CN110426462B

CN110426462B - 一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法

Info

Publication number: CN110426462B
Application number: CN201910593144.5A
Authority: CN
Inventors: 缪小群; 张玉昆; 刘振先; 朱思华
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2019-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: CN110426462A

Abstract

本公开提供了一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚含量的方法，步骤包括：(1)取样品加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液涡旋振荡，超声处理后离心，移取上清液A另存，在剩余残渣中加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液涡旋振荡，超声处理后离心，将上清液B取出与上清液A合并，然后吹干，得到样品提取液残渣；(2)将提取液残渣进行复溶液涡旋振荡，加入C18、PAS和中性氧化铝，超声处理后离心，将上清液经滤膜过滤，得到待测样；(3)利用超高效液相色谱串联质谱仪检测待测样中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的含量。所述方法有效的解决了金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚同时检测时干扰多、回收率低的难题，并节约了成本，提高了工作效率。

Description

一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法

技术领域

本公开涉及食品安全领域，具体涉及一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法。

背景技术

随着社会快速进步人民生活水平得到了极大到的提高，动物性食品也逐渐成为日常生活的刚需。人们对动物性食品的市场需求，带动了食品性动物养殖量的扩增。规模化程度低下的养殖量盲目扩增导致了食品性动物疾病复杂化加上兽药市场监管的混乱，在利益的驱使下食品性动物从业者将人用抗病毒药物金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚等拿来给食品性动物食用，但这些药物并没有被批准用作兽用。

2005年，美国食品药物管理局(FDA)已经下令禁止把人类抗病毒药物滥用于畜禽中，与此同时我国农业部第560号公告也曾明令禁止抗病毒药物作为兽药使用。虽然抗病毒药属兽用禁用药物，但其在实际畜禽养殖中依然使用广泛，若饲养者不科学、不合理地使用该药物，易导致药物在畜禽机体内残留，不仅会对畜禽本身带来中毒，也会引起病毒耐药毒株的出现使抗病毒药物有效性降低，其耐药性也有转移扩散到人体的风险，对消费者的健康存在很大的隐患。保障畜禽产品安全，不仅有利于公众健康，而且可以大力促进我国进出口贸易快速健康发展。而抗病毒药物残留检测技术，将会成为最大程度上解决因使用抗病毒药物而产生的食品安全问题的重要研究内容。

但是，现有的畜禽肉中抗毒药残留检测方法比较老旧，检测项目与基质都比较单一，每一种抗病毒药检测方法都不尽相同，所使用的仪器，试剂均存在不同程度的差异，而且每一种方法的可检测范围及精密度也存在较大的差异，甚至一些抗病毒药至今还缺少检测方法，这样就造成了检测成本高，周期长，难度大等问题。因此如何提出一种简便快捷，成本节约，环境友好，结果可靠，且能适应多种基质中的多种抗病毒药物同时检测的高通量方法势在必行。

发明内容

本公开的目的是提供一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法，以快速检测动物源性食品中残留的金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法，所述方法的具体步骤包括：

(1)取样品加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液进行涡旋振荡，经超声处理后离心，移取上清液A另存，向移取上清液A后剩余残渣中加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液进行涡旋振荡，再次超声处理后离心，将其上清液B取出，与上清液A合并，然后吹干，得到样品提取液残渣；

(2)将提取液残渣进行复溶液涡旋振荡，然后加入C18、PAS和中性氧化铝基质固相萃取剂，超声处理后离心，将其上清液经滤膜过滤，得到待测样；

(3)利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的含量进行检测；

所述步骤(1)中三氯乙酸的浓度为2％，乙腈的浓度为99.9％，三氯乙酸与乙腈添加的比例为1:9。

所述步骤(1)中涡旋振荡的转速为2500r/min，振荡时间为1-10min，超声处理温度为30℃，超声处理时间为15-20min，离心的温度为4℃，离心的转速为5000-10000r/min，吹干的方法为氮气吹干，氮气吹干的温度为45℃。

所述步骤(2)中复溶液为0.1％甲酸水和甲醇1:1的混合物，复溶液的添加量为1ml，涡旋振荡的转速为2500r/min，振荡时间为1-3min，基质固相萃取剂C18、PAS和中性氧化铝的添加量分别为50mg、50mg和100mg，其中滤膜的滤孔直径为0.22μm。

本公开的有益效果是：提供了一种检测动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的方法，所述方法中所使用的C18可有效去除脂类、糖类等亲脂性杂质，PSA粉可去除基质中的脂肪酸和甾醇类干扰物，中性氧化铝通过路易斯酸碱作用、极性相互作用、和离子交换作用能有效的吸附基质中脂肪类杂质，将C18、PSA和中性氧化铝净化结合，再利用超高效液相色谱串联质谱仪，有效的解决了金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚同时检测时干扰多、回收率低的难题,并节约了成本，提高了工作效率。

附图说明

图1为标准溶液MRM色谱图。

图2为金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚在鸡肉中的MRM色谱图。

图3为金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚在猪肉中的MRM色谱图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留的检测

1.材料、仪器及溶液配制

1.1材料与仪器

API4000超高效液相色谱串联质谱仪(美国WHATERS公司)；HSC-24B氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展公司)；JW-3021HK低温超高速离心机(安徽嘉文)；BT25S电子天平(感量0.00001g，梅特勒-托利多仪器有限公司)；JJ500电子天平(感量0.001g，双杰测试公司)；MTV-100涡旋混合器(杭州奥盛仪器有限公司)。

甲醇(色谱纯，德国SccBayer公司)；乙腈(色谱纯，德国SccBayer公司)；甲酸(分析纯，天津科密欧化学试剂厂)；三氯乙酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；C18(粒径40μm，青云实验耗材有限公司)；PSA(美国Agilent公司)；中性氧化铝(国药集团化学试剂有限公司)；美金刚(纯度99.2％，美国Sigma公司)；金刚乙胺(纯度99％，美国Sigma公司)；金刚烷胺(纯度98％,中国食品药品检定研究所)。

1.2标准溶液的配制

准确称取金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚10mg(按实际含量折算，精确至0.0001)，分别置100ml容量瓶中使用甲醇溶解并稀释，配成0.1mg/ml外标储备溶液，-18℃下保存。

将上述配制好的抗病毒药物标准储备液中，各自取1.0ml的抗病毒药物标准储备液，甲醇定容至100ml，配制成1.0μg/ml的混标储备液，-18℃下保存。2.仪器的条件

2.1色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ HP(3μm，2.1×100mm)；流动相:A(0.1％甲酸溶液)，B(甲醇)；柱温：35℃；进样量：10μL梯度洗脱程序色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ HP(3μm，2.1×100mm)；流动相:A(0.1％甲酸溶液)，B(甲醇)；柱温：35℃；进样量：10μL梯度洗脱程序如表1。

表1梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	97	3
2.5	97	3
			4	50	50
8	40	60
			9	25	75
10	97	3
			11	97	3

2.2质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI+)；扫描方式：正离子扫描；气帘气压力(CurtainGas)：25psi；离子源喷雾电压(Ionspray Voltage)：5500V；碰撞气压力(CollisionGas)：5psi；离子源温(temperature)：550℃；喷雾气(GS1)压力：60psi；加热辅助雾化气(GS2)压力：55psi；检测方式：多反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)；监测离子对、锥孔电压和碰撞能量参数如表2。

表2目标化合物的多反应监测质谱参数

注：a为定量离子。

3.实验方法

用空白鸡肉、猪肉试样进行加标回收和精密度试验，添加水平均为3、5、15μg/kg的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚，混匀后静置使标准溶液被样品充分吸收(每个添加水平测定6次)，然后将鸡肉和猪肉分别切成小块后绞肉机绞碎，分别称取2g处理好的样品，精确至0.01g，于50mL聚丙烯具塞离心管中为检测样品，添加与检测样品同样水平量的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚外标标准液分别为阳性对照，分别在两份待测样品和阳性对照中加入2％三氯乙酸和99.9％乙腈(1:9)10mL，2500r/min涡旋震荡5min，超声15min后用冷冻高速离心机8000r/min，4℃离心5min取上清液于另一支50mL离心管中，在残渣中加入5ml提取剂重复上述操作，合并上清液；

利用分散固相萃取的方法，分散固相萃取剂主要有PSA、C18、中性氧化铝，将上述合并的猪肉待测样品、鸡肉待测样品和3种标准工作液阳性对照的上清液于45℃水浴氮吹至干，在吹干的离心管中加入1mL0.1％甲酸水和甲醇(1:1，V:V)的复溶液，2500r/min涡旋振荡3min进行复溶，复溶液的添加量为1mL，将复溶后的液体全部转移到加有50mgPSA、50mgC18、100mg中性氧化铝的2mL的离心管中，然后将上清液过0.22μm滤膜；

最后利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样进行检测待测样品和阳性对照滤液中的金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚，以保留时间和特征离子对定性,峰面积的内标曲线法定量。

4.结果分析

结果如表3，显示平均回收率为92.52％-99.08％之间,相对标准偏差(relativestandard deviation,RSD)为1.7％-4.12％，MRM色谱图分别见图1、图2和图3，其中图1(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚)为标准溶液MRM色谱图，图2(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚)为金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚在鸡肉中的MRM色谱图，图3(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚)为金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚在猪肉中的MRM色谱图，可以看出本公开所述的检测方法所检测出的鸡肉、猪肉中金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚的回收率高，且实验结果更加准确可靠,特别适用于实际样品的批量检测。

表3金刚烷胺金刚乙胺和美金刚的加标回收试验结果(n＝6)

Claims

1.一种检测猪肉和鸡肉中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚含量的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：

（1）取样品加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液进行涡旋振荡，经超声处理后离心，移取上清液A另存，向移取上清液A后剩余残渣中加入三氯乙酸与乙腈的重组溶液进行涡旋振荡，再次超声处理后离心，将其上清液B取出，与上清液A合并，然后吹干，得到样品提取液残渣；

（2）将提取液残渣进行复溶液涡旋振荡，然后加入C18、PAS和中性氧化铝基质固相萃取剂，超声处理后离心，将其上清液经滤膜过滤，得到待测样；

（3）利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的含量进行检测；

所述步骤（1）中三氯乙酸的浓度为2％，乙腈的浓度为99.9％，三氯乙酸与乙腈添加的比例为1:9；

所述步骤（2）中复溶液为0.1％甲酸水和甲醇1:1的混合物，复溶液的添加量为1m；

所述步骤（2）中基质固相萃取剂C18、PAS和中性氧化铝的添加量分别为50mg、50mg和100mg；

所述步骤（3）中，所述超高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ HP，其粒径为3μm，内径为2.1mm，柱长为100mm；流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：甲醇；柱温：35℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序如下：

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源，电离模式：ESI（+）；扫描方式：正离子扫描；气帘气压力：25psi；离子源喷雾电压：5500V；碰撞气压力：5psi；离子源温：550℃；喷雾气压力：60psi；加热辅助雾化气压力：55psi；检测方式：多反应监测；监测离子对、锥孔电压和碰撞能量参数如下：

其中，a为定量离子。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中涡旋振荡的转速为2500r/min，振荡时间为1-10min，超声处理温度为30℃，处理时间为15-20min，离心的温度为4℃，离心的转速为5000-10000r/min。

3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中吹干的方法为氮气吹干，氮气吹干的温度为45℃。

4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中涡旋振荡的转速为2500r/min，振荡时间为1-3min。

5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中滤膜的滤孔直径为0.22μm。