CN104407085B - 应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步骤有：(1)养殖池塘底泥样品采集；(2)样品的提取；(3)正己烷净化；(4)水饱和乙酸乙酯溶液提取；(5)氮气吹干提取液，乙腈－水(5+95)溶解得备用液；(6)固相萃取柱洗脱；(7)水饱和乙酸乙酯溶液提取，氮气吹干；(8)甲醇水(50+50)溶液溶解，涡旋后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。本发明方法通过对淡水池塘底泥进行前处理，去除基体干扰物，提高了灵敏度，优化了前处理过程，并且样品无需衍生化，简化了操作步骤，可为污染来源排查及评价生态环境对健康养殖的影响提供可靠的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于分析化学、生态环境安全技术领域，特别是一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法。
背景技术
氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，对需氧、厌氧菌以及衣原体、支原体、立克次体等均有效。由于价格便宜且效果显著，常被作为药物用于畜禽及水产品的疾病治疗和预防。但是，氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，容易造成再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症和灰婴综合征等。因此，为保障动物源食品安全，确保该药不对人类带来危害，世界各国都对其做出了严格规定，严禁氯霉素在食用动物上使用，欧盟规定动物源食品中氯霉素残留的最低要求执行限为(MRPL)0.3μg/kg，我国农业部235号公告中把氯霉素列为了禁用药物。
由于传统的水产养殖模式，导致氯霉素已经被广泛应用，尽管现在水产养殖中违禁使用情况很少了，但其已对环境造成了严重污染，尤其是氯霉素在表层沉积物中富集，当受污染的淡水池塘进行再次养殖生产时，底泥中的禁用药物氯霉素会不断向水体进行缓慢释放，成为其二次污染的主要来源，因此评估养殖池塘底泥中的氯霉素药物残留状况，建立相应的检测方法，对于水产品中氯霉素污染来源的排查具有积极的意义。
经过中国学术期刊网络出版总库、中文科技期刊数据库、中国学术会议论文全文数据库、中国学位论文全文数据库、国家科技成果网、中国专利数据库、中国科技项目创新成果鉴定意见数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库、中国博士学位论文全文数据库、中国重要报纸全文数据库、http://www.baidu.com等文献检索及国外的相关资料检索，目前，淡水池塘中底泥中的氯霉素检测方法，只报道了应用气相色谱仪法测定淡水池塘中底泥中的氯霉素，而液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素方法未见报道。
液质–质联用技术(LC–MS/MS)具有快速、灵敏度高、专一性好、不受噪声干扰等特点，尤其是通过多反应监测模式(MRM)能进一步提高检测的灵敏度和选择性，大大降低了检测限并很大程度上减少了假阳性的出现。
由于淡水养殖池塘底泥中的成份复杂，各种杂质多，对分析干扰大，气液相色谱仪检测方法需要进行衍生化，对样品的净化要求较高，整个操作步骤繁琐、耗时长，气相色谱仪器检测易形成相似峰干扰，热稳定差，不利于准确定性和定量分析，因此研制出干扰小，稳定性高，数据准确的检测方法十分必要。
发明内容
本发明的目的是针对检测底泥中氯霉素现有技术的不足，而提出一种对淡水池塘底泥中氯霉素样品采集、提取、浓缩，优化了前处理过程，应用液质-质联用仪，能够快速准确检测出淡水池塘底泥中残存的痕量氯霉素的检测方法。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步骤如下：
(1)养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18℃冰箱保存；
(2)样品的提取，称取样品5.00g置50ml离心管中，加入2ml水润湿，加入500μl浓度为10.0ng/ml的氯霉素内标溶液、5ml乙腈及4％氯化钠溶液5ml，漩涡振荡2min，超声萃取20min后，静置10min，用转速为15000r/min的离心机离心10min，提取上清液至于另一50ml离心管中；
(3)重复上述步骤(2)的提取过程，合并两次提取液，在合并的提取液中加入正己烷5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，弃去正己烷层溶液，重复一次，得提取液；
(4)在上述(3)步所得提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次，将两次所得上层液合并；
(5)将上述(4)步所得提取液用氮气吹干，用乙腈－水(5+95)溶液3ml溶解氮气吹干后残留物得备用液；
(6)将固相萃取柱依次用甲醇10ml，水10ml预洗，然后取上述备用液过柱，用水5ml洗柱，用5ml甲醇水(50+50)溶液洗脱，以1ml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中；
(7)将上述洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，得吹干残留物；
(8)用1mL甲醇水(50+50)溶液溶解上步残留物，旋涡后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。
而且，所述步骤(8)中用液质-质联用仪上机测定时，检测中各项条件设定为：
①色谱柱:Shim-PackXR-ODS色谱柱，5μm，75mm×2.0mm(内径)，柱温40℃，流动相为A-水，B-甲醇，流速为0.30mL/min，进样量5μL；
②梯度洗脱条件如表1：
表1梯度洗脱条件
| 时间/min | A水(％) | B甲醇(％) |
| 0.1 | 90 | 10 |
| 1.5 | 20 | 80 |
| 4.0 | 20 | 80 |
| 4.01 | 90 | 10 |
| 7.0 | 90 | 10 |
③其他各项设定：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；气帘气：20PSI；辅助气：50PSI；去簇电压：-80V及碰撞电压：-10V，离子源温度:500℃；
④化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示；
表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数
其中*为定量离子；
⑤梯度标准品溶液及内标质量的确定；采用不含目标待测物的基质空白溶液配制梯度标准品溶液(0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0ng/mL)加入氯霉素-D5内标质量为5.0ng；
⑥确定检测限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg；仪器检出限及方法定量限见表3。
表3线性范围、标准曲线方程、检出限和定量限
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明方法操作简便、定性定量能力较强，可作为污染来源排查及评价生态环境对健康养殖的影响可靠的检测手段。
2、本发明方法通过对淡水池塘底泥进行采集、提取、分离、净化等前处理等手段去除基体干扰物，提高了灵敏度，优化了前处理过程，并且样品无需衍生化，简化了操作步骤，本实验方法的回收率为90.1％～96.6％，变异系数为2.4％～7.0％，可为污染来源排查及评价生态环境对健康养殖的影响提供可靠的检测手段。
3、在本发明中，氯霉素分子式为C11H12Cl2N2O5，在电喷雾源(ESI)中易失去一个氢原子而带负电荷，故选择ESI负离子模式对其进行检测，用流动注射进样方式对氯霉素的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰，以适当的碰撞能量对准分子离子进行子离子扫描，选择响应值最强的子离子作为定量离子，选择响应值相对较强的两对离子作为定性离子，选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行碎裂电压及碰撞能量的优化，优化后的参数见表2。
4、本发明方法大大提高了准确度，在质谱MRM参数上，本方法采用321.1/152.0、321.1/256.8离子对作为氯霉素定性离子进行检测分析，321.1/152.0*离子对作为氯霉素的定量离子进行检测分析，比气相色谱法更具有专属性及有更高的灵敏度。
附图说明
图1为氯霉素及氘代氯霉素(氯霉素-D5)特征离子质量色谱图；
图2为氯霉素特征离子质谱图；
图3淡水池塘底泥空白样品氯霉素特征离子质量色谱图；
图4淡水池塘底泥阳性样品氯霉素特征离子质量色谱图(1μg/kg)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括方法步骤如下：
(1)养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18℃冰箱保存；这是因为渔业养殖过程使用的氯霉素通过水体及鱼体代谢均富集在表层底泥中。
(2)样品的提取，称取样品5.00g(±0.01g)置50ml离心管中，加入2ml水，润湿为了后面更好的提取，准确加入500μl浓度为10.0ng/ml的氯霉素内标溶液、乙腈5ml及4％氯化钠溶液5ml，增加提取效果，漩涡振荡2min，超声萃取20min后，静置10min，用超声萃取能提高萃取率，用转速为15000r/min的离心机离心10min，用加大的转速能去除基体干扰，提取上清液至于另一50ml离心管中；
(3)重复上述步骤(2)的提取过程，合并两次提取液，在合并的提取液中加入正己烷5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，弃去正己烷层溶液，重复一次，得提取液；
(4)在上述(3)步所提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次，将两次所得上层液合并；
(5)将上述(4)步所得提取液用氮气吹干，用乙腈－水(5+95)溶液3ml溶解氮气吹干后残留物得备用液；
(6)将固相萃取柱依次用甲醇10ml，水10ml预洗，然后取上述备用液过柱，用水5ml洗柱，用5ml甲醇水(50+50)溶液洗脱，以1ml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中；
(7)将上述洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，得吹干残留物；
(8)用1mL甲醇水(50+50)溶液溶解上步残留物，旋涡后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定；
(9)液质-质联用仪检测，检测中各项条件设定为：
①色谱柱:Shim-PackXR-ODS色谱柱，5μm，75mm×2.0mm(内径)，柱温40℃，流动相为A-水，B-甲醇，流速为0.30mL/min，进样量5μL；
②梯度洗脱条件见表1：
表1梯度洗脱条件
| 时间/min | A水(％) | B甲醇(％) |
| 0.1 | 90 | 10 |
| 1.5 | 20 | 80 |
| 4.0 | 20 | 80 |
| 4.01 | 90 | 10 |
| 7.0 | 90 | 10 |
③其他各项设定：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；气帘气(CUR)20PSI、辅助气(GAS1)50PSI、辅助气(GAS2)50PSI、去簇电压(DP)-80V及碰撞电压(EP)-10V，上述气体均为高纯氮，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；离子源温度(TEM):500℃；
④化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示；
表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数
其中*为定量离子；
⑤梯度标准品溶液及内标质量的确定；由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，因此本发明采用不含目标待测物的基质空白溶液配制梯度标准品溶液(0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0ng/mL)加入氯霉素-D5内标质量为5.0ng；
⑥确定检测限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg；在上述仪器条件下测定，以氯霉素与其内标物的相对浓度为横坐标，以其对应的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线得到线性方程，仪器检出限及方法定量限见表3。
表3线性范围、标准曲线方程、检出限和定量限
试样中氯霉素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围在±2.5％之内，氯霉素的定性离子的色谱峰的信噪比大于等于3(S/N≥3为检出限，定量离子的色谱峰的信噪比大于等于10(S/N≥10)为定量限，本方法的检测限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。
实施例1母离子的选择
氯霉素中羟基官能团可带负电荷，选用(ESI-)离子化模式可以提供较(ESI+)正离子方式更多的碎片信息，且灵敏度大幅提高，如图1所示，本方法将0.5mg/L的氯霉素标准溶液及氯霉素-D5内标液利用流动注射泵以10μl/min速度连续进样方式在负离子模式下进行母离子全扫描，确定氯霉素及氯霉素-D5的分子离子分别为m/z321.1和326.1。
然后分别以各自的母离子，用子离子扫描方式进行二级质谱扫描分析，分别找出选择丰度相对较强的两个特征碎片离子，以母离子和子离子组成监测离子对，以多反应监测(MRM)模式对目标物进行定性定量分析，选择丰度最强、无干扰的监测离子对321.1/152.0、326.1/157.1分别用于氯霉素及氯霉素-D5的定量，其它离子对则分别用于辅助定性。因此本发明具有快速、灵敏度高、专一性好的特点。
实施例2样品前处理条件
样品前处理
本发明是以淡水池塘底泥样品为基础，淡水池塘底泥中的基质非常复杂，干扰大，前处理非常复杂。
养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18℃冰箱保存。这是因为渔业养殖过程使用的氯霉素通过水体及鱼体代谢均富集在表层底泥中。
样品的提取：称取样品5.00g(±0.01g)置50ml离心管中，加入水2ml润湿为了后面更好的提取。准确加入500μl10.0ng/ml氯霉素内标溶液，加乙腈5ml，4％氯化钠溶液5ml增加提取效果，漩涡振荡2min超声萃取20min后静置10min，用超声萃取能提高萃取率，用离心机离心10min，转速为15000r/min，加大转速能去除基体干扰。
取上清液至另一50ml离心管中，重复提取一次，合并提取液。提取液中加正己烷5ml，漩涡振荡2min，用离心机离心10min，转速为5000r/min。弃去上层液，重复一次。
加水饱和乙酸乙酯溶液5ml漩涡振荡2min，用离心机离心10min，转速为5000r/min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次。
合并提取液氮吹干，用乙腈－水(5+95)3ml溶解备用。
固相萃取柱依次用甲醇10ml，水10ml预洗，取备用液过柱。
用水5ml洗柱，用5ml甲醇水(50+50)洗脱，以1ml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中。
洗脱液中加水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心5min。取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干。
用1mL甲醇水(50+50)溶液溶解残留物，旋涡后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。
氯霉素类药物微溶于水，可溶于强极性和中等极性有机溶剂。氯霉素可以用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂提取。但在液－液萃取中，加3％～4％的氯化钠溶液可以提高乙腈对氯霉素药物的萃取率。
本发明采用液—液萃取(LPE)和固相萃取(SPE)两种方法，两种方法的结合使用更有效地消除淡水池塘底泥样品中的基体干扰。
在运用气相色谱法进行分析前，前处理比较复杂需要进行衍生化，一般为硅烷化。硅烷化是测定氯霉素类药物最常用的衍生化方法，衍生试剂为N,O－双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)－三甲基氯硅烷(TMCS)(体积比为99：1)。此硅烷化试剂易挥发。
本发明的前处理方法比气相色谱的前处理方法步骤简单、提取效率高、稳定性好。
实施例3液质-质联用仪检测条件的确定
根据CAC和EU第657/2002/EEC号决议中有关规定，选择两对离子进行MRM监测即可满足检测要求，同时子离子的选择主要考虑其中母离子和子离子按照每种化合物的质谱图和结构特性选取，并且在实际样品分析中基质干扰较少，依据上述原则确定各种物质的分子离子后，分别以各种化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子，最强的一对为定量离子，最后以多反应监测(MRM)正离子模式优化各种质谱参数。
如图2本方法采用321.1/152.0、321.1/256.8离子对作为氯霉素定性离子进行检测分析，321.1/152.0*离子对作为氯霉素的定量离子进行检测分析，比气相色谱法更具有专属性及有更高的灵敏度。
液质-质联用仪检测条件：
色谱柱:Shim-PackXR-ODS色谱柱，5μm，75mm×2.0mm(内径)，柱温40℃，流动相为A-水，B-甲醇，流速为0.30mL/min，进样量5.0μL，梯度洗脱。
质谱条件—离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式:多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；气帘气(CUR)20PSI、辅助气(GAS1)50PSI、辅助气(GAS2)50PSI，去簇电压(DP)-80V，碰撞电压(EP)-10V，碰撞气均为高纯氮，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；离子源温度(TEM):500℃。
实施例4回收率实验
(1)样品添加：
取淡水池塘空白底泥样品进行三个水平的添加，氯霉素的添加水平分别为0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg，每个水平做6个平行。
(2)样品前处理
养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18℃冰箱保存。
样品的提取：称取样品5.00g(±0.01g)置50ml离心管中，加入水2ml润湿为了后面更好的提取。准确加入500μl10.0ng/ml氯霉素内标溶液，加乙腈5ml，4％氯化钠溶液5ml增加提取效果，漩涡振荡2min超声萃取20min后静置10min，用超声萃取能提高萃取率，用离心机离心10min，转速为15000r/min，加大转速能去除基体干扰。取上清液至另一50ml离心管中，重复提取一次，合并提取液。
(3)样品的净化和富集
提取液中加正己烷5ml，漩涡振荡2min，用离心机离心10min，转速为5000r/min。弃去上层液，重复一次。加水饱和乙酸乙酯溶液5ml漩涡振荡2min，用离心机离心10min，转速为5000r/min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次。合并提取液氮吹干，用乙腈－水(5+95)3ml溶解备用。
固相萃取柱依次用甲醇10ml，水10ml预洗，取备用液过柱。用水5ml洗柱，用5ml甲醇水(50+50)洗脱，以1ml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中。洗脱液中加水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心5min。取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干用1mL甲醇水(50+50溶液溶解残留物，旋涡后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。
(4)液质-质联用仪检测
色谱柱:Shim-PackXR-ODS色谱柱，5μm，75mm×2.0mm(内径)，柱温40℃，流动相为A-水，B-甲醇，流速为0.30mL/min，进样量5μL，
梯度洗脱条件见表1：
表1梯度洗脱条件
| 时间/min | A水(％) | B甲醇(％) |
| 0.1 | 90 | 10 |
| 1.5 | 20 | 80 |
| 4.0 | 20 | 80 |
| 4.01 | 90 | 10 |
| 7.0 | 90 | 10 |
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式:多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；气帘气(CUR)20PSI、辅助气(GAS1)50PSI、辅助气(GAS2)50PSI，去簇电压(DP)-80V，碰撞电压(EP)-10V，碰撞气均为高纯氮，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；离子源温度(TEM):500℃。
化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示。
表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数
*为定量离子。
实验结果显示，本实验方法的回收率为90.1％～96.6％，变异系数为2.4％～7.0％。
实施例5本发明检测方法的具体应用
在天津市武清区淡水养殖基地随机采集10份土壤样本，以实施例4相同的检测方法进行检测，发现一份鲫鱼养鱼池中的土壤样本中检测到氯霉素含量为1.0μg/kg，说明该淡水养殖池塘中的鲫鱼曾使用过氯霉素药物，其它样本均未检出。从本实验使用的液质-质联用仪分别获得如图3所示的淡水池塘底泥空白样品氯霉素特征离子质量色谱图、如图4所示的淡水池塘底泥阳性样品氯霉素特征离子质量色谱图(1.0μg/kg)。
Claims (1)
1.一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，其特征在于包括步骤如下：
(1)养殖池塘底泥样品采集，用采泥器取表层沉积物，放在广口瓶中在-18℃冰箱保存；
(2)样品的提取，称取样品5.00g置50ml离心管中，加入2ml水润湿，加入500μl浓度为10.0ng/ml的氯霉素内标溶液、5ml乙腈及4％氯化钠溶液5ml，旋涡振荡2min，超声萃取20min后，静置10min，用转速为15000r/min的离心机离心10min，提取上清液置于另一50ml离心管中；
(3)重复上述步骤(2)的提取过程，合并两次提取液，在合并的提取液中加入正己烷5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，弃去正己烷层溶液，重复一次，得提取液；
(4)在上述(3)步所得提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，漩涡振荡2min，用转速为5000r/min的离心机离心10min，上层液转移到15ml离心管中，重复提取1次，将两次所得上层液合并；
(5)将上述(4)步所得提取液用氮气吹干，用比例为5比95的乙腈－水水溶液3ml溶解氮气吹干后残留物得备用液；
(6)将固相萃取柱依次用甲醇10ml，水10ml预洗，然后取上述备用液过柱，用水5ml洗柱，用比例为50比50的5ml甲醇水溶液洗脱，以1ml/min的速度将样品洗脱入15ml离心管中；
(7)将上述洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5ml，涡旋振荡2min，5000r/min，离心5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，得吹干残留物；
(8)用比例为50比50的1mL甲醇水溶液溶解上步残留物，旋涡后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定；上机测定时，检测中各项条件设定为：
①色谱柱:Shim-PackXR-ODS色谱柱，5μm，75mm×2.0mm，柱温40℃，流动相为A-水，B-甲醇，流速为0.30mL/min，进样量5μL；
②梯度洗脱条件如表1：
表1梯度洗脱条件
③其他各项设定：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；气帘气：20PSI；辅助气：50PSI；去簇电压：-80V及碰撞电压：-10V，离子源温度:500℃；
④化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示；
表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数
其中*为定量离子；
⑤梯度标准品溶液及内标质量的确定；采用不含目标待测物的基质空白溶液配制梯度标准品溶液，加入氯霉素-D5内标质量为5.0ng，得到浓度分别为0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0ng/mL的梯度标准品溶液；
⑥确定检测限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg；仪器检出限及方法定量限见表3,
表3线性范围、标准曲线方程、检出限和定量限
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