CN106526181A - 一种猪瘟病毒的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；绘制标准曲线，拟合标准曲线方程。本发明猪瘟病毒的快速检测方法避免了传统检测中复杂的样品前处理过程，使检测过程简单、快速且具有高的灵敏度，对保证我国食品中猪瘟病毒的有效检测和监控监管，具有十分重要意义。

Description

一种猪瘟病毒的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体是一种猪瘟病毒的快速检测方法。
背景技术
猪瘟病毒是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。猪瘟病毒在细胞质内复制,不能凝集红血球，与牛腹泻病毒有相关抗原。该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。利用RT-PCR检测病毒是一种非常灵敏的方法。通常RT-PCR灵敏度比cRNA探针的斑点杂交灵敏度高10-100倍（Nakaharaetal,1999）。RT-PCR对模板的纯度要求高，如果检测样品中存在扩增抑制物的话，将很难扩增出目的条带，尤其是果树类的材料，含有大量的多酚类和糖类等。糖类一般可以用乙二醇单甲醚来去除。PVP能有效束缚酚类化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去从组织中制备的RNA中的阻遏物（Koonjuletal,1999）。但是PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m～2000μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒。
作为本发明进一步的方案：其中所述样品小于400微升。
作为本发明进一步的方案：其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物。
作为本发明再进一步的方案：所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明猪瘟病毒的快速检测方法避免了传统检测中复杂的样品前处理过程，使检测过程简单、快速且具有高的灵敏度，对保证我国食品中猪瘟病毒的有效检测和监控监管，具有十分重要意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m～2000μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒；其中所述样品小于400微升；其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物；所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
实施例1：
本发明猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至6，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒；其中所述样品小于400微升；其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物；所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
实施例2：
本发明猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在2000μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒；其中所述样品小于400微升；其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物；所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
实施例3：
本发明猪瘟病毒的快速检测方法，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至7，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为1%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.3%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.5%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在1000μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒；其中所述样品小于400微升；其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物；所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种猪瘟病毒的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：配制检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m～2000μg·m之间不同梯度浓度的标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；使上述混合而成的样品与第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物反应，所述第一免疫检测反应物和第二免疫检测反应物被包含在药筒的免疫检测组件中，其中所述第一免疫检测反应物与血凝素分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第一免疫复合物，其中所述第二免疫检测反应物与神经氨酸酶分子结合在所述猪瘟病毒颗粒上形成第二免疫复合物，所述免疫复合物产生一种或多种可检测的信号，指示所述血凝素和神经氨酸酶在所述猪瘟病毒颗粒上同时存在，其中所述第一免疫检测反应物或所述第二免疫检测反应物被固定在固体支持物上；检测来自所述免疫复合物的所述一种或多种可检测的信号，其中所述血凝素和神经氨酸酶的同时存在指示存在所述猪瘟病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒的快速检测方法，其特征在于，其中所述样品小于400微升。
3.根据权利要求1所述的猪瘟病毒的快速检测方法，其特征在于，其中所述血凝素和神经氨酸酶与包含在所述免疫检测组件中的所述免疫检测反应物形成免疫复合物。
4.根据权利要求1所述的猪瘟病毒的快速检测方法，其特征在于，所述药筒包含至少一个样品收集单元、包含所述免疫检测反应物的免疫检测组件和与所述样品收集单元和/或所述检测组件流体连通的多个通道。
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