CN101865887A - 高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，目前还没有试剂用量少，检测成本低，检测灵敏度高的该类检测方法。本发明包括标准溶液制备、蜂王浆样品处理、标准曲线制作和蜂王浆样品检测工序；蜂王浆样品处理工序中，用2％的HClO₄以去除蜂王浆样品中的蛋白质及其他极性化合物，用1mol/L的NaOH将上清液的pH值调到8.8使其中的有机酸和醇溶蛋白盐化，提高极性防止被乙酸乙酯提取；最后将检测样液用高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得硝基咪唑类药物的残留量。本发明试剂用量少，检测成本低，检出限为：甲硝唑0.03μg/kg、洛硝哒唑0.06μg/kg和二甲硝咪唑0.03μg/kg。

Description

高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法

技术领域

本发明涉及一种测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，尤其是涉及一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，通过高效液相色谱串联质谱来测定蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量，最主要用于测定蜂王浆中甲硝唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑的残留量。

背景技术

硝基咪唑类药物(Nitroimidazles)的化学结构特点是分子中含有一个第五位接有硝基的咪唑环，硝基咪唑类药物具有广谱抗菌和抗原虫作用，是临床常见药物。

液相色谱-串联质谱方法作为确证方法已经广泛被国内外政府监督检验机构运用，液相色谱-串联质谱方法在灵敏度、准确度、检测效率上的独特优势，已成为目前最优越的残留检测仪器设备。但是，由于蜂王浆的基质复杂，样品净化困难，导致采用液相色谱-串联质谱方法来测定蜂王浆中硝基咪唑类药物的准确性不高，如GB/T 23407-2009是代表我国蜂王浆中硝基咪唑类药物检测技术最先进水平的检测标准，在GB/T 23407-2009中蜂王浆中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定就是使用液相色谱-质谱/质谱法，但是采用GB/T 23407-2009测定方法的检测限为2.0μg/kg。

目前，欧盟要求动物源性食品中药物残留不得检出，即在检测方法的检出限以下，欧盟对蜂王浆冻干粉中硝基咪唑类药物的检测限已经达到了2.5μg/kg，对蜂王浆中硝基咪唑类药物的检测限则已经达到了0.5μg/kg，如此以来，我国GB/T 23407-2009中的标准方法已不能满足要求，其他同类文献报道的方法也远远达不到上述检测限的要求，如由丁涛、徐锦忠、沈崇钰等发表在色谱2006年第24卷第4期第331-334页中的高效液相色谱-串联质谱联用测定蜂王浆中的三种硝基咪唑类残留也达不到上述检测限的要求。而且，由于蜂产品的样品基质成分复杂，为了减少基质效应，很多液相色谱-质谱/质谱法中都采用了固相萃取技术，如GB/T 23407-2009中蜂王浆中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定方法、SN/T 1928-2007进出口动物源性食品中硝基咪唑残留量检测方法、农业部1025号公告-22-2008动物源食品中4种硝基咪唑残留检测法以及由殷居易、谢东华、李佐卿等发表在分析测试学报年2007年第26卷第13期第385-388页中的HPLC-APCI(+)MS/MS分析动物源性食品中的硝基咪唑类药物残留量的方法中均采用了固相萃取技术，从而提高了检测成本。

综上所述，目前还没有一种方法简单，试剂用量少，检测成本低，检测的效率高、准确性好、灵敏度高的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种方法简单，试剂用量少，检测成本低，检测快速、灵敏、准确的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法的特点在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.4％的甲硝唑，纯度＞99.0％的洛硝哒唑，纯度＞98.5％的二甲硝咪唑，纯度＞98％的D3-二甲硝咪唑，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氢氧化钠和氯化钠，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈、乙酸铵和甲酸，水，初始流动相；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为3∶97；

该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为550℃，辅助加热气为65.00psi，干燥气为65.00psi，气帘气为10.00psi，碰撞气为5.00psi，电喷雾电压为4000.00V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Intersil ODS C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；

该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准液配制步骤：称取10mg甲硝唑、10mg洛硝哒唑和10mg二甲硝咪唑均置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为1000mg/L的混合贮备标准液；b、混合中间标准液配制步骤：取a中的混合贮备标准液100μl置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/L的混合中间标准液；c、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤：称取D3-二甲硝咪唑10mg用乙腈配制成浓度为10mg/L的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中的混合中间标准液分别用水配制成浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液、浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液，取c步骤中的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液用水配制成浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液；

所述蜂王浆样品处理工序如下：a、称取蜂王浆样品10g加入10ml水并混合均匀而制得蜂王浆样品液；b、将a中的蜂王浆样品液置于一号50ml离心塑料瓶中，再向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液100ul并混合充分，然后静置5min以上；再向一号50ml离心塑料瓶中加入30ml体积浓度为2％的HClO₄混合均匀并提取5min，然后将位于一号50ml离心塑料瓶中的液体在常温下超声破乳1-2min，再用体积浓度为2％的HClO₄定容至50ml而制得蜂王浆混合液；将蜂王浆混合液置于30℃下进行超声提取20min，然后在转速为3000rpm下离心5min而得到上清液；取上清液20ml置于二号50ml离心塑料瓶中，并用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入2.0g氯化钠，待氯化钠溶解后再加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min后，在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下进行氮气吹干，然后向15ml塑料离心管中加入1ml初始流动相并进行超声溶解，再向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并用力振摇充分混合去脂，然后在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；

所述标准曲线制作工序中，先称取6份重量均为10.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶、五号试剂瓶和六号试剂瓶中；然后向一号试剂瓶中加入10ml水并混合均匀而制得一号阴性蜂王浆液，向二号试剂瓶中加入100μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得二号阴性蜂王浆液，向三号试剂瓶中加入500μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得三号阴性蜂王浆液，向四号试剂瓶中加入1000μl浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得四号阴性蜂王浆液，向五号试剂瓶中加入500μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得五号阴性蜂王浆液，向六号试剂瓶中加入1000μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得六号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液、五号阴性蜂王浆液和六号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液的系列浓度为0μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；

所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量；该方法的检测定量限为甲硝唑0.1μg/kg、洛硝哒唑0.2μg/kg和二甲硝咪唑0.1μg/kg。

本发明所述蜂王浆样品处理工序中，向一号50ml离心塑料瓶中加入体积浓度为2％的HClO₄混合均匀并提取5min，以去除蜂王浆样品中的蛋白质及其他极性化合物。

本发明所述蜂王浆样品处理工序中，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，使上清液中的有机酸和醇溶蛋白盐化，以提高有机酸和醇溶蛋白的极性，使有机酸和醇溶蛋白不被乙酸乙酯提取。

本发明所述蜂王浆样品处理工序中，将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下采用氮吹仪进行氮气吹干。

本发明所使用的水均为双重蒸馏水。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：最主要用于测定蜂王浆中甲硝唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑的残留量，与固相萃取方法相比不增加溶剂用量，不采用固相萃取小柱，净化后的样品无色透明，在质谱图上无干扰，连续进样70次，三重四极杆串联质谱仪中的离子源气帘板仍保持干净。本发明的检出限为：甲硝唑0.03μg/kg、洛硝哒唑0.06μg/kg和二甲硝咪唑0.03μg/kg，线性相关系数在0.9994-0.9998之间，回收率在90.5％-127％之间，相对标准偏差在6.7％-11.4％，精密度良好，完全满足进口国对蜂王浆中硝基咪唑类药物残留限量的要求。

一般残留检测方法均会用到固相萃取技术，以提高样品净化程度，减少溶剂使用量，在测定蜂王浆中硝基咪唑类残留时本方法首次采用体积浓度为2％的HClO₄沉淀蛋白，蛋白沉淀彻底，离子抑制效应低，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，并在pH值为8.8的环境中用乙酸乙酯反萃取目标化合物，反萃取液容易吹干，净化样品方法独特，简便快速，不增加溶剂使用量，不使用磷酸缓冲溶液，同时大大提高了方法的灵敏度。

本发明建立了用液相色谱-串联质谱仪检测蜂王浆中硝基咪唑类药物残留量的方法，具有方法简单，快速，灵敏、准确，试剂用量少，检测成本低，节约人力，提高效率的特点，在三重四极杆串联质谱仪上获得了理想的灵敏度，方法检测定量限能够充分满足目前国外对蜂王浆中硝基咪唑类残留限量的要求。

附图说明

图1是本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加10μg/kg标准浓度时，通过LC/MS/MS测定蜂王浆中硝基咪唑类药物残留的总离子流图；

图2是本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加0.2μg/kg标准浓度时，通过LC/MS/MS测定蜂王浆中硝基咪唑类药物残留的提取离子流图。

具体实施方式

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例：

参见图1和图2，本实施例中的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序。

本实施例中所用到的原料包括甲硝唑，Metronidazole，CAS：[443-48-1]，纯度＞99.4％；洛硝哒唑，ronidazole，CAS：[7681-76-7]，纯度＞99.0％；二甲硝咪唑，dimetridazole，CAS：[551-92-8]，纯度＞98.5％；D3-二甲硝咪唑，Dimetridazole-d3，CAS：64678-69-9，纯度＞98％；为农残级的乙酸乙酯；为分析纯的氢氧化钠和氯化钠；为优级纯的正己烷；为液相色谱纯的乙腈、乙酸铵和甲酸；水；初始流动相。其中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑和D3-二甲硝咪唑均来自德国Dr.Ehrenstorfer公司；初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为3∶97；所使用的水均为双重蒸馏水。

本实施例中所用到的设备包括API3200三重四极杆串联质谱仪；安捷伦1200高效液相色谱仪：配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、Analyst数据处理软件；Sartorius BS224S分析天平；PHS-3C雷磁精密pH计；无锡市瑞江分析仪器有限公司生产的RJ-TDL-40B低速台式大容量离心机；Organomation N-EVAP 111氮吹仪。其中高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Intersil ODS C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm或相当者，进样量为20μl；三重四极杆串联质谱仪为API3200，三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度(TEM)为550℃，辅助加热气(GS₁)为65.00psi，干燥气(GS₂)为65.00psi，气帘气(CUR)为10.00psi，碰撞气(CAD)为5.00psi，电喷雾电压(IS)为4000.00V，离子化法为正离子模式。

本实施例中的标准溶液制备工序由混合贮备标准液配制步骤、混合中间标准液配制步骤、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤和临时标准使用液配制步骤组成，具体步骤如下：a、混合贮备标准液配制步骤：称取10mg甲硝唑、10mg洛硝哒唑和10mg二甲硝咪唑均置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成甲硝唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑的浓度均为1000mg/L的混合贮备标准液。b、混合中间标准液配制步骤：取a中的混合贮备标准液100μl置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/L的混合中间标准液。c、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤：先称取D3-二甲硝咪唑10mg置于10ml容量瓶中用乙腈定容至10ml制得浓度为1000mg/L的二甲硝咪唑氘代贮备液，再取100μl二甲硝咪唑氘代贮备液置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/L的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液。d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中的混合中间标准液分别用水配制成浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液、浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液，取c步骤中的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液用水配制成浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液。

本实施例中的蜂王浆样品处理工序如下：a、称取蜂王浆样品10g加入10ml水并混合均匀而制得蜂王浆样品液，如果本发明中采用蜂王浆冻干粉做为原料，则取蜂王浆样品5g加入10ml水并混合均匀而制得蜂王浆样品液，然后将蜂王浆样品液放置12-16h后再进行使用。b、将a中的蜂王浆样品液置于一号50ml离心塑料瓶中，再向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液100ul并混合充分，然后静置5min以上；再向一号50ml离心塑料瓶中加入30ml体积浓度为2％的HClO₄混合均匀并提取5min，然后将位于一号50ml离心塑料瓶中的液体在常温下超声破乳1-2min，本发明中所说的常温一般是指30℃以下的温度；位于一号50ml离心塑料瓶中经过超声破乳后的液体再用体积浓度为2％的HClO₄定容至50ml而制得蜂王浆混合液。然后将蜂王浆混合液置于30℃下进行超声提取20min，再使用离心机在转速为3000rpm下离心5min出现分层而得到上清液，然后将上清液进行过滤。取过滤后的上清液20ml置于二号50ml离心塑料瓶中，并用浓度为1mol/L的NaOH溶液将位于二号50ml离心塑料瓶中的上清液的pH值调节到8.8，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入2.0g氯化钠，待氯化钠溶解在上清液中后，再向二号50ml离心塑料瓶中加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min，然后使用离心机在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层。将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下采用氮吹仪进行氮气吹干，然后向15ml塑料离心管中加入1ml初始流动相并进行超声溶解，再向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，然后采用离心机在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液。

在本实施例的标准曲线制作工序中，先称取6份重量均为10.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶、五号试剂瓶和六号试剂瓶中，本发明中所用的阴性蜂王浆样品对本领域技术人员来说为公知常识。然后向一号试剂瓶中加入10ml水并混合均匀而制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入100μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入500μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入1000μl浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入500μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得五号阴性蜂王浆液；向六号试剂瓶中加入1000μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得六号阴性蜂王浆液。然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液、五号阴性蜂王浆液和六号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液，例如用一号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而制得一号标准液。本实施例中一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液的系列浓度为0μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg。最后将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线。本实施例中的高效液相色谱仪采用液相梯度程序，表1为高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表，三重四极杆串联质谱仪对硝基咪唑类药物残留参考质谱条件见表2。

表1高效液相色谱仪液相梯度洗脱程序表

表2三重四极杆串联质谱仪对硝基咪唑类药物残留的质谱参考条件

注：表中带下划线黑体字为定量离子。

需要说明的是，本发明中的高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪均为现有技术，高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪的操作对本领域技术人员来说为公知常，故此处均不再详述。

在本实施例的蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量；该方法的检测定量限为甲硝唑0.1μg/kg、洛硝哒唑0.2μg/kg和二甲硝咪唑0.1μg/kg。

本发明对样品净化方法进行了优化，若以磷酸盐缓冲溶液(0.5mol/L，pH＝8.8)溶解蜂王浆样品后，直接用乙酸乙酯提取，以中性氧化铝吸附，用乙腈分散对蜂王浆中的硝基咪唑类药物进行提取净化，结果基质效应大，检测限达到20μg/kg以上，说明样品净化不充分。若以浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液溶解蜂王浆样品，直接用乙酸乙酯提取，检测限达到0.5-1μg/kg(S/N大于5)。

硝基咪唑类药物在中性水溶液中不溶，在酸碱溶液中溶解度增加，溶于有机溶剂，此为液液萃取净化样品提供了理论支持，可以不用固相萃取技术，降低检测成本，而溶剂消耗并没有增加。可以根据这一特点，在药物呈电中性时用有机溶剂进行液液萃取，从而达到对样品进行净化的目的。大部分药物在酸性条件下带正电荷，碱性条件下带负电荷。通过试验，选择合适的pH环境进行液液萃取，使回收率达到最佳。实验表明：当调节pH＝8.8时，各种药物的提取效率最好，回收率达到了90.5％-127％。

本研究表明：仅用有机溶剂对残留进行提取时，最终样液呈黄色，杂质多，基质干扰就大，并污染仪器和色谱柱。原因是蜂王浆中存在大量的蛋白质，最大限度去除干扰杂质，就能够获得足够的灵敏度，故本研究拟采用酸类物质作为蛋白质沉淀剂，同时，因硝基咪唑类药物呈碱性，易溶于酸，可以将蜂王浆中的残留被充分提取到酸中。比较了三氯乙酸、高氯酸、偏磷酸三种蛋白质沉淀剂，发现用2％高氯酸提取效果比较理想，提取的最终样液呈无色，样品的净化程度大为改善。

从水相提取液中提取多种残留的有机溶剂主要有丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷或是它们的混合物，通过试验，我们选择了乙酸乙酯作为提取剂，并且调节pH＝8.8，使残留药呈游离的分子状态，降低极性，而经过蛋白质沉淀的样液中的有机酸、醇溶蛋白则变成盐，极性增强，不被乙酸乙酯溶解，这样，不但对目标物提取充分，而且容易氮气吹干，节省了样品预处理的时间。

为了进一步净化样品，我们对进样前的样液进行脱脂处理，本方法采用了常用的烃类正己烷作为脱脂溶剂。为了最大限度降低方法的检测限，本发明分别比较了蜂王浆样品量为2g，5g和10g时，对方法检测限的影响，结果表明，称样量为10g时，方法检测限达到最低。

本发明对液相色谱条件进行了优化，为了保证不同性质的多残留在色谱柱上的分离效率，本方法研究中，我们拟选用Hypersil、Akasil、Venusil MP、Shim-pack VP、Intersil等型号的色谱柱，寻找分离度好、灵敏度高、峰形窄而对称，定量离子无干扰的色谱柱，经过试验，发现IntersilC₈-3色谱柱的灵敏度最好，峰形尖锐，故被本方法采用。

本方法的流动相采用了常用的酸性水相和有机相并作梯度洗脱，以提高分离度和灵敏度，常用酸主要有甲酸、乙酸，我们根据现有资料和实际情况，研究流动相中不同浓度的甲酸或乙酸对分离效果的影响，分别用体积浓度为0.1％、0.2％、0.4％、1.0％(V/V)的甲酸或乙酸，并选择合适的挥发性盐类，提高离子化效率，以获得分离良好，峰形对称、信号强度大、灵敏度高的色谱图，结果体积浓度为0.1％的甲酸作为流动相时的信号最强，加入0.5mmol/L的乙酸铵后色谱信号得到增强，提高了灵敏度。

本发明采用不同的梯度条件，分析色谱柱对多残留的色谱行为，优选出最佳的梯度条件。同时优化流动相的流速、柱温，以取得最优的色谱图，优化结果见表1。

本发明对质谱条件进行了优化，配制1ppm浓度的各种残留标准溶液，用针泵以5μL/mL的流速进入三重四极杆串联质谱仪，以正离子模式进行Q1MS(Q1)全扫描，确定分子离子峰，调节离子源电压、DP、EP参数，再以分子离子峰作为母离子，进行子离子扫描，调节CE参数，使母离子的强度占子离子强度的1/3～1/4为最佳，从质谱图中选择2-4个信号较强的子离子作为定性离子，离子丰度最强的子离子为定量离子，采用针泵流动注射标准溶液，手动运行RAMP进行参数优化。

质谱参数确定后，连接液相色谱进样，由于各种残留的离子源温度、辅助加热气、干燥气、气帘气、电喷雾电压等参数在单纯质谱条件下与质谱连接液相条件下是不一样的，因此选择适中的一组参数在液相条件下再进行优化可以进一步提高方法的灵敏度，本实验在液相条件下进样2μg/kg的混标，再逐个进行优化与微调，使各种物质的灵敏度、峰形达到最佳。经过多次质谱与液相条件的调整得到目前最佳液相条件和质谱条件见表1和表2。

下面来对本发明的线性范围、检出限、回收率和精密度进行分析，配制27种残留的系列标准溶液，按照本方法设定的色谱条件进样测定。以y表示峰面积(A)，x表示浓度C(μg/kg)，用EXCEL软件，求得回归方程和线性相关系数，得到线性范围在0.1μg/kg-20μg/kg之间，相关系数为0.9994-0.9998，以信噪比S/N＝3对应浓度确定三种残留的检出限分别为：甲硝唑0.03μg/kg、洛硝哒唑0.06μg/kg和二甲硝咪唑0.03μg/kg。以信噪比S/N＝10对应浓度确定三种残留的定量限分别为：甲硝唑0.1μg/kg、洛硝哒唑0.2μg/kg和二甲硝咪唑O.1μg/kg。

在蜂王浆阴性样品中，分别添加3个浓度的残留标准品，按本方法进行样品的处理与测定，确定本方法的回收率和相对标准偏差，结果见表3。

表3方法的线性范围、检出限、回收率、精密度和检测限表(n＝3)

综上所述，本方法建立了蜂王浆中三种硝基咪唑类残留测定方法，不增加溶剂用量，不采用固相萃取小柱，净化后的样品无色透明，在质谱图上无干扰，连续进样70次，离子源气帘板(curtin plate)仍保持干净。方法的检测限检出限为：甲硝唑0.03μg/kg；洛硝哒唑0.06μg/kg；二甲硝咪唑0.03μg/kg，相关系数在0.9994-0.9998，回收率在90.5％-127％，相对标准偏差在6.7％-11.4％，精密度良好，完全能够满足欧盟要求动物源性食品中药物残留不得检出，即在检测方法的检出限以下，欧盟对蜂王浆冻干粉中硝基咪唑类药物的检测限已经达到了2.5μg/kg，蜂王浆中硝基咪唑类药物的检测限则已经达到了0.5μg/kg的要求。

一般残留检测方法均会用到固相萃取技术，以提高样品净化程度，减少溶剂使用量，在测定蜂王浆中硝基咪唑类残留时本方法首次采用体积浓度为2％的HClO₄沉淀蛋白，蛋白沉淀彻底，离子抑制效应低，在pH＝8.8环境中用乙酸乙酯反萃取目标化合物，反萃取液容易吹干，净化样品方法独特，简便快速，不增加溶剂使用量，不使用磷酸缓冲溶液，同时大大提高了方法的灵敏度。

我们采用本方法于2009年开始对蜂王浆原料、半成品和成品进行检测与质量控制，共检测了1000余个样品，蜂王浆原料中硝基咪唑类残留有不同程度被检出，阳性率为6.6％。因为本方法独特的净化技术，同时可以很好地净化蜂蜜样品，采用了氘代二甲硝咪唑为内标，因此同样适用于蜂蜜中硝基咪唑类药物残留的检测。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.4％的甲硝唑，纯度＞99.0％的洛硝哒唑，纯度＞98.5％的二甲硝咪唑，纯度＞98％的D3-二甲硝咪唑，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氢氧化钠和氯化钠，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈、乙酸铵和甲酸，水，初始流动相；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为3∶97；

该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为550℃，辅助加热气为65.00psi，干燥气为65.00psi，气帘气为10.00psi，碰撞气为5.00psi，电喷雾电压为4000.00V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Intersil ODS C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；

该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准液配制步骤：称取10mg甲硝唑、10mg洛硝哒唑和10mg二甲硝咪唑均置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为1000mg/L的混合贮备标准液；b、混合中间标准液配制步骤：取a中的混合贮备标准液100μl置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/L的混合中间标准液；c、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤：称取D3-二甲硝咪唑10mg用乙腈配制成浓度为10mg/L的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中的混合中间标准液分别用水配制成浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液、浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液，取c步骤中的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液用水配制成浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液；

所述蜂王浆样品处理工序如下：a、称取蜂王浆样品10g加入10ml水并混合均匀而制得蜂王浆样品液；b、将a中的蜂王浆样品液置于一号50ml离心塑料瓶中，再向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液100ul并混合充分，然后静置5min以上；再向一号50ml离心塑料瓶中加入30ml体积浓度为2％的HClO₄混合均匀并提取5min，然后将位于一号50ml离心塑料瓶中的液体在常温下超声破乳1-2min，再用体积浓度为2％的HClO₄定容至50ml而制得蜂王浆混合液；将蜂王浆混合液置于30℃下进行超声提取20min，然后在转速为3000rpm下离心5min而得到上清液；取上清液20ml置于二号50ml离心塑料瓶中，并用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入2.0g氯化钠，待氯化钠溶解后再加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min后，在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下进行氮气吹干，然后向15ml塑料离心管中加入1ml初始流动相并进行超声溶解，再向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并用力振摇充分混合去脂，然后在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；

所述标准曲线制作工序中，先称取6份重量均为10.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶、五号试剂瓶和六号试剂瓶中；然后向一号试剂瓶中加入10ml水并混合均匀而制得一号阴性蜂王浆液，向二号试剂瓶中加入100μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得二号阴性蜂王浆液，向三号试剂瓶中加入500μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得三号阴性蜂王浆液，向四号试剂瓶中加入1000μl浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得四号阴性蜂王浆液，向五号试剂瓶中加入500μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得五号阴性蜂王浆液，向六号试剂瓶中加入1000μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得六号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液、五号阴性蜂王浆液和六号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液的系列浓度为0μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；

所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量；该方法的检测定量限为甲硝唑0.1μg/kg、洛硝哒唑0.2μg/kg和二甲硝咪唑0.1μg/kg。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：所述蜂王浆样品处理工序中，向一号50ml离心塑料瓶中加入体积浓度为2％的HClO₄混合均匀并提取5min，以去除蜂王浆样品中的蛋白质及其他极性化合物。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：所述蜂王浆样品处理工序中，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，使上清液中的有机酸和醇溶蛋白盐化，以提高有机酸和醇溶蛋白的极性，使有机酸和醇溶蛋白不被乙酸乙酯提取。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：所述蜂王浆样品处理工序中，将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下采用氮吹仪进行氮气吹干。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：该方法所使用的水均为双重蒸馏水。

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