CN108445135A - 一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法 - Google Patents

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王杰
胡秋辉
李彭
方勇
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Abstract

本发明公开了一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法，利用反相固相萃取吸附剂结合LC‑Q‑TOF/MS快速检测动物源性食品中的兽药残留，包括下列步骤：（1）标准溶液的配制；（2）样品前处理；（3）LC‑Q‑TOF/MS检测。本发明采用0.1%甲酸乙腈提取、反相固相萃取柱净化，结合LC‑Q‑TOF/MS同时检测动物源性食品中多种兽药残留，与现有技术相比，本发明操作简便、筛查快速、定量准确、对于监控兽药残留危害具有重要意义。

Description

一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法，属于仪器检测技术领域。
背景技术
在现代化农业生产过程中，鱼肉、鸡肉、猪肉等动物源食品在饲养环节中往往在饲料中使用大量的抗生素来辅助预防和治疗疾病。但是，这些药物的滥用或者不恰当的使用可能会对人体造成潜在的危害。因此，建立一种快速、便捷、高通量的方法对满足日益增长的监管需求具有重要意义。
常用的兽药有10多类，上百种，同时检测多类兽药是残留分析工作者面临的巨大挑战。固相萃取法是目前兽药残留分析常用的前处理方法之一，它是根据各个待测物的理化性质不同，来选择适当的填料和萃取条件对提取液进行净化的方法。固相萃取法常用于检测微量或痕量的物质，但其也存在一些缺陷，例如基质较复杂时会导致回收率偏低、易堵塞填料等不足。质谱法发展至今已经成为农兽残检测的重要手段，高分辨质谱如飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS)基于其强大的定性筛查能力可以提供碎片离子的精确质量数，优良的定性能力可以大大减少假阳性结果的产生，在兽药残留检测领域备受青睐。
发明内容
本发明提供了一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法，利用高效液相色谱串联飞行时间质谱，用酸化乙腈作为提取溶剂，一种新型填料作为固相萃取剂，从而快速筛查动物源食品中的兽药残留。
本发明提供的方法包括下列步骤：
(1)标准工作溶液的配制：
将常见的兽药分别用乙腈定容配制成质量浓度为1000mg/L的单标准储存液，置于棕色瓶中，-20℃储藏。将上述储存液用乙腈稀释为1.0mg/L的混合标准储存液备用。
(2)样品前处理：
取2.5g猪肉于50ml离心管中，加入10ml 0.1%甲酸乙腈，剧烈震荡5min，40℃超声提取10min，在室温条件下，10000rmp离心5min；取上清液5ml加载到反相固相萃取柱中，保持一秒一滴的流速，收集流出液，过0.22μm滤膜上机待测；选用质量比为3:1的二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮作为固相萃取吸附剂。
(3)LC-Q-TOF-MS检测：
LC条件：流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；柱温：40℃，流速：0.3ml/min。进样量：5μl。
梯度洗脱程序：0~2min，5%B~20%B;2~7min，20%B~55%B;7~9min，55%B；9~13min，55%B~90%B；13~16min，90%B；16~16.5min，90%~5%B;16.5~21min,5%B。
Q-TOF-MS条件：
电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷雾电压：5500Ｖ；离子源温度：550℃ ；气帘气流速：35L/min；雾化气流速：55L/min；辅助加热气流速：55L/min；去簇电压：80V；CE能量35±15V。
本发明的有益效果：
一般情况下，建立兽药定量方法时采用三重四级杆质谱，然而对于前处理简便，基质复杂的情况下，三重四级杆选择性具有一定的局限性，可能会导致检测结果不准确。对于高分辨质谱而言，分子量是准确测量，具有很强的选择性。本发明使用一种由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成的反相固相萃取吸附剂，其良好的亲脂亲水性能够有效沉淀蛋白、去除盐及脂质等干扰，从而得到更稳定的数据结果，很好的降低了基质效应。本发明以复杂基质猪肉为例，采用TripleTOF® 5600+ 建立了多种兽药的快速定量分析方法，对于采用LC-Q-TOF/MS定量分析常规药物而言具有重要的参考意义。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
通过建立常见兽药的TOF/MS数据库和Q-TOF/MS数据库，将目标化合物的色谱质谱信息与TOF/MS数据库和Q-TOF/MS数据库的信息检索匹配，无需标准物作对照。在TOF/MS模式下，分别测定每种兽药标准物在指定色谱质谱条件下的保留时间，确定该化合物ESI源下的离子化形式，选择+H，+NH4，+Na，及化学式，得到每种化合物母离子的精确质量数，同位素峰分布和丰度比，将常见兽药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、同位素峰分布和丰度比信息导入到数据库CSV文件中，形成TOF/MS数据库。在数据采集界面依次输入所述TOF/MS数据库中兽药的母离子，在QTOF/MS模式下，对常见兽药进行碎片离子全扫描质谱图采集，优选其中离子信息丰富的碎片离子全扫描质谱图导入数据库软件文件中，并与对应的兽药信息相关联，建成Q-TOF/MS数据库。
本发明以复杂基质猪肉为例，采用亲脂亲水性固相萃取柱结合TripleTOF® 5600+建立了14种磺胺类及10种喹诺酮类兽药的快速定量分析方法。
实施例1
取2.5g猪肉于50ml离心管中，分别添加5μg/kg、10μg/kg和20μg/kg三个水平的24种兽药混合标准溶液，加入10ml 0.1%甲酸乙腈，剧烈震荡5min，40℃超声提取10min，在室温条件下，10000rmp离心5min；取上清液5ml加载到反相固相萃取柱中，保持一秒一滴的流速，收集流出液，过0.22μm滤膜，平行测定每个水平的加标样品各3次，供液质分析。
LC-Q-TOF-MS检测：
LC条件：流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；柱温：40℃，流速：0.3ml/min。进样量：5μl。
梯度洗脱程序：0~2min，5%B~20%B;2~7min，20%B~55%B;7~9min，55%B；9~13min，55%B~90%B；13~16min，90%B；16~16.5min，90%~5%B;16.5~21min,5%B。
Q-TOF-MS条件：
电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷雾电压：5500Ｖ；离子源温度：550℃ ；气帘气流速：35L/min；雾化气流速：55L/min；辅助加热气流速：55L/min；去簇电压：80V；CE能量35±15V。
实施例2 标准曲线及检测限
取2.5g猪肉于50ml离心管中，加入10ml 0.1%甲酸乙腈，剧烈震荡5min，40℃超声提取10min，在室温条件下，10000rmp离心5min；取上清液5ml加载到反相固相萃取柱中，保持一秒一滴的流速，收集流出液，浓缩至干后，加入1.00ml混合标准溶液复溶，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，配制3个水平的基质匹配混合标准溶液，以目标化合物定量离子的峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/L）为横坐标绘制曲线，相关系数r为0.9928～1.0000，线性关系良好。具体结果见表1。
表1 各组分基质匹配线性方程、相关系数（r）、检出限和定量限
实施例3 回收率实验
按实施例1方法，在空白猪肉样品中添加24种兽药混合标准溶液，加标量分别为5μg/kg、10μg/kg和20μg/kg的加标样品，按上述前处理方法及测定条件进行回收率试验，每个添加水平做3次平行测定。各化合物的平均回收率为72.38%~125.96%，相对标准偏差（RSD）为0.95%~15.45%，符合多残留分析的要求。
表2 猪肉空白样品中兽药加标回收率以及精密度（n=3）

Claims (3)

1.一种用于多种兽药残留快速筛查的检测方法，包括下列步骤：
(1)标准工作溶液的配制：
将常见的兽药分别用甲醇定容配制成质量浓度为1000mg/L的单标准储存液，置于棕色瓶中，-20℃储藏；将上述储存液用甲醇稀释为1.0mg/L的混合标准储存液现配现用；
(2)样品前处理：
取2.5g猪肉于50ml离心管中，加入10ml 0.1%甲酸乙腈，剧烈震荡5min，40℃超声提取10min，在室温条件下，10000rmp离心5min；取上清液5ml加载到反相固相萃取柱中，无需活化和平衡，保持一秒一滴的流速，收集流出液，过0.22μm滤膜上机待测；
(3)LC-Q-TOF-MS检测：
LC条件：流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；柱温：40℃，流速：0.3ml/min；进样量：5μl；梯度洗脱程序：0~2min，5%B~20%B;2~7min，20%B~55%B;7~9min，55%B；9~13min，55%B~90%B；13~16min，90%B；16~16.5min，90%~5%B;16.5~21min,5%B；
Q-TOF-MS条件：
电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷雾电压：5500Ｖ；离子源温度：550℃ ；气帘气流速：35L/min；雾化气流速：55L/min；辅助加热气流速：55L/min；去簇电压：80V；CE能量35±15V。
2.根据权利要求1所述的用于多种兽药残留快速筛查的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，选用质量比为3:1的二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮作为固相萃取吸附剂。
3.利用权利要求1或2所述方法检测鱼肉、鸡肉、猪肉中的兽药残留。
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