CN103616467B

CN103616467B - 一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法

Info

Publication number: CN103616467B
Application number: CN201310610823.1A
Authority: CN
Inventors: 谭贵良; 赵天珍; 罗北照; 袁秀金
Original assignee: ZHONGSHAN SUPERVISION TESTING INSTITUTE OF QUALITY AND METROLOGY GUANGDONG
Current assignee: ZHONGSHAN SUPERVISION TESTING INSTITUTE OF QUALITY AND METROLOGY GUANGDONG
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103616467A

Abstract

本发明公开了一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，该方法通过C₁₈固相萃取柱萃取净化后，用气相色谱-质谱法(GC-MS)进行检测，可快速准确地测定肉制品中所残留镇静剂的种类及含量，包括有地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂，适合腊肠这类复杂基质肉制品中多种镇静剂残留的检测，该方法具有检测限低、快速准确、操作简便以及检测成本经济的优点，可在检测机构中推广应用。

Description

一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法

【技术领域】

本发明涉及检测肉制品中残留药物的方法，尤其是一种用于检测肉制品中残留地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇定剂的方法。

【背景技术】

镇静剂(Sedatives)是指能缓和激动，对中枢神经系统有抑制作用，起到减轻或消除动物狂躁不安，恢复安静的一类药物。常用的药物有：苯二氮草类的地西泮、硝西泮、奥沙西泮，吩噻嗪类的氯丙嗪、异丙嗪、奋乃静，以及安乃近、苯巴比妥等。该类药物除具有镇静作用外，很多还是一类生长促进剂，被用于动物饲料添加剂，当猪等动物吃了添加上述镇定剂的饲料时，使其嗜睡少动、促进其快生长，且可其改变肉质。这些药物可对人体中枢神经系统造成不良反应，我国及许多其他国家已将此类药物列为禁用药物。但是近年来一些商贩在畜禽饲养及运输过程中擅自非法使用镇静剂，导致畜禽产品中该类药物的残留，造成畜禽产品存在安全隐患，严重威胁人们的身体健康。

常见用于检测肉制品所残留镇静剂的方法主要有：酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等，目前在镇定剂类药物残留检测方面用得最多的是LC-MS，该检测方法被农业部等部门定为标准方法使用，食品方面所涉及的检测样本主要为猪肉和猪肾。但由于LC-MS所涉及的设备昂贵，目前该方法还无法在大部分检测实验室普及使用。

本发明即针对现有技术的不足而研究提出。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，该方法通过C₁₈固相萃取柱萃取后，用气相色谱-质谱法(GC-MS)进行检测，可快速准确地测定肉制品中所残留镇静剂的种类及含量，包括有地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂。

为解决上述技术问题，本发明一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，采用如下技术方案：

本发明一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，包括步骤如下：

1)样品提取：

A、称取一定量肉制品样品放入具塞离心管中，加入无水硫酸钠和提取溶剂,加入无水硫酸钠的重量为0.4～0.6倍肉制品样品的重量，加入的提取溶剂与肉制品样品V/W为5～7；

B、将A步骤所得的混合物在振荡器上进行振荡，得到混合物；

C、在B步骤中加入与所得混合物V/W为0.5的氨水-乙腈溶液，在涡旋混合器中混匀；

D、将C步骤所得混合物在离心机进行离心处理，得到上层清液和剩余残留物；

E、提取D步骤所得的上层清液；

F、将向D步骤所得剩余残留物加入与肉制品样品V/W为3～5的乙酸-乙腈溶液，在涡旋混合器中涡旋混匀，得到上层清夜；

G、提取F步骤所得的上层清夜，并与E步骤提取的上层清液合并；

H、将G步骤所得上层清液在蒸馏瓶中加热蒸发至干，得到残留物；

I、将H步骤所得残留物加入K₂HPO₄缓冲溶液，充分溶解，得到检测样品溶液；

2)样品净化：

J、依次用甲醇和蒸馏水将C₁₈固相萃取柱活化；

K、将I步骤所得检测样品溶液上样至C₁₈固相萃取柱；

L、将步骤K的C₁₈固相萃取柱用洗脱溶剂洗脱，并收集洗脱液于离心试管中；

M、将L步骤所收集的洗脱液用气体吹干，得到残留物；

N、将M步骤所得残留物用甲醇定容，得到样品净化溶液；

3)样品检测分析：

O、将N步骤所得样品净化溶液移入进样瓶，用气质联用仪(GC-MS)进行分析，得出检侧数据，所述气质联用仪(GC-MS)的色谱条件为：毛细管色谱柱DB-5MS为30m×0.25mm×0.25μm，载气为高纯氦气He，流速为1.1mL/min，不分流进样，进样量为1μL，进样口温度为300℃，柱温以10℃/min升温至300℃，柱温为50℃时，保温为1min，柱温为300℃时，保温为4min，传输线温度280℃，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子轰击电离源EI为70eV，质量扫描范围50～650amu；所述气质联用仪(GC-MS)的质谱条件为：将N步骤所得溶液进行SCAN全扫描和SIM选择离子扫描。

所述步骤A中提取溶剂为乙腈、氨水-乙腈和乙酸-乙腈，所述步骤L中洗脱溶剂为甲醇-丙酮溶液。

所述甲醇-丙酮溶液为甲醇、丙酮按1:1的体积比配制。

所述步骤B中振荡时间为1h，所述步骤C中涡旋混合器涡旋混匀为1min，所述D步骤中离心在4℃条件下进行，所述离心机的转数为8000r/min，离心时间为5min。

所述C步骤中氨水-乙腈溶液为氨水、乙腈按体积比1:99配制，所述F步骤中乙酸-乙腈溶液为乙酸、乙腈按体积比1:99配制。

所述I步骤K₂HPO₄缓冲溶液的pH＝7.0。

所述J步骤中C₁₈固相萃取柱为3mL、500mg，所述M步骤中吹干洗脱溶剂是在40℃下用氮气吹干。

本发明一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，该方法通过C₁₈固相萃取柱萃取后，再用气相色谱-质谱法GC-MS进行检测，可快速准确地测定肉制品中所残留镇静剂的种类及含量，包括有地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂，尤其适合腊肠这类复杂基质肉制品中多种镇静剂残留的检测，该方法具有检测限低、快速准确、操作简便以及检测成本经济的特点，可在检测机构中推广应用。

【附图说明】

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，其中：

图1为地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的特征离子、保留时间和定量离子图表。

图2为甲醇作为提取溶剂对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的总离子流图。

图3为乙酸乙酯作为提取溶剂对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的总离子流图。

图4为乙腈作为提取溶剂对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的总离子流图。

图5为采用液液萃取净化方法对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的总离子流图。

图6为采用C₁₈固相萃取柱萃取净化方法对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的总离子流图。

图7为不同体积比的甲醇—丙酮溶液作为洗脱溶剂对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的洗脱效果图。

图8为地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的检出限和定量限图表。

图9为地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的回收率图表。

图2、图3、图4、图5和图6中：苯巴比妥1，异丙嗪2，奥沙西泮3，地西泮4，艾司唑仑5，阿普唑仑6，三唑仑7。

图7中：地西泮◆，奥沙西泮系列■，阿普唑仑▲，三唑仑×，艾司唑仑*，苯巴比妥●，异丙嗪。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法的实施方式作详细说明。

本发明一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，提供实施例如下：

1、检测仪器及设备：

7890A/5975I气质联用仪GC-MS，毛细管色谱柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，C₁₈固相萃取柱(3mL，500mg)，振荡器，离心机，IKA涡旋混合器。

2、试剂：

标准品地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥、异丙嗪，含量均大于99.0％，将上述7种药物均配成1000mg/L的无水甲醇标准储备液。

pH＝7.0的K₂HPO₄缓冲溶液：称取一定量K2HPO4溶解在蒸馏水中，用磷酸调pH至7.0。

甲醇、乙腈、丙酮为农残级，其他试剂为国产分析纯。

3、样品提取：

称取腊肠5.0g于具塞离心管中，加入适量3.0g无水硫酸钠和30mL乙腈，在振荡器上振荡1h；之后加入15mL氨水-乙腈溶液(1:99,v/v)，涡旋混匀1min；在4℃，8000r/min离心5min，得到上层清液和剩余残留物，收集层上清液，剩余残留物加入15mL乙酸-乙腈溶液(1:99,v/v)，涡旋混匀1min，取上层清液与前次提取的上层清液合并；然后将上层清液倒入100mL蒸馏瓶，将其中的乙腈加热蒸发至近干，得到待检测固体，并加入10mL pH为7.0K₂HPO₄缓冲溶液，充分溶解后，得到检测样品溶液。

4、样品净化：

C18固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL蒸馏水活化，然后将检测样品溶液上样至C18固相萃取柱，用6mL甲醇—丙酮溶液(1:1，v/v)作为洗脱溶剂洗脱，并收集洗脱液于10mL离心试管中，将洗脱液在40℃下用氮气N2吹干，得到残留物，之后将该残留物用甲醇定容至1mL，得到样品净化液。

5、样品检测分析：

将样品净化液移入进样瓶，用气质联用仪GC-MS进行分析，得出检测数据。

7890A/5975I气质联用仪GC-MS的色谱条件：毛细管色谱柱DB-5MS为30m×0.25mm×0.25μm，载气为高纯氦气，流速为1.1mL/min，不分流进样，进样量1μL，进样口温度300℃，柱温以10℃/min升温，当柱温升至50℃时，保留1min，当柱温升至300℃时，保留4min，传输线温度280℃，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子轰击电离源EI为70eV，质量扫描范围50～650amu。

7890A/5975I气质联用仪GC-MS的质谱条件：对经过C₁₈固相萃取柱萃取净化的样品溶液进行SCAN全扫描和SIM选择离子扫描。

标准品地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种药物均配成的无水甲醇标准储备液，上述7种镇静剂的特征离子、保留时间及定量离子如图1所示。

对于不同提取溶剂，其提取效果不一样。通过图2、图3和图4对比，可知甲醇、乙酸乙酯和乙腈三种有机溶剂对地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂的提取效果。

可以看出，在其他条件相同的情况下，用甲醇提取时的共萃取物较多，干扰大，且只能同时提取到苯巴比妥1，异丙嗪2和奥沙西泮3三种镇定剂，回收率较低。

同样以乙酸乙酯提取时的提取效果也不尽理想，只能提取苯巴比妥1，异丙嗪2，奥沙西泮3和地西泮4四种镇定剂。

而乙腈作为提取溶剂时，提取效果最佳，可有效提取苯巴比妥1，异丙嗪2，奥沙西泮3，地西泮4，艾司唑仑5，阿普唑仑6和三唑仑7七种镇定剂，杂峰干扰少，使提取的镇定剂得到了很好的分离。

本发明的提取溶剂可以为乙腈、氨水-乙腈和乙酸-乙腈，本发明优先采用乙腈作为提取溶剂。

图5和图6分别为采用液液萃取和C₁₈固相萃取柱萃取的两种净化方法的净化效果。可以看出，由于检测样品腊肠中糖和脂肪含量较高，基质复杂，选择通过有机溶剂提取，再通过C₁₈固相萃取柱萃取净化，其净化效果好，而且对毛细管色谱柱DB-5MS、离子源影响不大。经过C₁₈固相萃取柱萃取净化后，目标峰附近干扰杂质较少，无明显干扰峰影响，且使得上述七种待测的镇定剂均能得到很好的分离。

故本发明采用C₁₈固相萃取柱来萃取净化处理，以测定肉制品中残留地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂。

C₁₈固相萃取柱是一种高分子多孔聚合物，对弱极性的物质有较强的吸附能力。试验中比较了正己烷、甲醇以及丙酮溶液的洗脱净化效果。综合考虑溶剂用量和溶剂毒性，本发明优先选择甲醇-丙酮溶液作为洗脱剂。而不同比例的甲醇-丙酮洗脱上述7种镇定剂的洗脱效果如图7所示，图中地西泮◆，奥沙西泮系列■，阿普唑仑▲，三唑仑×，艾司唑仑*，苯巴比妥●，异丙嗪。可知，当含50％甲醇(v/v)的甲醇-丙酮溶液作为洗脱剂时，对上述7种镇定剂的回收率均达到最高水平。

故本发明将体积比配制1:1的甲醇-丙酮溶液作为洗脱溶剂。

分别准确称取地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪7种镇静剂标准品各100.0mg，分别加入100mL容量瓶中，用甲醇定容，得到上述镇静剂浓度为1000mg/L的标准储备液，然后用甲醇稀释至一系列标准工作液，上机测定，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。上述七种镇静剂的检出限为0.02mg/L～0.082mg/L，相关系数均大于0.995，说明本发明方法适用于多种镇静剂药物的定量分析。

本发明方法的回收率和精密度验证：分别在5g空白腊肠样品中加入不同量的标准品，按前述的样品处理方法处理，气相色谱-质谱法平行测定5次，分别计算其回收率和相对标准偏差RSD。从图9可以得出，上述7种镇定剂的回收率在63.20％～88.23％之间，相对标准偏差在7.02％～16.89％之间，故本发明方法完全满足分析的要求。

本发明方法具有检测限低、快速准确、操作简便的特点，适合肉制品，特别是腊肠这类复杂基质中多种镇静剂残留的检测。

Claims

1.一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，包括检测残留在肉制品中的地西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、苯巴比妥和异丙嗪，其特征在于包括步骤如下：

1)样品提取：

A、称取一定量肉制品样品放入具塞离心管中，加入无水硫酸钠和提取溶剂,得到混合物1加入无水硫酸钠与肉制品样品W/W为0.4～0.6，加入的提取溶剂与肉制品样品V/W为5～7；

B、将A步骤所得的混合物1在振荡器上进行振荡，得到混合物2；

C、在B步骤中加入与B步骤所得混合物V/V为0.5的氨水-乙腈溶液，在涡旋混合器中混匀；

E、提取D步骤所得的上层清液；

2)样品净化：

J、依次用甲醇和蒸馏水将C₁₈固相萃取柱活化；

K、将I步骤所得检测样品溶液上样至C₁₈固相萃取柱；

M、将L步骤所收集的洗脱液用气体吹干，得到残留物；

N、将M步骤所得残留物用甲醇定容，得到样品净化溶液；

3)样品检测分析：

O、将N步骤所得样品净化溶液移入进样瓶，用气质联用仪(GC-MS)进行分析，得出检侧数据，所述气质联用仪(GC-MS)的色谱条件为：毛细管色谱柱DB-5MS为30m×0.25mm×0.25μm，载气为高纯氦气，流速为1.1mL/min，不分流进样，进样量为1μL，进样口温度为300℃，柱温以10℃/min升温至300℃，柱温为50℃时，保温为1min，柱温为300℃时，保温为4min，传输线温度280℃，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子轰击电离源EI为70eV，质量扫描范围50～650amu；所述气质联用仪(GC-MS)的质谱条件为：将N步骤所得溶液进行SCAN全扫描和SIM选择离子扫描。

2.按权利要求1所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征在于所述步骤A中提取溶剂为乙腈、氨水-乙腈和乙酸-乙腈，所述步骤L中洗脱溶剂为甲醇-丙酮溶液。

3.按权利要求2所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征所述甲醇-丙酮溶液为甲醇、丙酮按1:1的体积比配制。

4.按权利要求1所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征在于所述步骤B中振荡时间为1h，所述步骤C中涡旋混合器涡旋混匀为1min，所述D步骤中离心在4℃条件下进行，所述离心机的转数为8000r/min，离心时间为5min。

5.按权利要求1所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征在于所述C步骤中氨水-乙腈溶液为氨水、乙腈按体积比1:99配制，所述F步骤中乙酸-乙腈溶液为乙酸、乙腈按体积比1:99配制。

6.按权利要求1所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征在于所述I步骤K₂HPO₄缓冲溶液的pH＝7.0。

7.按权利要求1所述一种用于检测肉制品中多种镇定剂残留的方法，其特征在于所述J步骤中C₁₈固相萃取柱为3mL、500mg，所述M步骤中吹干洗脱溶剂是在40℃下用氮气吹干。