体例子。需要说明的是，本说明书中，使用“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本发明提供了一种在线检测番茄红素的方法，所述在线检测方法基于超临界萃取(SFE)、超临界流体色谱(SFC)以及检测技术。本发明提供的方法是一种定量的检测方法。

具体而言，本发明提供了一种基于SFE-SFC-检测器的在线对番茄红素的定量分析的方法。通过对样品进行上述的在线检测，得到检测值(例如检测峰面积)，将检测值与预先制备的标准曲线进行对比得出样品中番茄红素的含量值。对于标准曲线的制备，原则上没有限制，在本发明一些具体的实施方案中，本发明提供了两种标准曲线的制备方法，即，基于SFE-SFC-检测器系统进行标准曲线的制备，以及基于SFC-检测器系统进行标准曲线制备。

需要说明的是：

在使用基于SFE-SFC-检测器的系统制备标准曲线后，保持检测系统状态不变，直接通过SFE的萃取装置中加入待测样品进行在在线检测，将检测值与标准曲线对比后可以直接得出测试样品的番茄红素含量，因此，又将基于SFE-SFC-检测器的系统制备标准曲线的方法称为在线制备标准曲线的方法。

在使用基于SFC-检测器的系统制备标准曲线后，保持检测系统状态不变，除了将检测系统中的自动进样器替换为SFE装置，并在SFC色谱柱之前、SFE之后加装压力控制单元(如下文所述的背压控制器I)，通过对检测系统中压力控制单元的调节对SFE中洗脱物进行分流，使得一部分洗脱物进入SFC-检测器进行检测。即，使用基于SFE-SFC-检测器的在线检测方法对待测样品进行检测。将检测值与标准曲线对比得出检测的番茄红素含量，并通过分流比和萃取效率折算出检测样品中番茄红素的含量。因此，又将基于SFC-检测器制备标准曲线的方法称为离线制备标准曲线的方法。

也即，本发明所提供的番茄红素的检测方法，可以基于SFE-SFC-检测器进行在线检测。用于番茄红素含量检测结果对比的标准曲线可以通过在线或离线两种方式进行制备。

<检测对象>

对于本发明的检测对象，原则上没有限制，只要是含有一定量的番茄红素的有样品均可以用于本发明的检测对象，例如可以是如下的水果说蔬菜样品：木鳖果、番茄、西瓜、南瓜、李、柿、胡椒果、桃、木瓜、芒果、番石榴、葡萄、葡萄柚、红莓、云莓、柑桔等果实和萝卜、胡萝卜、芜箐、甘蓝等的根部。

另外，对于本发明的检测对象，也可以是含有各种番茄红素的营养剂，这些营养剂通过含有番茄红素(或其他的营养补充成分)而在被人体服用后，对人体健康起到促进作用。不受限制地，这些营养剂可以为液滴形式、胶囊形式、颗粒形式、片剂形式等。

在本发明的一些具体的实施方案中，对于这些样品，可以在进行检测前首先进行干燥去水处理以提高对于番茄红素的萃取效率。对于干燥去水的处理的方式，没有特别的限制，可以使用烘干，或者在外加水分吸收剂的条件下除去样品中的水分，在本发明优选的事实方案中，可以使用冷冻干燥的方式去除样品中的水分。

<基于SFE-SFC-检测器的在线检测的方法>

在本发明中提供了一种基于超临界萃取-超临界流体色谱以及检测器的在线定量分析番茄红素含量的方法。该方法基于如下设定：在线地使用超临界流体对样品中的番茄红素进行超临界萃取，被萃取出来的番茄红素随着超临界流体被输送到捕集色谱柱(即超临界流体色谱柱)的柱头进行保留，进一步，当整个萃取过程结束后，番茄红素从上述色谱柱中被流动相洗脱并进入所述检测仪器进行检测。

对于本发明所述的超临界流体，其既可以作为超临界萃取中的萃取剂，也同时作为超临界流体色谱中的流动相。所述超临界流体为在临界温度和临界压力以上的条件下的物质的一种状态，该状态介于气体和液体之间。适用的超临界流体可以为超临界二氧化碳或超临界乙烷等。在本发明的一些实施方案中，超临界流动相选自超临界二氧化碳。操作温度和压力主要决定于所选用的超临界流动相。本发明中，当以超临界二氧化碳作为超临界流动相时，操作温度为31℃以上，优选为35℃以上，操作压力为7.3MPa以上，优选为7.5MPa以上。从超临界流体对番茄红素的溶解性、保留时间以及可操作性方面考虑，操作温度优选为40-70℃，操作压力优选为7.5-20MPa，进一步，所述操作温度优选为45-65℃，所述操作压力优选为12-16MPa。

对于本发明的所述检测器，原则上，没有特别的限制，只要是能够检测番茄红素的检测器均可以适用于本发明的检测方法。例如，检测器可以选自质谱检测器(MS)、光学检测器等，所述光学检测器例如可以为二极管阵列检测器(PDA)。在本发明一些优选的实施方案中，检测器优选为二极管阵列检测器。

在本发明一些具体的实施方案中，采用如下检测系统以执行基于“SFE-SFC-检测器”的检测方法。

如图1所示，该系统包括了超临界萃取装置、超临界流体色谱装置以及检测装置。并且，在检测装置之后设置有压力控制装置(背压控制器II)，以及在超临界萃取装置与超临界流体色谱装置之间设置有压力控制装置(背压控制器I)。

此外，通过与超临界萃取装置连接的超临界流体供给泵提供超临界流体以在所述超临界萃取装置中萃取番茄红素，并对超临界流体色谱提供流动相。在本发明一些优选的实施方案中，除了上述所提及的超临界流体供给泵以外，如图1所示的连接方式，检测系统中还可以具有改性剂供给泵以对超临界色谱的流动相供给改性剂。在一些具体的实施方案中，通过控制所述改性剂在超临界色谱流动相中的体积百分比，可以调整番茄红素在超临界流体色谱柱上的保留时间以及在SFE中的萃取效率。

对于改性剂的种类，可以使用具有极性的溶剂。在一些具体的实施方案中，所述改性剂可以选自醇类物质、有机酸(盐)或腈类物质。对于醇类物质，可以使用甲醇、异丙醇等各种脂肪醇；对于有机酸(盐)，可以使用甲酸铵等；对于腈类物质，可以使用乙腈等作为改性剂。对于上述改性剂，可以使用一种或者同时使用两种或以上的混合改性剂。对于改性剂的用量(相对流量)，通常情况下可以为超临界色谱流动相的1％-50％。对于改性剂的供给，可以为连续或半连续供给，也可以提供梯度供给。

对于超临界萃取装置的萃取条件，可以通过控制萃取压力、萃取温度以及萃取方式来进行优化。从提高萃取效率的方面考虑，对于萃取压力，取决于仪器，可以为10-20MPa，优选为13-15.5MPa；对于萃取温度，可以为40-70℃，优选为50-65℃；对于萃取方式可以包括静态萃取和/或动态萃取，在一些具体的实施方案中，可以通过改变静态萃取和动态萃取的时间来调节萃取方式。所述静态萃取为超临界流体在SFE的萃取罐中对样品进行静态萃取。所动动态萃取为使用超临界流体对SFE萃取罐中的样品进行冲洗，将被萃取的物质冲洗到SFC色谱柱的柱头位置。

在本发明的一些实施方案中，对于超临界萃取装置的萃取效率，可以为35％以上，优选为40％以上，进一步优选为42％以上。此外萃取效率最大值也与样品前处理等因素有关，一些情况下也可达到70％以上。

所述萃取效率可以通过如下方法确定：

具体地，将0.1mg番茄红素标准品加入到提取容器中并进行SFE提取四次，在此期间认为所有番茄红素都被提取出来。通过将番茄红素的四个峰面积相加来计算总峰面积。使用等式1计算萃取效率：

萃取效率＝(第一萃取峰面积)/(总萃取峰面积)×100％………(等式1)

本发明中，使用超临界流体色谱柱对于从超临界萃取装置萃取得到的番茄红素进行捕集和分离。对于超临界色谱柱，通常选择那些能够在检测条件下对番茄红素的保留时间超过10分钟的色谱柱。检查保留时间非常重要。原因是在线SFE-SFC-PDA系统中使用同一个色谱柱作为捕集和分离色谱柱。在SFE萃取过程中，萃取的分析物被捕获到色谱柱的顶部(头部)。为了限制SFE萃取过程中分析物的洗脱，并由此导致不满意的峰形和/或分析物的损失，色谱柱必须非常好地保留分析物。优选的，这些色谱柱对番茄红素的保留时间为10分钟以上，更优选为10-15分钟。在一些优选的实施方案中，本发明的超临界色谱柱被置于柱温箱中，以方便的进行温度控制。对于超临界流体色谱柱，本发明优选使用填充柱中颗粒的平均粒径大于3μm的色谱柱，例如C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)。实际使用时，当填充柱中填充物颗粒平均粒径在3μm以下时，虽然单独使用SFC进行分离时，检测器的检测峰峰型是合适的，但当将SFE与SFC联用时，峰型有恶化的趋势。

此外，本发明中，通过上述的两个压力控制装置BPR(背压控制器I和背压控制器II)的调整来调整分流比。通常情况下，为了是基于SFE的萃取尽快的进行，因此需要加快SFE中超临界流体的流速，但过高的流速和流量直接进入SFC时，可能会导致提取的化合物超过捕集柱的捕集能力。因此，当在线连接SFE和SFC时，部分提取的化合物需要在被捕集到色谱柱之前进行分流。所述分流比可以理解为从超临界萃取装置萃取的番茄红素进入超临界流体色谱的比率。通过分流比的控制使得合适量的番茄红素进入到超临界流体色谱柱中，另一部分通过背压控制器排除出系统。

对于分流比的确定，可以参照现有技术所记载的方式而进行(例如“Liang，Liu，Zhong，Shen，Yao，Huang，et al.，2018”)。简而言之，本发明的一些优选的实施方式中，分别设定BPR I和BPR II的压力，使用自动进样器注射样品，并使用以下等式2计算分流比。

分流比(％)＝(分流后经过BPR II后测试的峰面积)/(全部测试样品测试得到的峰面积)×100％….(等式2)

从上述等式可以看出，分流比率为100％意味着所有提取的化合物都被送到捕集柱并进行分析，而0％表示没有提取的化合物被送到捕集柱。过低的分流比可能导致设备的低重现性，而高分流比可能导致色谱柱过载和分析物峰形不令人满意。在本发明的一些优选的实施方案中，分流比为3％-10％，优选为5％-8％。

<标准曲线的制备>

使用上述的基于SFE-SFC-检测器的在线检测方法对样品中的番茄红素进行检测前，可以预先制备供参照的标准曲线。

如前所述，适合与本发明上述在线检测方法的标准曲线可以通过以下方式进行制备。

基于SFE-SFC-检测器的标准曲线制备

在本发明的一个具体的实施方案中，提供了基于SFE-SFC-检测器的标准曲线制备方法和得到的标准曲线。

这样的标准曲线的制备使用与前述“基于SFE-SFC-检测器的在线检测的方法”部分中说明的SFE-SFC-检测器相同的检测系统和检测条件。

通常，通过如上文所述的内容，确定超临界萃取的条件、分流比、超临界流体色谱的保留时间等参数(优化参数组)。之后，可以通过加入多个不同番茄红素含量的标准样品从而得到不同的PDA检测峰面积，并对检测峰面积与标准品中番茄红素的含量进行关联，制作标准曲线。

对于标准曲线的制备方法，没有特别限定，可以使用通常的归一法对含量-峰面积进行线性拟合。

当得到了标准曲线之后，可以按照“基于SFE-SFC-检测器的在线检测的方法”中的检测方法对新的待测样品在与上述优化参数组相同条件下进行测试，通过将得到的测试峰面积与标准曲线进行对比而确定测试样品中番茄红素的含量。

显然，本发明所提供的上述在线检测方法中，只要预先确定了上文所述的优化参数组，就可以在确定的优化参数组条件下直接进行在线测试。需要说明的是，一旦超临界萃取条件发生变化，则需要重新确定上述参数组。因此，该标准曲线适用于测试具有类似物理、化学性状的样品的系列检测。

基于SFC-检测器的标准曲线制备

在本发明另外的一些实施方案中，提供了基于SFC-检测器的标准曲线制备方法和得到的标准曲线。

在制备该标准曲线时，在一些具体的实施方案中，可以采用如图2所示的装置，该系统包括了自动进样器、超临界流体色谱装置以及检测装置。并且，在检测装置之后设置有压力控制装置(背压控制器II)。

对于超临界流体供给泵、任选的改性剂供给泵、超临界流体色谱、检测器与上文所述内容可以相同。

对于基于SFC-检测器的标准曲线可以通过如下方式来制备：制备不同含量的含有番茄红素的标准溶液加入到自动进样器中，分别进行检测，得到不同的检测峰面积，并将含量和峰面积进行关联，通过归一化的方法做出番茄红素含量-峰面积的标准曲线。

获得了标准曲线之后，使用上文所述的基于SFE-SFC-检测器的在线检测的方法对待测样品进行测量(也可以视为将制备标准曲线的检测系统中的自动进样器替换为SFE装置以及在SFE与SFC之间增加增设背压控制器I，以对进入SFC的流体进行分流)，获得测试数据(峰面积)后，与标准曲线进行对比得出番茄红素的测试含量。

此时再确定SFE装置中的萃取效率以及SFC前的分流比。

那么待测样品中的番茄红素的含有量通过以下等式3计算得到：

番茄红素含量＝测试含量/萃取效率/分流比(等式3)

使用基于SFC-检测器的方法制备标准曲线是比较快速的，因为在制备标准曲线时不用考虑萃取效率或者分流比等因素。但使用该标准曲线应对基于SFE-SFC-检测器的在线测量结果时，需要通过SFE的萃取效率以及系统的分流比将测试含量转换为实际含量。因此，使用基于SFC-检测器的标准曲线能够更好的应对需要经常检测物理、化学形状差异非常大的不同样品。

实施例

以下说明本发明的实施例，但本发明不限定于下述的实施例。

通过了该实施例验证了本发明提供的对于番茄红素的在线检测方法的有效性和分析的准确性。

<原料>

甲酸铵购自Aladdin(中国，上海)。甲醇(LC/MS级)购自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA，USA)。番茄红素标准品(纯度98％以上)购自Pu Xi Technology Co.Ltd(中国，北京)。超临界二氧化碳购自Green Oxygen Co.Ltd(中国，北京)。

用于方法实施和初步验证的番茄从超市购买，粉碎并立即使用。用于方法验证的番茄在延庆农场收获，该农场属于北京蔬菜研究中心。收获后，立即将0.5千克各种红熟番茄样品运送到实验室。将番茄洗涤，切成小块，然后使用冷冻干燥仪器(Biocool，Pilot10-15M)冷冻干燥。将冷冻干燥的材料用咖啡磨研磨成粉末，然后在-20℃下储存用于进一步分析。

番茄红素标准溶液：通过将1mg番茄红素溶解在1mL二氯甲烷中并在-30℃下在冰箱中储存来制备番茄红素储备溶液。每两周制备一次新鲜原液以避免降解。

<设备>

使用具有光电二极管阵列(PDA)检测器(Shimadzu Corp.Kyoto，Japan)的NexeraUC系统进行在线SFE-SFC分析。超临界CO₂用作萃取溶剂，甲醇含有0.1％甲酸铵作为改性剂。使用具有二极管阵列检测器的XX(LC-20A系统)(Shimadzu Corp.Kyoto，Japan)进行HPLC分析。

<作为对比的基于HPLC分析方法>

将0.1g冷冻干燥的样品放入棕色玻璃瓶中以排除光。加入10毫升含有0.05％(w/v)丁基化羟基甲苯(BHT)的四氢呋喃(THF)以提取番茄红素。将混合物涡旋1分钟，然后离心(12000g，5℃，10分钟)。将上清液回收到25ml烧瓶中。再次用10ml含0.05％(w/v)BHT的THF加入残余固体。将混合物涡旋1分钟，保持搅拌30分钟，然后离心(12000g，5℃，10分钟)。将第二澄清的THF提取物与第一澄清的THF提取物合并到25ml烧瓶中，并用THF升温至25ml。

使用具有二极管阵列检测器的HPLC(Shimadzu，日本)，并且在25℃下在HPLC柱C18(5μm，250mm×4.6mm)上进行分离。在等度条件下，以1.0ml/min的流速，用甲醇/THF(95/5)作为洗脱液进行分离。在450nm处读取吸光度。通过将保留时间和光谱与标准进行比较来完成样品中番茄红素的鉴定。

<SFE-SFC-PDA的在线检测方法条件的优化>

SFC色谱柱的选择

通过比较番茄红素的保留时间来选择捕获柱。具体地，将5μL的100μg/mL的番茄红素标准溶液注入SFC-PDA(Shimadzu，Kyoto，Japan)中并在柱上分离。流动相A是超临界CO₂，B是含0.1％(w/v)甲酸铵的甲醇。流速为3mL/min，在472nm处监测吸光度。流动相的梯度程序如下：0分钟，2％；11分钟，10％；14分钟，30％；17分钟，40％；17:10分钟，2％。当番茄红素的保留时间超过10分钟时，选择柱用于在线系统中的进一步使用。

在该研究中，将具有100μg/mL的5μL番茄红素标准溶液用自动进样器注射到SFC-PDA系统(Shimadzu，Tokyo，Japan)中(图2)。通过柱用超临界CO₂和甲醇(含有0.1％(w/v)甲酸铵)作为流动相洗脱分析物。测定番茄红素在柱上的保留时间。检查保留时间非常重要。原因是在线SFE-SFC-PDA系统中使用相同的色谱柱作为捕集和分离色谱柱。在SFE萃取过程中，萃取的分析物被捕获到色谱柱的顶部。为了限制SFE萃取过程中分析物的洗脱，这可能导致不满意的峰形和/或分析物的损失，色谱柱必须非常好地保留分析物。因此，本发明中要求SFC对番茄红素的保留时间为10分钟以上。

因此，在该研究中，选择具有番茄红素保留时间长于10分钟的C18柱(250mm×4.6μm，5μm)。

SFE超临界萃取效率

提取参数如表1所示。为了优化，一次改变单个参数(表1)。基于提取效率的比较确定最佳提取条件。具体地，将0.1mg番茄红素标准品加入到提取容器中并进行SFE提取四次，在此期间认为所有番茄红素都被提取出来。通过将番茄红素的四个峰面积相加来计算总峰面积。使用上述等式1计算提取效率。

表1：超临界萃取条件

上述数值是重复实验的平均值±平均值的SD％

上述萃取条件的考察是基于单因子的方法，并将其用于优化。目的是增加从提取容器中提取的番茄红素的量，其被指定为提取效率。研究表明，许多参数可能会影响SFE的提取效率。在这里，优化了萃取温度，萃取时间和萃取循环次数。

所有实验均在15MPa的萃取压力下进行。萃取温度设定为40℃。单个提取循环包括两种提取模式，静态和动态。静态和动态提取的时间分别设定为2和3分钟。使用单一提取循环的初步实验显示不令人满意的提取(数据未显示)，因此进行了三次提取循环(表1)。得到的番茄红素的提取效率达到36.2±8.2％(表1)。此外，研究还表明，高温可能导致番茄红素降解。结果，我们将萃取温度从40℃提高到60℃，萃取效率达到42.2±5.1％(表1)。在升高温度后，将动态提取时间改变为4分钟，并且提取效率提高至47.0±7.3％(表1)。

结果表明每个SFE提取因子之间的相互作用是复杂的。将萃取温度控制在60℃左右，可以提高提取效率。

分流比的确定

如前所述确定分流比。简而言之，BPR I设定为15MPa，而BPR II设定为15.1MPa至13.0MPa(表2)。使用自动进样器注射样品(图2)。使用上述等式2计算分流比。

表2：SFE-SFC体系的分流比

a：上述数值是一式三份实验的平均值±平均值的SD％。每个实验通过连续注射进行6次。

为了在短时间内将提取的化合物从萃取容器转移到捕集柱，可以使用5mL/min的高流速进行萃取。这可能导致提取的化合物超过捕集柱。因此，当在线连接SFE和SFC时，部分提取的化合物需要在被捕集到色谱柱之前进行分离。分流比率为100％意味着所有提取的化合物都被送到捕集柱并进行分析，而0％表示没有提取的化合物被送到捕集柱。

这里使用的在线SFE-SFC系统采用两个BPR来控制分流比，其中BPR I用于控制超临界CO₂的萃取压力，而BPR II用于分流比调节。在该研究中，BPR I设定为15MPa，并且BPRII从13调节至15.1MPa。

如表2所示，当BPR II的压力从15.1MPa降至13.0MPa时，分流比从3.7％增加到34.4％。研究表明，低分流比可能导致设备的低重现性，而高分流比可能导致色谱柱过载和分析物峰形不令人满意。

初步结果显示，当BPR II保持在14.8MPa时，认为番茄红素被捕获在柱上。因此，在该研究中，当BPR II为14.8MPa时，使用6％的分流比。

样品状态对于萃取效率的影响

使用在线SFE-SFC-检测器系统分析番茄红素的一个优点是样品制备简单，快速和有选择性。当使用在线SFE-SFC-检测器系统时，将番茄样品粉碎并直接添加到提取容器中。相反，传统方法应用溶剂萃取，纯化和旋转蒸发，其消耗大量有机溶剂并且非常耗时且费力。

西红柿是富含水的样品。尽管每种样品的含水量不同，但通常约为90％。

研究表明，SFE萃取系统中水的存在会显着影响萃取效率。例如，如果有水，化合物可能会沉淀出来，特别是对于极性化合物。这可能导致提取效率低。相反，如果没有水并且提取材料被压实得太密集。这可能导致超临界二氧化碳渗透难以溶剂化分析物。此外，在线SFE-SFC-检测器系统中使用的萃取容器可容纳1g分析物。由于如此少量，在重复样品中难以控制水含量，导致相对低的再现性。

在该研究中，已经检查了三种用于样品制备的处理以控制水含量。处理I直接将1克粉碎的新鲜番茄与1克吸收剂混合。对于处理II，将0.5mL水加入1g粉碎的新鲜样品中，然后将样品与1g吸收剂充分混合。添加水的目的是使重复样品中的水含量标准化。处理III使用冷冻干燥的样品。对于每个样品，将0.1克番茄粉与5毫克无水硫酸钠充分混合。使用无水硫酸钠作为分散剂，使番茄粉在容器中均匀分布。在优化的SFE条件下进行所有实验一式三份。

如图3所示，处理I具有最低的提取效率，而处理III具有最高的提取效率。合理的是，处理III达到了高提取效率，因为它除去了水并且样品在容器中相对不紧密。重复样品之间的相对标准偏差百分比(RSD％)显示为误差条。RSD％小表明重复性高。处理III具有最小的RSD％，表明冷冻干燥样品的提取效率是高度可再现的。

<两种标准曲线的制备>

基于SFE和SFC，制备了应用于SFE-SFC-PDA在线检测的两种标准曲线(基于SFE-SFC-PDA以及基于SFC-PDA)。并在线分析冻干番茄样品中的番茄红素。对于任一种标准曲线制备时，番茄红素在SFC上的保留时间基本上是一致的。

对于基于SFC-PDA的方法，通过SFC-PDA用番茄红素标准溶液制备标准曲线，如表3和图4(A)所示。曲线的回归系数(r2)为0.9843。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为5μg/mL和15μg/mL。基于SFC-PDA的方法，番茄红素含量可使用上述等式3计算。

该方法的优点是SFE的优化不会影响校准结果。但是，可能需要定期重新检查分流比测量以及提取效率。此外，在提取量超过标准曲线的线性范围的情况下，需要估计装载在容器中的样品量。

对于基于SFE-SFC-PDA的方法，还使用在线SFE-SFC-PDA的提取容器进行标准曲线，如表3和图4(B)所示。曲线的回归系数(r2)为0.9903。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为1μg和2μg。该方法将SFE单元作为自动进样器处理以制作标准曲线，因此无需评估分流比和提取效率。但是，该方法需要首先优化SFE条件(如上所述)，这意味着如果使用新的SFE条件，则需要新的标准曲线。

表3两种标准曲线的分析效果

使用标准样品评估回收率。具体地，将15μg番茄红素标准品加入到0.01g冷冻干燥的番茄粉末中。SFE条件调整为最佳条件，实验进行5次，提取回收率达到84.2±7.7，重复实验的RSD％为9.2％。

<本发明方法与HPLC测试方法比较>

除上述使用基于SFE-SFC-检测器的检测方法通过两种标准曲线对样品进行定量分析以外，还进行基于溶剂萃取的HPLC分析以测量冻干番茄中番茄红素的量。结果显示在表4中。结果表明，使用本发明的在线检测方法时，基于两种标准曲线测量得到的番茄红素含量是相似的，但是比通过常规HPLC方法测得的番茄红素含量高1.2-1.5倍。

表4不同的含有番茄红素样品的检测

标准曲线1：基于SFE-SFC-PDA得到的标准曲线

标准曲线2：基于SFC-PDA得到的标准曲线

<结论>

传统上，溶剂萃取与HPLC结合用于番茄红素测量，但是该方法耗时，费力并且消耗大量有机溶剂。超临界二氧化碳被认为是有毒有机溶剂的绿色替代溶剂。在本发明中，开发了基于SFC和SFE的定量方法，使用在线SFE-SFC-PDA系统(Shimadzu Corp.Kyoto，Japan)，实验参数，如色谱柱选择，SFE条件，样品制备等进行了系统地优化。这是第一次建立定量在线SFE-SFC-PDA分析方法。

产业上的可利用性

本发明的检测方法和检测系统可用于番茄红素的快速分析。

Claims

1.一种在线检测番茄红素的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取的萃取效率为35％以上；所述萃取的压力为10-20MPa；所述萃取的温度为40-70℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测样品为干燥过的样品，优选为经过冷冻干燥的样品。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述检测器选自质谱检测器或者光学检测器。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在检测中，超临界流体色谱对于番茄红素的保留时间为10分钟以上；所述超临界流体色谱的色谱柱中颗粒的平均粒径大于3μm。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超临界流体色谱中的流动相包括超临界二氧化碳以及作为改性剂的极性溶剂。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过在超临界色谱柱前以及在检测器后设置的两个压力控制器，调整从超临界流体萃取后进入到超临界流体色谱的样品量的分流比为3％-10％。