CN103336083B - 一种青霉素菌渣中青霉素g的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，它涉及一种青霉素菌渣中青霉素G的检测方法。本发明的目的要解决现有技术中无法快速、准确检测青霉素菌渣中青霉素G的问题。方法：一、绘制标准曲线，拟合标准曲线方程；二、提取，得到青霉素G提取液；三、活化处理；四、洗脱，得到待检测液；五、青霉素G的含量确定。本发明主要用于检测青霉素菌渣中青霉素G的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种青霉素菌渣中青霉素G的检测方法。
背景技术
抗生素作为一种主要的代表性兽药，在食品安全及世界贸易迅速发展的今天，受到了广泛的关注，目前对其检测仍然主要集中在动物源性食品中，主要的检测方法有高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法。
抗生素菌渣是抗生素生产企业在生产过程中的废弃物，底物主要由大豆、花生饼、玉米蛋白、淀粉等组成，外观呈豆腐渣样，气味因培养的菌类不同而异；内部含粗蛋白、脂肪、糖份等营养成分以及水和少量的抗生素残留成份，当环境温度在15～20℃时24小时、25～0℃时3小时会变臭液化，遇水、雨、雪、雾或蒸汽时会加速液化变质。一般每100m3的发酵液可形成约30～40m3的湿菌渣，据有关资料统计，我国年排放量约为100万吨以上。由于药渣黏度大，不能排入下水道，只能占用土地堆放。如果这些药渣不能被无害化处置利用，不仅会浪费大量资源，而且会污染生态环境。过去一直对菌渣采用干燥加工处理后作为饲料或饲料添加剂使用。但是，目前研究结果发现，药渣中的微量抗生素容易在被饲喂的畜禽体内残留，长期食用这种含有药物残留的动物源性食品，会对人类肝脏造成损伤。章明奎等人对抗生素诱导土壤可培养细菌产生耐药性进行了研究。
抗生素在菌丝体残留量的检测在国外研究尚早，主要的检测方法是高效液相色谱法，1994年，L.H.Christensen等人所建立的青霉素发酵过程中中间产物的高效液相色谱法作为一种经典的检测方法被广泛使用，C18柱子被用来进行分离，乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液作为流动相，之后也有一些文献报道了青霉素G及其降解产物的高效液相色谱法。但这些方法的灵敏度均较低，不能满足现代残留检测分析的要求。目前在国内文献中鲜少提到菌渣中抗生素的残留检测方法，且方法较不完善，并没有明确的方法检出限及回收率实验，不具有明显的可靠性，因此尚需要进一步研究，其中，刘慧娟等人在青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用中采用高效液相色谱法进行了研究，此外，微生物法在菌渣中抗生素残留的检测也有应用，但本方法不具有一定的专一性，所测抗生素可能含有其降解产物。因此，准确可靠的残留检测方法还有待探讨。
发明内容
本发明的目的要解决现有技术中无法快速、准确检测青霉素菌渣中青霉素G的问题， 提供一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法。
一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，具体是按以下步骤完成的：
一、绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素G标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mL-1～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素G标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素G标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素G的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
二、提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；
三、活化处理：首先采用5.0mL甲醇过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，即完成Waters Oasis-C18固相萃取小柱活化处理；
四、洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
五、青霉素G的含量确定：利用高效液相色谱法进行检测步骤四得到的待检测液，根据色谱峰面积，利用外标法由步骤一得到的标准曲线方程：Y=kX+b计算步骤四得到的待检测液中青霉素G的浓度，根据青霉素G的浓度计算出步骤四得到的待检测液中青霉素G的质量，即确定青霉素菌渣中青霉素G的含量。
本发明优点：一、本发明采用了超声辅助提取法提取青霉素菌渣中的青霉素G残留，超声辅助提取具有较高的提取效果，能够有效将青霉素G与蛋白质等物质的结合断开；二、本发明中采用Waters Oasis-C18固相萃取小柱净化富集青霉素菌渣提取液中的青霉素G，这样既可以去除其他物质的干扰，又对提取液起到富集的作用，很大程度的提高检测效率；三、本发明中色谱柱为C18硅胶色谱柱，能在5.0min内完成对提取液中的青霉素G的检测；四、应用本方法进行青霉素菌渣中青霉素G残留的测定，操作简便，准确度高，青霉素G含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求；五、本发明灵敏度高，可满足我国对于青霉素G在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为青霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。
附图说明
图1是浓度为2000μg·mL-1的青霉素G标准溶液高效液相色谱图；
图2是高效液相色谱图，图中A试验一步骤四得到的待检测液高效液相色谱图，图中B试验二步骤四得到的待检测液高效液相色谱图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式是一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，具体是按以下步骤完成的：
一、绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素G标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mL-1～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素G标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素G标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素G的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
二、提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；
三、活化处理：首先采用5.0mL甲醇过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，即完成Waters Oasis-C18固相萃取小柱活化处理；
四、洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
五、青霉素G的含量确定：利用高效液相色谱法进行检测步骤四得到的待检测液，根据色谱峰面积，利用外标法由步骤一得到的标准曲线方程：Y=kX+b计算步骤四得到的待检测液中青霉素G的浓度，根据青霉素G的浓度计算出步骤四得到的待检测液中青霉素G的质量，即确定青霉素菌渣中青霉素G的含量。
本实施方式步骤二中所述的质量分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值为2.67。
本实施方式采用了超声辅助提取法提取青霉素菌渣中的青霉素G残留，超声辅助提取具有较高的提取效果，能够有效将青霉素G与蛋白质等物质的结合断开。
本实施方式中采用Waters Oasis-C18固相萃取小柱净化富集青霉素菌渣提取液中的青霉素G，这样既可以去除其他物质的干扰，又对提取液起到富集的作用，很大程度的提高检测效率。
应用本方法进行青霉素菌渣中青霉素G残留的测定，操作简便，准确度高，青霉素G含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求；
本实施方式灵敏度高，可满足我国对于青霉素G在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为青霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3%的甲酸水溶液/乙腈为流动相，本发明中水相A和有机相B体积比为60:40以流速1.0mL·min-1恒速洗脱。恒速洗脱，色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
b、流动相：水相A:质量分数为0.3%的甲酸水溶液；有机相B:乙腈；且所述的水相A与有机相B的体积比为60:40；
c、洗脱方式：等度洗脱0.8mL·min-1～1.2mL·min-1；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
其他与具体实施方式一相同。
本实施方式所述的质量分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值为2.67。
本实施方式中色谱柱为C18硅胶色谱柱，能在5.0min内完成对提取液中的青霉素G的检测。
本实施方式采用高效液相色谱-紫外检测器用于青霉素G含量的测定，此方法简单快速，准确可靠。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：步骤二中首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤二中所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为5g:20mL。其他与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤二中所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为1:1。其他与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二中所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为1mL:1g。其他与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤四中在过柱流速为2.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为25℃下N2吹干，然后加入复合溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液。其他与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤四中所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为1.0mL:1g。其他与具体实施方式 一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤五中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3%的甲酸水溶液/乙腈为流动相，恒速洗脱，色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
b、流动相：水相A:质量分数为0.3%的甲酸水溶液；有机相B:乙腈；且所述的水相A与有机相B的体积比为60:40；
c、洗脱方式：等度洗脱0.8mL·min-1～1.2mL·min-1；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
其他与具体实施方式一至八相同。
本实施方式所述的质量分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值为2.67。
本实施方式中色谱柱为C18硅胶色谱柱，能在5.0min内完成对提取液中的青霉素G的检测。
本实施方式采用高效液相色谱-紫外检测器用于青霉素G含量的测定，此方法简单快速，准确可靠。
采用下述试验验证本发明效果：
试验一：一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，具体是按以下步骤完成的：
一、绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素G标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mL-1～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素G标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素G标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=3499.4X-176.3；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
二、提取：首先将5g青霉素菌渣加入20mL提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入5g无水硫酸钠和5mL正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液；
三、活化处理：首先采用5.0mL甲醇过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，即完成Waters Oasis-C18固相萃取小柱活化处理；
四、洗脱：在过柱流速为2.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用5mL质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用3.0mL洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为25℃下N2吹干，然后加入1mL复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
五、青霉素G的含量确定：利用高效液相色谱法进行检测步骤四得到的待检测液，根据色谱峰面积，利用外标法由步骤一得到的标准曲线方程：Y=3499.4X-176.3计算步骤四得到的待检测液中青霉素G的浓度，根据青霉素G的浓度计算出步骤四得到的待检测液中青霉素G的质量，即确定青霉素菌渣中青霉素G的含量。
本试验步骤一中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3%的甲酸水溶液/乙腈为流动相，本发明中水相A和有机相B体积比为60:40以流速1.0mL·min-1恒速洗脱。恒速洗脱，色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
b、流动相：水相A:质量分数为0.3%的甲酸水溶液；有机相B:乙腈；且所述的水相A与有机相B的体积比为60:40；
c、洗脱方式：等度洗脱1.0mL·min-1；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
本试验步骤五中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3%的甲酸水溶液/乙腈为流动相，恒速洗脱，色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
b、流动相：水相A:质量分数为0.3%的甲酸水溶液；有机相B:乙腈；且所述的水相A与有机相B的体积比为60:40；
c、洗脱方式：等度洗脱1.0mL·min-1；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
通过计算可知本试验青霉素菌渣中青霉素G的含量为636.76mg·kg-1。
图1是浓度为2000μg·mL-1的青霉素G标准溶液高效液相色谱图；通过图1可以看出在上述色谱条件下，青霉素G的出峰时间较早，峰型良好，峰型尖锐且对称。
试验二：本试验与试验一的不同点是：步骤二中首先按加入量800mg·kg-1向5g青霉素菌渣中加入青霉素G，然后加入20mL提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入5g无水硫酸钠和5mL正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液。其他与试验一相同。
本试验所述的青霉素菌渣与试验一所述的青霉素菌渣完全相同。
本试验是试验一加标回收试验，加标水平为800mg·kg-1，检测青霉素G在青霉素菌渣中的加标回收率、相对标准偏差、定量检出限（LOD值）和定性检出限（LOQ值），通过检测青霉素G的回收率为113.47%，相对标准偏差为15.98%，LOD值为0.007mg·kg-1，LOQ值为0.007mg·kg-1。
图2是高效液相色谱图，图中A试验一步骤四得到的待检测液高效液相色谱图，图中B试验二步骤四得到的待检测液高效液相色谱图；通过图2可以看出，经过上诉提取净化过程，机制中所含干扰物质对于目标物的定量干扰较小，在青霉素G的色谱峰附近没有其他干扰物质，对于菌渣中青霉素G含量的准确定性不构成干扰，结合加标回收率计算结果，表明该提取进化过程是一种有效的前处理过程。
试验三：本试验与试验一的不同点是：步骤二中首先按加入量1200mg·kg-1向5g青霉素菌渣中加入青霉素G，然后加入20mL提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入5g无水硫酸钠和5mL正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液。其他与试验一相同。
本试验所述的青霉素菌渣与试验一所述的青霉素菌渣完全相同。
本试验是试验一加标回收试验，加标水平为1200mg·kg-1，检测青霉素G在青霉素菌渣中的加标回收率和相对标准偏差，通过检测可知青霉素G的回收率为74.98%，相对标 准偏差为4.63%。
试验四：本试验与试验一的不同点是：步骤二中首先按加入量1800mg·kg-1向5g青霉素菌渣中加入青霉素G，然后加入20mL提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入5g无水硫酸钠和5mL正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液。其他与试验一相同。
本试验所述的青霉素菌渣与试验一所述的青霉素菌渣完全相同。
本试验是试验一加标回收试验，加标水平为1800mg·kg-1，检测青霉素G在青霉素菌渣中的加标回收率和相对标准偏差，通过检测可知青霉素G的回收率为88.27%，相对标准偏差为3.78%。
根据试验二至四加标水平为800mg·kg-1、1200mg·kg-1和1800mg·kg-1三个水平于空白青霉素菌渣样品中，结果显示我们所建立的青霉素微生物发酵菌渣中青霉素G的残留分析方法满足检测要求，可达到较低检测限且空白干扰较小。
Claims (5)
1.一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，其特征在于青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法是按以下步骤完成的：
一、绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素G标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mL-1～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素G标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素G标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y＝kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素G的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
二、提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液，向青霉素G粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素G提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为5g:20mL；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3％的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3％的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为1:1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为1mL:1g；
三、活化处理：首先采用5.0mL甲醇过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过Waters Oasis-C18固相萃取小柱，即完成Waters Oasis-C18固相萃取小柱活化处理；
四、洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5％的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为1.0mL:1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；
五、青霉素G的含量确定：利用高效液相色谱法进行检测步骤四得到的待检测液，根据色谱峰面积，利用外标法由步骤一得到的标准曲线方程：Y＝kX+b计算步骤四得到的待检测液中青霉素G的浓度，根据青霉素G的浓度计算出步骤四得到的待检测液中青霉素G的质量，即确定青霉素菌渣中青霉素G的含量。
2.根据权利要求1所述的一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，其 特征在于步骤一中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3％的甲酸水溶液/乙腈为流动相，本发明中水相A和有机相B体积比为60:40以流速1.0mL·min-1恒速洗脱；色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
3.根据权利要求1所述的一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，其特征在于步骤二中首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取30min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素G粗提液。
4.根据权利要求1所述的一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，其特征在于步骤四中在过柱流速为2.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素G提取液过步骤三得到的活化处理后Waters Oasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5％的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为25℃下N2吹干，然后加入复合溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液。
5.根据权利要求4所述的一种青霉素菌渣中青霉素G的高效液相色谱检测方法，其特征在于步骤五中所述的高效液相色谱法具体操作如下：以二元泵、恒温箱、紫外检测器和化学工作站组成的HPLC仪，以质量分数为0.3％的甲酸水溶液/乙腈为流动相，恒速洗脱，色谱条件如下：
a、色谱柱：Eelipse XDB-C18；
b、流动相：水相A:质量分数为0.3％的甲酸水溶液；有机相B:乙腈；且所述的水相A与有机相B的体积比为60:40；
c、洗脱方式：等度洗脱0.8mL·min-1～1.2mL·min-1；
d、检测波长：UV215nm；
e、柱温：30℃；
f、进样量：10μL。
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Effective date of registration: 20180125 Address after: 150000 Heilongjiang Province, Harbin City Economic Development Zone haping Road District Dalian road and Xingkai road junction Patentee after: Hagongda robot group (Harbin) Asset Management Co., Ltd. Address before: 510250 72 South Jinhui Road, Haizhuqu District Industrial Avenue, Guangdong, Guangzhou Patentee before: Harbin robotics group (Guangzhou) intellectual property Klc Holdings Ltd |
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Effective date of registration: 20181029 Address after: 414002 room 538, Yungang Road Customs Service building, Chenglingji new port, Yueyang, Hunan Patentee after: Hakda robotics group Yueyang Co., Ltd. Address before: 150000 Dalian Road North and Xingkai Road, Harbin, Heilongjiang province. Patentee before: Hagongda robot group (Harbin) Asset Management Co., Ltd. |
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Effective date of registration: 20190102 Address after: 414002 Fourth Floor, Building 2, Xindeng Incubation Building, Yungang Road Military-Civil Integration Industrial Park, Chenglingji New Port District, Yueyang City, Hunan Province Patentee after: Harbin University of Technology Robot (Yueyang) Research Institute Co., Ltd. Address before: 414002 room 538, Yungang Road Customs Service building, Chenglingji new port, Yueyang, Hunan Patentee before: Hakda robotics group Yueyang Co., Ltd. |